胶乳透射免疫比浊法
附件5
胱抑素C 测定试剂（胶乳透射免疫比浊法）注册技术审查指导原则
本指导原则旨在指导技术审评部门对胱抑素C 测定试剂（胶乳透射免疫比浊法）的技术审评工作，同时也为注册申请人注册申报资料的准备及撰写提供参考。
本指导原则是对胱抑素C 测定试剂（胶乳透射免疫比浊法）的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准体系的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
一、适用范围
胱抑素C 测定试剂（胶乳透射免疫比浊法）是指基于透射免疫比浊法原理，利用半自动生化分析仪、全自动生化分析仪对人血清、血浆中的胱抑素C 进行体外定量分析的试剂。
目前胱抑素C 含量的测定方法主要是基于抗原抗体反应的
免疫方法，如胶乳免疫比浊法、胶体金免疫比色法、单向免疫扩散法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法等，免疫比浊法可分为透射免疫比浊法和散射免疫比浊法。其中透射免疫比浊法可适用于半自动生化分析仪、全自动生化分析仪，散射免疫比浊法需特定蛋白分析仪。
从方法学上讲，本指导原则仅适用于胶乳透射免疫比浊法, 不适用于散射免疫比浊法。
依据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5 号）和《食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知》（食药监械管〔2013〕242 号），胱抑素C 测定试剂（免疫比浊法）管理类别为二类，分类代号为6840。
二、注册申报资料要求
（一）综述资料综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、方法学特征、生物安全性评价、研究结果总结以及同类产品上市情况介绍等内容，应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5 号）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014 年第44 号）的相关要求。相关描述应至少包含如下内容：
1. 产品预期用途及辅助诊断的临床适应证背景情况
（1）胱抑素 C 的生物学特征、结构与功能、在体内正常和病理状态下的代谢途径和存在形式。
胱抑素C（Cystatin C, CysC ）是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，也被称为Y—微量蛋白及—后球蛋白，广泛存在于各种组织的—— 2 —
有核细胞和体液中，是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质，分子量为13.3KD ，由122 个氨基酸残基组成，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循环血液中的Cys C 能自由透过肾小球，在近曲小管几乎全部被上皮细胞摄取并分解，尿中仅微量排出。Cys C 水平不受性别、年龄、饮食等因素的影响，是一种反映肾小球滤过率（GFR ）变化的理想内源性标志物。
当肾功能受损时，Cys C 在血液中的浓度随肾小球滤过率变化而变化。肾衰时，肾小球滤过率下降，Cys C 在血液中浓度可增加数倍甚至十数倍。
（2）与预期用途相关的临床适应证背景情况，如临床相关疾病的发生、实验室诊断方法等。
肾小球滤过率（GFR）的评估在肾功能的监测方面具有重要意义。
注：若注册申报产品声称临床意义超出此内容范围，应提供相关文献或临床研究依据。
CysC 分子量较小，其测定方法主要基于免疫反应原理。随着CysC 在临床上的应用，检测它的方法也越来越多，按照原理大体上可分为二类：一类是非均相法如单向免疫扩散法（RID）、放射免疫测定法（RIA ）、荧光免疫测定法（FIA ）、酶联免疫测定法（ELISA ）；另一类是均相法如颗粒计数免疫测定法，颗粒增强透射免疫比浊法（PETIA ），颗粒增强散射免疫比浊法
（PENIT ）。非均相法难于自动化，限制了CysC 的临床推广应用，胶乳免疫测定是一种均相测定方法，在胶乳颗粒上包被抗体，与抗原结合时颗粒发生凝集，此方法易于自动化，已被广泛应用于临床。
2. 产品描述
包括产品所采用的技术原理、主要原材料的来源、质量控制及制
备方法、主要生产工艺过程及关键控制点，质控品、校准品的制备方法及溯源情况。
3. 有关生物安全性方面的说明如果体外诊断试剂中的主要原材料采用各种动物、病原体、人源的组织和体液等生物材料经处理或添加某些物质制备而成，为保证产品在运输、使用过程中对使用者和环境的安全，研究者应提供上述原材料有关生物安全性的说明。
4. 有关产品主要研究结果的总结和评价
5. 参考文献
6. 其他
包括同类产品在国内外批准上市的情况，相关产品所采用的技术方法及临床应用情况，申请注册产品与国内外同类产品的异同等。
（二）主要原材料的研究资料（如需提供）主要原材料的选择、制备、质量标准及实验验证研究资料；质控品（如产品包含）、校准品（如产品包含）的原料选择、制备、定值过程及试验资料；校准品的溯源性文件，包括具体溯源链、实验方法、数据及统计分析等详细资料。
（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料（如需提供）产品的主要生产工艺可以用流程图表示，明确关键工序和特殊工序，并简单说明控制方法。确定反应温度、时间、缓冲体系等的研究资料、确定样本和试剂（盒）组分加样量的研究资料。不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。
—— 4 —
（四）分析性能评估资料申请人应提交产品研制阶段对三批试剂进行的所有性能验证的研究资料，对于每项分析性能的评价都应包括具体研究目的、实验设计、研究方法、实验数据、统计方法、可接受标准、研究结论等详细资料。性能评估时应将试剂和所选用的校准品、质控品作为一个整体进行评价，评估整个系统的性能是否符合要求。有关分析性
能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点、适用仪器、试剂规格和批号、所选用的校准品和质控品、临床样本来源等。
性能评估应至少包括空白吸光度、分析灵敏度、精密度、准确度、线性、分析特异性（抗干扰能力）等。
1. 试剂空白吸光度
用生理盐水作为样本重复测定2 次，记录试剂参数规定读数点主波长下的吸光度值（A ），结果均值应符合产品技术要求性能指标的要求。
2. 分析灵敏度
测定已知浓度在（1.00±0.10）mg/L 的样本，记录试剂规定参数的吸光度差值。换算为1.00mg/L 的胱抑素C 的吸光度差值，结果应符合产品技术要求性能指标的要求。
3. 准确度
建议按如下优先顺序，同时结合申请人实际情况，采用如下方法之一对试剂准确度进行评价。
（1）相对偏差
根据生产企业提供的试剂线性区间，将可用于评价常规方法的参考物质作为样本，按照待测试剂说明书的步骤进行检测，每
个样品重复测定 3 次，测试结果记为( Mi )，按公式( 1)分别计算相对偏差( Bi )，如果3 次结果都符合产品技术要求性能指标的要求，即判为合格。如果大于等于2 次的结果不符合，即判为不合格。如果有2 次结果符合，1 次结果不符合要求，则应重新连续测试20 次，并分别按照公式( 1)计算相对偏差，如果大于等于19 次测试的结果符合产品技术要求性能指标的要求，即判为合格，准确度符合产品技术要求性能指标的要求。
Bi= ( Mi-T ) /T X100% (1)
式中：
Bi —相对偏差；
Mi —测量浓度；
T —参考物质标示值。
( 2)回收试验在人源样品中加入一定体积由具有溯源性的参考物质配制的标准溶液(标准溶液体积与人源性样品体积比应不会产生基质的变化，加入标准溶液后样品总浓度必须在试剂检测线性区间内)或纯品，每个浓度重复检测3 次，按公式( 2 )计算回收率，结果应符合产品技术要求性能指标的要求。
R=[C X(V o+V) - C oWo) ] / (V XC s)X1OO% (2)
式中：
R —回收率；
V —加入标准溶液的体积；
V o —人源样品的体积；
C —人源样品加入标准溶液后的检测浓度；
C o —人源样品的检测浓度；
C s —标准溶液的浓度。
—— 6 —
（3）方法学比对
参照EP9—A2的方法，用不少于40个在检测浓度范围内不同浓度的人源样品，以生产企业指定的已上市分析系统作为比对方法，每份样品按待测试剂操作方法及比对方法分别检测。用线性回归方法计算两组结果的相关系数（r）及医学参考水平的相
对偏差，结果应符合产品技术要求性能指标的要求。
在实施方法学比对前，确认两者都分别符合各自相关的质量标准或技术要求后方可进行比对试验。方法学比对时应注意质量
控制、样本类型、浓度分布范围并对结果进行合理的统计学分析。
4. 精密度
测量精密度的评估方法包括重复性和批间差试验，应至少包括两个浓度水平的样本，其中一个样本浓度应在（ 1.00 ±0.10）mg/L样本范围内，另一个样本应为异常高值样本。
（1）重复性
在重复性条件下，对不同浓度的样品分别重复测定10次，计算10次测定结果的平均值（X）和标准差（SD），根据公式
（3）得出变异系数（CV ），结果均应符合产品技术要求性能指标的要求。
CV=SD/ X X100% （3）
式中：
CV —变异系数；
SD —10次测量结果的标准差；
X—10次测量结果的平均值。
（2）批间差
分别用三个不同批号试剂，对不同浓度的样品，分别重复测
(4) (5)
(6)
定3次，计算每个浓度样本每批号 3次测量结果的平均值（X i , i=1、2、3）,根据公式（4）、公式（5）计算批间相对极差（R ）, 结果均应符合产品技术要求相应性能指标的要
求。
X i X 2 X 3
X T = 3 R= （ X max - X min ） Z ^OO%
式中：
R —批间相对极差；
X max — X i 的最大值，i=1、2、3； X min — X i
的最小值，i=1、2、3；
X T —三批测量结果的总平均值。
5. 线性
取接近测定范围上限的高值（ H ）和接近下限的低值（L ） 样本各一份，混合成至少 6个稀释浓度的样本（xj ,充分混匀， 防止蒸发或其他改变。用试剂（盒）分别测试各稀释浓度 3次， 然后分别计算每个稀释浓度检测结果的均值（ y i ）,以X i 为自变 量，以y i 为因变量求出线性回归方程，按公式（ 6）计算线性回 归的相关系数（r ）；同时将X i 代入线性回归方程， 计算y i 的估计 值（y ie ），根据公式（7）和（8）计算线性绝对偏差或相对偏差
（R i ），结果均应符合产品技术要求性能指标的要求。
' [(x i - x)(y i - y)]
/ % - x )2' (y i - y)2 绝对偏差=检测结果均值（yj -估计值（y ie ）
（7）
R厂y i -y ie 100%
y ie
建立试剂线性所用的样本基质应尽可能与临床实际检测的样本相似，且应充分考虑多倍稀释对样本基质的影响。
6. 分析特异性
（1）交叉反应：易产生交叉反应的其他抗原、抗体及嗜异性抗体等的验证情况。
（2）干扰物质：可采用回收试验对样本中常见干扰物质对检测结果的影响，如溶血、高脂、黄疸、类风湿因子、抗凝剂等干扰因子的研究，干扰物浓度的分布应覆盖人体生理及病理状态下可能出现的物质浓度，结果应量化表示，禁用轻度、严重的模糊表述。
（3 ）药物干扰的研究可根据需要由申请人选择是否进行或选择何种药物及其浓度进行。
7. 其他需注意问题
（1）申请人可建立自己的企业参考品，参考品来源应稳定，并明确建立过程。
（2）如注册申请中包括不同适用机型，需要提交在不同机型上进行上述项目评估的试验资料及总结。
如注册申请中包含不同的包装规格，需要对不同包装规格之间的差异进行分析或验证。如不同的包装规格产品间存在性能差异，需要提交采用每个包装规格产品进行的上述项目评估的试验资料及总结。如不同包装规格之间不存在性能差异，需要提交包装规格之间不存在性能差异的详细说明，具体说明不同包装规格之间的差别及可能产生的影响。
分析性能评估报告应明确所用仪器设备型号、校准品、质控品
等的产品名称、生产企业名称、生产批号等信息。
（3）校准品溯源及质控品定值校准品、质控品应提供详细的量值溯源资料。应参照GB/T 21415—2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》的要求，提供企业（工作）校准品及试剂配套校准品定值及不确定度计算记录。提供质控品在所有适用机型上进行的定值资料。
（4）不同样本类型研究如产品声称的样本类型包括血清和血浆样本，则应对二者进行相关性研究以确认二者检测结果是否完全一致或存在某种相关性（如系数关系）。对于血浆样本，申请人应对不同的抗凝剂进行研究以确认最适的抗凝条件以及是否会干扰检测结果。
（五）参考区间确定资料
应明确研究采用的样本来源、详细的试验资料、统计方法等，参考值范围可参考文献资料，但应当明确说明出处，并进行转移验证。验证样本数量应不低于120 例。建议参考CLSI/NCCLS C28-A2 。
（六）稳定性研究资料稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者通常包括实时稳定性（有效期）、开瓶稳定性、复溶稳定性（如有）、运输稳定性等。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论，对于实时稳定性研究，应提供至少 3 批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的性能检测研究资料。
试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。——10 —
（七）临床评价资料临床评价资料应符合《关于发布体外诊断试剂临床试验技术指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014 年第16 号）要求，同时资料的形式应符合《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014 年第44 号）临床评价资料有关的规定。
根据《关于发布第三批免于进行临床试验医疗器械目录的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2017 年第170 号），胱抑素C 测定试剂可免于进行临床试验，申请人可依照《总局关于发布免于进行临床试验的体外诊断试剂临床评价资料基本要求（试行）的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2017 年第179 号）开展评价。申请人如无法按要求对“目录”中产品进行临床评价，应进行临床试验。
下面仅对临床试验中的基本问题进行阐述。
1. 研究方法选择境内已批准上市的性能相近的同类产品作为对比试剂，采用拟申报产品与之进行对比试验研究，证明本品与已上市产品等效。
2. 临床试验机构的选择
至少应当选定不少于2 家（含2 家）临床试验机构，临床试验机构实验操作人员应有足够的时间熟悉检测系统的各环节（试剂、质控及操作程序等），熟悉评价方案。在整个实验中，评价试剂和对比试剂都应处于有效的质量控制下，最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。
3. 临床试验方案
临床试验实施前，研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑，设计科学合理的临床研究方案。各临床研究机构的方案设置应保持一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。
试验方案中应确定严格的病例纳入/排除标准，任何已经入选的病例再被排除出临床研究都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程中和判定试验结果时，应采用盲法以保证试验结果的客观性。各研究单位选用的对比试剂及所用机型应保持一致，以便进行合理的统计学分析。
试验方案中还应明确两种试剂检测结果不一致的判定依据，以及结果不一致样本复核的方法。
4. 研究对象选择申请人或临床研究者应根据产品临床预期用途以及与该产品相关疾病的临床发生率确定临床试验的样本量和样本分布，在符合指导原则有关最低样本量要求的前提下，还应符合统计学要求。各临床试验机构样本量和样本分布应相对均衡。总体样本数不少于200 例，建议异常值样本数不少于总体样本数的30%。
应明确样本类型、存贮条件、可否冻融等要求及避免使用的样本，血浆样本应明确抗凝剂的要求。
样本中待测物浓度应能覆盖评价试剂声称的线性范围，且尽可能均匀分布。
——12 —
如果评价试剂同时适用于血清或血浆样本类型，可完成一个样本类型（血清或血浆）不少于200 例的临床研究，同时可选至少100 例血清或血浆同源样本进行比对研究。
5. 统计学分析对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法，如相关分析、线性回归、等效性检验、Bland-Altman 法、偏差分析等。对于对比实验的等效性研究，建议统计学负责人结合临床试验数据的正/ 偏态分布情况，选择合理的统计学方法进行分析，统计分析应可以证明两种方法检测结果的差异无统计学意义。在临床研究方案中应明确评价试剂与对比试剂是否等效的标准。相关及线性回归分析，应重点观察相关系数（「值）或决定系数（R2）、回归拟合方程（斜率和y 轴截距）等指标。
6. 临床试验总结报告撰写根据《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告2014 年第16 号）的要求，临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的基础数据和统计分析方法。建议在临床总结报告中对以下内容进行详述。
6.1 临床试验总体设计及方案描述
6.1.1 临床试验的整体管理情况、临床试验机构选择、临床主要研究人员简介等基本情况介绍。
6.1.2 纳入/排除标准、不同人群的预期选择例数及标准。
6.1.3 样本类型，样本的收集、处理及保存等。
6.1.4 统计学方法、统计软件、评价统计结果的标准。
6.2 具体的临床试验情况
6.2.1 评价试剂和对比试剂的名称、批号、有效期及所用机型等信息。
6.2.2 质量控制，试验人员培训、仪器日常维护、仪器校准、质控品运行情况，对检测精密度、准确度抽查结果评估。
6.2.3 具体试验过程，样本检测、数据收集、样本长期保存等。
6.3 统计学分析
6.3.1 数据预处理、对异常值或离群值的处理、研究过程中是否涉及对方案的修改。
6.3.2 定量值相关性和一致性分析
用回归分析验证两种试剂结果的相关性，以y?=a+bx 和R2
的形式给出回归分析的拟合方程，其中：y? 是评价试剂结果，x 是对比试剂结果，b 是方程斜率，a 是y 轴截距，R2是决定系数（通常免疫项目要求R2初.95）,同时应给出b的95%置信区间。
建议给出评价试剂与对比试剂之间的差值（绝对偏倚/偏差）及比值（相对偏倚/偏差）散点图并作出95%置信区间分析。
6.4 讨论和结论对总体结果进行总结性描述并简要分析试验结果，对本次临床研究有无特别说明，最后得出临床试验结论。
（八）生产及自检记录提供连续三批产品生产及自检记录的复印件。
（九）产品风险分析资料对体外诊断试剂产品寿命周期的各个环节，从预期用途、可——14 —
能的使用错误、与安全性有关的特征、已知和可预见的危害等方面的判定以及对患者风险的估计进行风险分析、风险评价和相应的风险控
制基础上，形成风险管理报告。应当符合相关行业标准YY/T 0316 —2016《医疗器械风险管理对医疗器械的应用》的要求。
（十）产品技术要求产品技术要求应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5 号）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014 年第44 号）以及《关于发布医疗器械产品技术要求编写指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014 年第9 号）的相关规定。该产品目前已有相应的行业标准发布，企业产品技术要求应至少不低于上述标准要求。如产品含有配套校准品或质控品，还应包含对校准品或质控品的相关要求。
产品技术要求应包含产品名称、产品型号/规格及其划分说
明、性能指标、检验方法和产品技术要求编号。产品名称、产品型号/ 规格及其划分说明和性能指标的内容应与其他注册资料中的相应内容保持一致。检验方法应优先考虑采用公认的或已颁布的标准检验方法，对于尚无公认的或已颁布的标准检验方法，需与产品性能研究资料的内容一致，并保证该方法具有可重现性和可操作性。
性能研究及产品技术要求研究适用的国家标准和行业标准清单见表1。
—15 ——
表1相关产品标准
注：上述标准未标注年代号，申请人应参照最新版本；如有其他新的适用国家标准和行业标准，应参照。
（十一）产品注册检验报告
首次申请注册的胱抑素C测定试剂应该在具有相应医疗器械检验资质和承检范围的医疗器械检测机构进行产品的注册检验。
（十二）产品说明书
说明书承载了产品预期用途、试验方法、检测结果解释以及
注意事项等重要信息，是指导使用人员正确操作、临床医生准确理解和合理应用试验结果的重要技术性文件。产品说明书的格式
应符合《关于发布体外诊断试剂说明书编写指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014 第17号）的要求。下面对胱抑
素 C 测定试剂说明书的重点内容进行详细说明。
1. 【产品名称】
（1）试剂名称试剂名称由三部分组成：被测物名称、用途、方法或原理。例如：胱抑素 C 测定试剂（免疫比浊法）。
（2）英文名称（如有）应当正确、完整，不宜只写缩写。
2. 【包装规格】
（1）包装规格应明确装量（如XX mL ；XX人份）。
（2）与产品技术要求中所列的包装规格一致。
3. 【预期用途】应至少包括以下几部分内容：
（1 ）说明试剂用于检测人体血清或/ 和血浆样本中胱抑素C 的含量。
（2）胱抑素 C 含量异常情况常见于哪些疾病，其升高或降低可能有哪些医学解释。
作为支持性资料，申请人应提供由临床循证研究、教科书、临床专著、核心期刊文献或英文SCI 文献等有关临床适应证背景的资料。
4. 【检验原理】应结合产品主要成分简要说明检验的原理、方法，必要时可采取图示方法表示。
例如：利用抗原抗体反应，人血清或血浆中胱抑素C 与其相应抗体致敏的胶乳颗粒在液相中相遇发生免疫反应，产生凝
集，引起浊度上升。通过测定特定波长吸光度变化值，与同样处理的校准品比较，即可计算出样本中胱抑素 C 的浓度。
5. 【主要组成成分】
（1）对于产品中不包含，但对该试验必需的试剂组分，说明书中应列出此类试剂的名称、医疗器械注册证号或备案证号、纯度，提供稀释或混合方法及其他相关信息。
（2）对于校准品（若配有）：注明校准品的定值及其溯源性，溯源性资料应写明溯源的最高级别（应包括标准物质或参考物质的发布单位及编号）。
6. 【储存条件及有效期】
（1）对试剂的效期稳定性、复溶稳定性（如有）、开瓶稳定性等信息作详细介绍。包括环境温湿度、避光条件等。
（2）不同组分保存条件及有效期不同时，应分别说明，产品总有效期以其中效期最短的为准。
注：保存条件不应有模糊表述，如“常温” 、“室温。”
7. 【适用仪器】
（1）说明可适用的仪器，应写明具体适用仪器的型号，不能泛指某一系列仪器，并且与分析性能评估资料一致。
（2）如不同包装规格有与之特定对应的机型，应同时明确适用机型。
8. 【样本要求】重点明确以下内容：样本类型、处理、保存期限及保存条件（短期、长期）和运输条件等。可否采用肝素抗凝血浆、柠檬酸钠抗凝血浆、EDTA ——18 —
抗凝血浆。以上描述皆应与研究资料一致
胶乳增强免疫比浊反应原理
胶乳增强免疫比浊反应原理： 免疫比浊反应原理： 当样本中的待测抗原与试剂中的特异性多克隆抗体相遇后，即可发生特异性的结合反应（一个抗原具有多个不同的抗原决定簇（反应位点），可以连接多个不同的对应位点抗体；而抗体具有两个相同的抗原结合位点，可以同时结合两个待测抗原；），从而形成网状的抗原-抗体分子复合物，引起溶液中浊度的变化，通过测试溶液中透射或散射的吸光度变化，从而确定样本中待测抗原的浓度； 胶乳增强免疫反应比浊原理： 基于免疫反应原理，和纳米颗粒的特殊效应（表面效应、量子尺寸效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应），不只可以检测样本中的完全抗原，也可以检测样本中的半抗原、抗体，从而引起浊度变化，此时浊度与空白样本的不同作为待测物浓度的检测依据。 免疫透射比浊法 原理： 可溶性抗原与相应抗体反应后形成的免疫复物，使介质浊度发生改变，光线通过抗原抗体反应后的溶液时，被其中的免疫复合物微粒吸收，在保持抗体过量的情况下，吸光度（A 值）与免疫复合物量呈正相关。透射光强度和形成的免疫复合物呈反比。 优点：透射比浊法灵敏度比单扩高5-10倍，重复性好，结果准确，操作简便，且能用全自动或半全自动生化分析仪进行检测。 不足： ①抗体用量较大； ②溶液中存在的抗原-抗体复合物分子应足够大（35-100nm)，分子太小则阻挡不了光线的通过；数量要足够多，如果数量太少，则溶液浊度变化太小，对光通量影响不大。灵敏度较散射比浊法低； ③透射比浊测定在抗原-抗体反应的第二阶段，需在抗原抗体反应达到平衡后进行检测，耗时较长。 胶乳增强免疫比浊法 在一般的透射比浊法中，少量小分子免疫复合物极难形成浊度，要形成较大的免疫复合物，参与反应的抗原、抗体量应较大（浓度高），这无法满足高灵敏度检测项目的要求。胶乳增
体外诊断试剂胶乳比浊法学习
胶乳免疫比浊法相关知识 很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目，关注胶乳标记技术的技术人员越来越多。本人总结了部分胶乳微球标记技术，并加以分类，以便朋友们查阅： 胶乳微球物理吸附： 反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团，pka大约为2，因此在酸性pH保持稳定。醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在以上时保持稳定。 带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法。这种方法中，微球溶液和含目标蛋白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物。疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球）。醛基表面修饰微球是一个特例，其疏水吸附结果取决于后来的共价结合。虽然物理吸附是不依赖pH的，但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的影响，从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率。一般，在被吸附蛋白等电点附近pH时，物理吸附效率会很高。 反应步骤： 1. 用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml； 2. 用反应缓冲液系数胶乳微球到1%； 3. 将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中，10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液。室温搅拌孵育2hr； 4. 离心或超滤，除去未结合蛋白； 5. 将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解。 注意事项： 1. 最优蛋白标记量影响因素 1）有效比表面积：粒径减小时，比表面积/mg微球值得增加； 2）胶体稳定性：蛋白对胶乳有稳定和去稳定作用； 3）免疫反应：最近标记量由免疫反应需要决定。 2. 胶乳微球中加入蛋白后，快速搅拌混合，利于反应均衡。反应体积是1ml时，可用移液器吸取蛋白加入微球中，并吹打数次。如果反应体积较大时，用烧杯，边搅拌边加入蛋白， 3. 储存缓冲液和反应缓冲液不同时，抗体有脱落的可能； 4. 表面活性剂能使得抗体从胶乳中脱落，所以应避免加入。 微球共价结合抗体方法： 一、一步法 1. 准备50mM pH 的reaction buffer，醋酸或MES buffer更合适 2. 用reaction buffer溶解抗体，使其浓度为1mg/mL。 3. 用reaction buffer 悬浮微球，使其浓度为1% w/v 4. 边搅拌边将一倍体积的抗体溶液加入到10倍体积的微球悬液中，室温下持续搅拌20分钟 5. 准备浓度为10mg/ml（52umol/mL）的EDC溶液，用前准备，现配现用。 6. 将计算需求量的EDC溶液加入到上述微球悬液中。(Note 6). 7. 室温下，立即调节pH (Note 7). 8. 移除未结合的蛋白，并将包被微球用storage buffer重悬。(Note 3 and 4) B. 两步法 为了避免EDC将相邻微球之间的蛋白偶联导致微球聚集或者蛋白之间交流，两步法偶联抗体更合适。两步法中，在蛋白加入之前，多余的EDC被移除。两步法中，蛋白也可以使用更高pH的buffer来溶解，从蛋白的稳定性方面和加速蛋白和活化微球之间的交联速度方便考虑，是非常有利的。
胶乳透射免疫比浊法
附件5 胱抑素C 测定试剂（胶乳透射免疫比浊法）注册技术审查指导原则 本指导原则旨在指导技术审评部门对胱抑素C 测定试剂（胶乳透射免疫比浊法）的技术审评工作，同时也为注册申请人注册申报资料的准备及撰写提供参考。 本指导原则是对胱抑素C 测定试剂（胶乳透射免疫比浊法）的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准体系的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、适用范围 胱抑素C 测定试剂（胶乳透射免疫比浊法）是指基于透射免疫比浊法原理，利用半自动生化分析仪、全自动生化分析仪对人血清、血浆中的胱抑素C 进行体外定量分析的试剂。 目前胱抑素C 含量的测定方法主要是基于抗原抗体反应的
免疫方法，如胶乳免疫比浊法、胶体金免疫比色法、单向免疫扩散法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法等，免疫比浊法可分为透射免疫比浊法和散射免疫比浊法。其中透射免疫比浊法可适用于半自动生化分析仪、全自动生化分析仪，散射免疫比浊法需特定蛋白分析仪。 从方法学上讲，本指导原则仅适用于胶乳透射免疫比浊法, 不适用于散射免疫比浊法。 依据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5 号）和《食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知》（食药监械管〔2013〕242 号），胱抑素C 测定试剂（免疫比浊法）管理类别为二类，分类代号为6840。 二、注册申报资料要求 （一）综述资料综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、方法学特征、生物安全性评价、研究结果总结以及同类产品上市情况介绍等内容，应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5 号）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014 年第44 号）的相关要求。相关描述应至少包含如下内容： 1. 产品预期用途及辅助诊断的临床适应证背景情况 （1）胱抑素 C 的生物学特征、结构与功能、在体内正常和病理状态下的代谢途径和存在形式。 胱抑素C（Cystatin C, CysC ）是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，也被称为Y—微量蛋白及—后球蛋白，广泛存在于各种组织的—— 2 —
心肌酶胶乳免疫比浊法与化学发光法区别
心肌酶胶乳免疫比浊法与化学发光法是两种常用的心肌酶检测方法， 它们在临床诊断和疾病监测中扮演着重要的角色。本文将分别从原理、优缺点、应用范围等方面对这两种方法进行比较，旨在帮助读者更好 地理解它们之间的区别。 一、原理 1.心肌酶胶乳免疫比浊法 心肌酶胶乳免疫比浊法，简称比浊法，是一种通过观察免疫反应产生 的胶乳复合物在溶液中形成的浊度变化来检测心肌酶活性的方法。该 方法主要依赖于心肌酶与抗体结合后形成可见的胶乳颗粒。 2.化学发光法 化学发光法是利用顺式/异构酶的化学发光底物，在酶的作用下产生的化学发光信号来检测心肌酶活性的方法。该方法的原理是通过测定化 学发光物质的发光强度来定量检测心肌酶。 二、优缺点 1.心肌酶胶乳免疫比浊法 （1）优点：操作简单、成本较低、对仪器要求不高、可靠性高，适用于一般临床检测。 （2）缺点：受样本浑浊度和脂质干扰较大，不适用于脂质较高样本测
定。 2.化学发光法 （1）优点：敏感度高、准确性好、对样本干扰小，适用于各种样本类型的心肌酶检测。 （2）缺点：设备和试剂成本较高、操作复杂、对环境条件要求高，适用性稍受限制。 三、应用范围 1.心肌酶胶乳免疫比浊法 心肌酶胶乳免疫比浊法适用于一般临床心肌酶检测，如急性心肌梗死、心肌炎等疾病的诊断和疗效监测。 2.化学发光法 化学发光法适用于对心肌酶活性要求较高的临床检测，尤其是一些特 殊样本类型或对准确度要求较高的疾病监测。 心肌酶胶乳免疫比浊法与化学发光法各有其特点和适用范围，医务人 员可以根据具体的临床需求选择合适的检测方法，以确保诊断和治疗 工作的顺利进行。心肌酶是一种重要的生物标志物，在心肌细胞损伤 后会释放到血液中。对心肌酶活性的检测能够有效地帮助医务人员诊 断心肌梗死、心肌炎等疾病，并且监测治疗效果。心肌酶胶乳免疫比
免疫胶乳比浊法与分光光度法
免疫胶乳比浊法与分光光度法 第一部分：引言 免疫胶乳比浊法与分光光度法是生物化学领域中常用的两种实验方法，用于测定抗原与抗体的结合反应。本文将通过深度和广度的方式，对 这两种方法进行全面评估，探讨它们的原理、优缺点及在实验中的应用。 第二部分：免疫胶乳比浊法的原理与应用 1. 免疫胶乳比浊法是一种常用的生物化学分析方法，利用抗体特异性 结合抗原后形成胶乳凝集沉淀，通过光学测定凝集度来确定抗原或抗 体的含量。 2. 该方法具有操作简单、结果稳定可靠的优点，广泛应用于临床诊断、生物制药等领域。 3. 但是，免疫胶乳比浊法也存在着检测范围窄、灵敏度不高等缺点， 需要在实际应用中慎重选择。 第三部分：分光光度法的原理与应用
1. 分光光度法是利用物质对特定波长的光吸收或透过特性进行定量分析的方法，适用于测定浓度较低的样品。 2. 该方法具有高灵敏度、分辨率高的优点，广泛应用于生化实验、药物检测等领域。 3. 但是，分光光度法在样品处理、稀释等方面需要严格控制，且需要专业的设备和操作技能。 第四部分：免疫胶乳比浊法与分光光度法的比较 1. 免疫胶乳比浊法和分光光度法各有其适用的范围和优势，需要根据具体实验要求进行选择。 2. 在实验设计中，我们应该充分考虑到样品性质、检测目的、操作条件等因素，选择最合适的方法进行分析。 3. 两种方法的综合应用可以弥补彼此的不足，提高实验的准确性和可靠性。 第五部分：个人观点与总结
对我来说，免疫胶乳比浊法和分光光度法是两种非常重要的生化实验 方法，它们在科研和临床诊断中都发挥着重要作用。通过不断学习和 实践，我逐渐深入理解了这两种方法的原理和应用，也体会到了它们 的优势和局限性。在未来的实验中，我将更加灵活地根据具体情况选 择合适的方法，以保证实验结果的准确性和可靠性。 结语：通过对免疫胶乳比浊法和分光光度法的全面评估和比较，相信 读者们对这两种方法有了更深入的了解。在实验过程中，选择合适的 方法对于研究的顺利进行至关重要，希望本文能为大家在科研和实验 中提供一些帮助和启发。免疫胶乳比浊法与分光光度法是生物化学领 域的两种常用实验方法，它们在测定抗原与抗体结合反应中发挥着重 要作用。接下来，我们将进一步深入探讨这两种方法的具体原理、优 缺点及在实验中的应用。 免疫胶乳比浊法利用抗体特异性结合抗原后形成胶乳凝集沉淀，通过 光学测定凝集度来确定抗原或抗体的含量。这种方法操作简单，结果 稳定可靠，广泛应用于临床诊断、生物制药等领域。然而，免疫胶乳 比浊法检测范围窄，灵敏度不高，需要在实际应用中慎重选择。相比 之下，分光光度法是利用物质对特定波长的光吸收或透过特性进行定 量分析的方法，适用于测定浓度较低的样品。该方法具有高灵敏度、 分辨率高的优点，广泛应用于生化实验、药物检测等领域。然而，在 样品处理、稀释等方面需要严格控制，且需要专业的设备和操作技能。
胶乳免疫比浊法
胶乳免疫比浊法 胶乳免疫比浊法（immunoelectrophoresis,IPE）是一种用于测 定机体内抗原、抗体和其他物质浓度的快速、准确的分析技术，它被广泛应用于临床医疗、疾病研究、环境检测、食品安全等领域。 这种免疫比浊法是由美国科学家史蒂夫布赖斯特（Steve Briese）于1959年发明的，它利用了免疫学联合电泳来检测和定量抗体和抗原。该方法主要由以下几步组成：1）抗体样本和抗原样本混合，使 双方发生交联反应；2）将反应液置于一特定的电泳板上，使用电流 将未发生免疫反应的抗原和抗体分别迁移到不同的比浊带内；3）用 后胶乳法对免疫比浊带进行处理，使抗体和抗原相应的结合；4）在363nm波长下记录比浊带的位置，以测定抗体的浓度。 由于胶乳免疫比浊法抗体定量分析的准确性、灵敏性和特异性比其他检测方法要强，因此，该方法已经被广泛用于定量检测机体内抗体类分子与抗原之间的相互作用。 在临床医疗中，胶乳免疫比浊法常用于检测抗球蛋白（IgG）、抗体调节蛋白（IgA）、抗体结合蛋白（IgM）、抗原抗体复合物等，也可以用于检测肿瘤标志物和糖皮质激素（ACTH）等激素。此外，这种技术还被用于研究疾病的免疫学机制，检测血清中的抗原和抗体，以及免疫诊断某些疾病。 此外，由于胶乳免疫比浊法可以快速、准确的检测抗体，因此也被广泛用于食品安全检测中。例如，它可以用来检测食品中的抗生素残留、致敏物质、化学污染物等，以保证食品安全。
通过胶乳免疫比浊法可以快速准确地测量抗原和抗体的浓度，该方法在临床医学、疾病研究、环境检测和食品安全等领域具有重要的应用价值。然而，胶乳免疫比浊法也存在一些不足，例如，由于测量物质的相互作用太多，检测结果容易受干扰。此外，某些抗体、抗原和其他物质在复杂体系中可能会发生复合反应，从而使得结果不准确。 因此，在使用胶乳免疫比浊法检测抗原、抗体和其他物质浓度时，应该结合其他技术，如免疫荧光定量技术、免疫酶联技术等，进行多种检测，以提高结果的准确性和可靠性。 总的来说，胶乳免疫比浊法是一种强大的分析技术，它具有准确性、灵敏性、特异性和快速性，应用于临床研究、环境检测和食品安全领域有着重要的意义。
脂蛋白(a)测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)产品技术要求senmeixikema
脂蛋白(a)测定试剂盒(胶乳免疫比浊法) 组成： 试剂1(R1)主要成分：Tris缓冲液(pH 6.0～9.0)4.6mmol/L、聚乙二醇6000 1.2g/L；试剂2(R2)主要成分：抗Lp(a)单克隆抗体致敏胶乳适量、叠氮钠 1g/L、聚乙二醇6000 1g/L。 适用范围：用于体外定量检测人血清中脂蛋白a的浓度。 1.1规格 a) 试剂1：2×40ml，试剂2：2×10ml； b) 试剂1：2×80ml，试剂2：2×20ml； c) 试剂1：4×60ml，试剂2：4×15ml； d) 试剂1：2×60ml，试剂2：2×15ml； e) 试剂1：2×72ml，试剂2：2×18ml； f) 试剂1：4×31ml，试剂2：1×20ml； g) 试剂1：12×16ml，试剂2：12×4ml； h) 试剂1：2×400ml，试剂2：2×100ml； i) 试剂1：8×60ml，试剂2：2×60ml； j) 试剂1：1×20ml，试剂2：1×5ml； k) 试剂1：6×16ml，试剂2：6×4ml； l) 试剂1：4×40ml，试剂2：4×10ml； m) 试剂1：1×40ml，试剂2：1×10ml。 1.2 组成 试剂主要组分见表1： 表1 试剂主要组分
2.1 外观 外包装完整无破损，标签清晰；试剂1应为无色透明溶液；试剂2应为乳白色溶液。 2.2 净含量 应不低于试剂瓶标示装量。 2.3 试剂空白 在600nm处测定试剂空白吸光度，应≤0.90。 2.4 分析灵敏度 测定浓度为800mg/L的样品，吸光度变化(ΔA)应不低于0.05。 2.5 线性 2.5.1在[10，1000]mg/L范围内，线性回归的相关系数应不低于0.990； 2.5.2测试浓度[150，1000]mg/L的样品，相对偏差应不超过±15%；测试浓度[10，150)mg/L的样品，绝对偏差应不超过±22.5mg/L。 2.6 重复性 2.6.1 批内重复性 变异系数(CV)应不超过5%。 2.6.2 批间差 对同一份样品进行重复测定，相对极差(R)应不超过10%。 2.7 准确度 与上海捷门生物技术合作公司的脂蛋白a试剂盒(胶乳增强免疫透射比浊法)进行对比试验，相关系数r应不低于0.975；测试浓度[150，1000]mg/L的样品，相对偏差应不超过±15%；测试浓度[10，150)mg/L的样品，绝对偏差应不超过±22.5mg/L。 2.8 空白限 试剂空白限为10mg/L。 2.9 稳定性 原包装试剂在2℃～8℃条件下有效期为18个月，取到效期后6个月内的试剂盒检测，应符合本技术要求2.1、2.3、2.4、2.5、2.6.1、2.7、2.8之规定。
胶乳增强透射比浊法检验Mb及临床意义
胶乳增强透射比浊法检验Mb及临床意义 摘要】血清肌红蛋白(Mb)存在于心肌与其他肌肉组织中，其分子量为17 500， 血清肌红蛋白是急性心肌梗死(AMI)患者升高的最早、标志物之一。血清肌红蛋白 测定方法有很多，由于分光光度法、电泳法及层析法不能测定低于微克水平的Mb，现已不使用。免疫化学法较灵敏，但抗血清必须是对Mb特异的。放射免疫 试验灵敏度高，对流免疫电泳是一种定性方法，且灵敏度较低，不适宜检测心肌 梗死。乳胶凝集试验是个半定量试验，是用肉眼判断终点，具有一定的主观性， 而且一些含有高浓度类风湿因子的血清会产生干扰。放射免疫试验灵敏度高，特 异性强，但使用放射性核素，现已少用。胶乳增强透射比浊法灵敏度高，特异性好，测定速度快，适用于各型生化自动分析仪，现已在临床上普遍采用。我们测 定了30例AMI患者在3～6小时、12小时、24小时和48小时的Mb水平，观察 血清肌红蛋白在急性心肌梗塞)时升高的时间特点及不同部位心肌梗塞之间水平的 差异，结论表明：对于那些发病早、临床症状和心电图不典型的AMI患者应尽早检测Mb,以免贻误治疗时机。同时， Mb也可作为评估AMI预后和判定梗塞面积 的一个良好指标。 【关键词】血清肌红蛋白检验临床应用 1 临床资料 测定了30例AMI患者在3～6小时、12小时、24小时和48小时的Mb水平，结果提示血清Mb在AMI患者发病3～6小时即明显升高，阳性率已达80%；12 小时水平最高，阳性率已达100%。在四种不同部位梗塞患者中，以急性前壁梗 塞患者血清Mb水平最高、持续时间最长，病死率最高；其次为非Q波型梗塞 患者。 2 原理 Mb致敏胶乳颗粒是大小均一的聚苯丙烯乳胶颗粒悬液，颗粒表面包 被有兔抗人Mb抗体。样本中的Mb与胶乳颗粒表面的抗体结合后，使相邻的胶 乳颗粒彼此交联，发生凝集反应产生浊度。该浊度与样本中的Mb浓度呈正比， 在570 nm处测定吸光度，可计算样本中Mb的浓度。 3 方法 3.1试剂I甘氨酸缓冲液(pH 9.0)，NaN31．0 g／L。试剂致敏胶乳悬液，兔抗 人Mb IgG致敏胶乳颗粒，NaN3、1．0 g／L。 Mb校准品。（试剂应避光，于 2～8℃可保存12个月，-20可保存更长时间，但不宜反复冻融。） 3.2测定条件温度： 37℃。波长： 570 nm。比色杯光径： 1．0 cm。反应 时间： 5分钟。 3.3计算△A=A2-A1采用非线性多点定标模式，以不同浓度标准品的△A，绘 制校正曲线，测定管△A从校正曲线上查出测定结果。参考值健康成年人肌红蛋 白<70μg／L。建议各实验室根据自己的条件，建立本地的参考值。 4 临床意义 4.1血清肌红蛋白是早期诊断AMI的敏感指标，在AMI发作后1～2小时，在 患者血清中的浓度即迅速增加。6～9小时几乎所有的AMI患者Mb都升高。Mb 在血液中清除的速度很快，在发病24小时内可恢复到正常，所以连续检测血清 中的Mb，对评价患者在治疗期间是否有心肌梗死再次发生具有很重要的意义。 患者在发作后第l天内血清肌红蛋白即可返回到基线浓度，当有再梗死时，则又 迅速上升，形成“多峰”现象，可以反映局部缺血心肌周期性自发的冠脉再梗死和 再灌注。
体外诊断试剂胶乳比浊法学习
体外诊断试剂胶乳比浊法学习 胶乳免疫比浊法相关知识 很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目，关注胶乳标记技术的技术人员越来越多。本人总结了部分胶乳微球标记技术，并加以分类，以便朋友们查阅： 胶乳微球物理吸附： 反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团，pka 大约为2，因此在酸性pH保持稳定。醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在pH5.0以上时保持稳定。 带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法。这种方法中，微球溶液和含目标蛋白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物。疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球）。醛基表面修饰微球是一个特例，其疏水吸附结果取决于后来的共价结合。虽然物理吸附是不依赖pH的，但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的影响，从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率。一般，在被吸附蛋白等电点附近pH时，物理吸附效率会很高。 反应步骤： 1.用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml； 2.用反应缓冲液系数胶乳微球到1%； 3.将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中，10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液。室温搅拌孵育2hr； 4.离心或超滤，除去未结合蛋白； 5.将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解。 注意事项： 1.最优蛋白标记量影响因素 1）有效比表面积：粒径减小时，比表面积/mg微球值得增加；
2）胶体稳定性：蛋白对胶乳有稳定和去稳定作用； 3）免疫反应：最近标记量由免疫反应需要决定。 2.胶乳微球中加入蛋白后，快速搅拌混合，利于反应均衡。反应体积是1ml时，可用移液器吸取蛋白加入微球中，并吹打数次。如果反应体积较大时，用烧杯，边搅拌边加入蛋白， 3.储存缓冲液和反应缓冲液不同时，抗体有脱落的可能； 4.表面活性剂能使得抗体从胶乳中脱落，所以应避免加入。 微球共价结合抗体方法： 一、一步法 1.准备50mM pH 6.0的reaction buffer，醋酸或MES buffer更合适 2.用reaction buffer溶解抗体，使其浓度为1mg/mL。 3.用reaction buffer 悬浮微球，使其浓度为1% w/v 4.边搅拌边将一倍体积的抗体溶液加入到10倍体积的微球悬液中，室温下持续搅拌20分钟 5.准备浓度为10mg/ml（52umol/mL）的EDC溶液，用前准备，现配现用。 6.将计算需求量的EDC溶液加入到上述微球悬液中。(Note 6). 7.室温下，立即调节pH (Note 7). 8.移除未结合的蛋白，并将包被微球用storage buffer重悬。(Note 3 and 4) B. 两步法 为了避免EDC将相邻微球之间的蛋白偶联导致微球聚集或者蛋白之间交流，两步法偶联抗体更合适。两步法中，在蛋白加入之前，多余的EDC被移除。两步法中，蛋白也可以使用更高pH的buffer来溶解，从蛋白的稳定性方面和加速蛋白和活化微球之间的交联速度方便考虑，是非常有利的。 B1 简单一步法： 1.准备50mM pH 6.0的活化buffer，醋酸或MES buffer更合适；用活化buffer 悬浮微球，使其浓度为1% w/v
体外诊断试剂胶乳比浊法学习
欢迎共阅 胶乳免疫比浊法相关知识 很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目，关注胶乳标记技术的技术人员越来越多。本人总结了部分胶乳微球标记技术，并加以分类，以便朋友们查阅： 胶乳微球物理吸附： 反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团，pka大约为2，因此在酸性pH保持稳定。醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在pH5.0以上时保持稳定。 3.??用reaction buffer 悬浮微球，使其浓度为1% w/v 4.??边搅拌边将一倍体积的抗体溶液加入到10倍体积的微球悬液中，室温下持续搅拌20分钟 5.??准备浓度为10mg/ml（52umol/mL）的EDC溶液，用前准备，现配现用。 6.??将计算需求量的EDC溶液加入到上述微球悬液中。(Note 6). 7.??室温下，立即调节pH (Note 7). 8.??移除未结合的蛋白，并将包被微球用storage buffer重悬。(Note 3 and 4) B. 两步法 为了避免EDC将相邻微球之间的蛋白偶联导致微球聚集或者蛋白之间交流，两步法偶联抗体更合适。两步法中，在蛋白加入之前，多余的EDC被移除。两步法中，蛋白也可以使用更高pH的buffer来溶解，从蛋白的稳定性方面和加速蛋白和活化微球之间的交联速度方便考虑，是非常有利的。
B1 简单一步法： 1.??准备50mM pH 6.0的活化buffer，醋酸或MES buffer更合适；用活化buffer 悬浮微球，使其浓度为1% w/v 2.??每ml微球悬液加入20mg的EDC，室温孵育20分钟，然后再次加入20mg/mL的EDC，继续室温孵育20分钟。(Note 7). 3.??离心或超滤，用等体积的包被缓冲液清洗两次微球，最后悬浮在包被缓冲液中。(Note 3). 4.??用包被缓冲液溶解抗体到1mg/mL，包被缓冲液pH7~9，浓度为50mM~100mM。(Note 1) 5.??将抗体快速加入的搅拌中的微球悬液中，持续搅拌，室温孵育2~5小时。(Note 2). 6.??每ml反应溶液中加入2.5ul的乙醇胺，持续搅拌并室温孵育10分钟。(Note 9). 7.??离心或超滤，用储存缓冲液悬浮，重复两次，移除未结合的抗体和乙醇胺。(Note 3 and 4) 时，应该在烧瓶或烧杯里搅拌剧烈些，蛋白溶液快速加入到漩涡中间。 3.??移除未结合的化合物或蛋白，如果颗粒直径大于0.2um，可以通过离心的方法，微球可以重新悬浮，然后搅拌，接着温和的超声分散。离心力不宜过大，这样会导致微球不易分散。也可以用超滤或透析来纯化。当用超滤时，滤膜孔径应该足够大，使得游离的蛋白能自由的通过滤膜。用于清洗微球的buffer应该和storage buffer一样。用于清洗的buffer的任何缓冲液成分及pH的改变，都会引起蛋白的脱落。 4.??微球包被抗体后，加入表面活性剂或者去污活性成分，可能会导致抗体脱落。如果是共价结合到微球上，共价结合的抗体就不会有脱落现象发生。封闭蛋白，像BSA，casein 或gelatin可以用来封阻任何空余的疏水性位点，防止微球发生非特异性凝集。但是表面活性剂可以将那些共价结合不牢固的抗体洗脱下来。 5.??此试剂和水反应，因此，溶解后应立刻使用掉。
胶乳增强免疫透射比浊法测定NGAL的性能评价
胶乳增强免疫透射比浊法测定NGAL的性能评价 李玲;李从荣 【摘要】目的评价胶乳增强免疫透射比浊法商品化试剂盒测定中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的性能.方法分析商品化NGAL胶乳增强免疫透射比浊法试剂盒在全自动生化分析仪上检测的精密度、准确度、线性、抗干扰能力和比对实验等性能.结果检测的准确度较好,批内精密度(CV)≤10%,批间精密度 (CV)≤15%,NGAL浓度在25~2 565 ng/ml范围内,理论值与实测值均呈线性相关,相关系数r≥0.990;检测不同浓度干扰物(甘油三酯、胆红素、血红蛋白、抗坏血酸)时,其干扰程度≤10%,NGAL试剂盒的检测结果均不受影响.两个不同全自动生化分析仪厂家间比较,相关系数为0.996,线性回归方程为y=0.994x-5.388,预期偏差可接受.结论该商品化NGAL试剂盒的准确度、精密度、线性范围和抗干扰能力均良好,可批量测定,且快速、操作方便、简单,可作为临床常规NGAL测定方法使用.%Objective To evaluate the performance of latex-enhanced immunoturbidimetric assay in the de-termination of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL). Methods The precision, accuracy, linearity and anti-jamming performances were evaluated during the tests on a fully automatic biochemical analyzer with the com-mercialized kit of latex-enhanced immunoturbidimetric assay for NGAL. Results A good accuracy was obtained, with the intra specific variation coefficient (CV) of≤10%and the inter specific variation coefficient (CV) of≤15%. The measured values were linearly related to the theoretical values when the concentrations of NGAL were in the range of 25~2 565 ng/ml (r≥0.990). It was observed that the interfering components had no impact on the test results from NGAL