免疫比浊法和免疫投射比浊法(修改版)
免疫比浊法和免疫投射比浊法
1.定义：
（1）免疫比浊法：在一定量的抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间后形成抗原抗体复合物，用浊度计测量反应液体的浊度，并由此推算样品中的抗原含量。
（2）免疫投射比浊法：当光线通过一个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒
的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法。一般
采用抗体对抗原定量的透射比浊法，称为免疫透射比浊法。2.原理
（1）免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规
定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促
聚剂（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使
反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的
量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增
加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算
出检样中抗原的含量。
（2）免疫透射比浊法是抗原抗体结合后，形成免疫复合物，在一定时间内复合物聚合出现浊度。当光线通过溶液时，可被免
疫复合物吸收。免疫复合物量越多，光线吸收越多。光线被
吸收的量在一定范围内与免疫复合物的量成正比。利用比浊
计测定光密度值，复合物的含量与光密度值成正比，同样当抗体量一定时，光密度值也与抗原含量成正比。本法较单向琼脂扩散试验和火箭电泳等一般免疫化学定量方法敏感、快速简便，但要求免疫复合物的数量和分子量达到一定高度，否则就难以测出。
3.关系
4．免疫比浊法适用的仪器
紫外可见分光光度计
全自动生化仪
全自动生化仪常见的检测方法
终点法
连续检测法
比浊法
均相酶免疫分析
免疫比浊法和免疫投射比浊法(修改版)
免疫比浊法和免疫投射比浊法 1.定义： （1）免疫比浊法：在一定量的抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间后形成抗原抗体复合物，用浊度计测量反应液体的浊度，并由此推算样品中的抗原含量。 （2）免疫投射比浊法：当光线通过一个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒 的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法。一般 采用抗体对抗原定量的透射比浊法，称为免疫透射比浊法。2.原理 （1）免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规 定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促 聚剂（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使 反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的 量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增 加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算 出检样中抗原的含量。 （2）免疫透射比浊法是抗原抗体结合后，形成免疫复合物，在一定时间内复合物聚合出现浊度。当光线通过溶液时，可被免 疫复合物吸收。免疫复合物量越多，光线吸收越多。光线被 吸收的量在一定范围内与免疫复合物的量成正比。利用比浊
计测定光密度值，复合物的含量与光密度值成正比，同样当抗体量一定时，光密度值也与抗原含量成正比。本法较单向琼脂扩散试验和火箭电泳等一般免疫化学定量方法敏感、快速简便，但要求免疫复合物的数量和分子量达到一定高度，否则就难以测出。 3.关系 4．免疫比浊法适用的仪器 紫外可见分光光度计 全自动生化仪 全自动生化仪常见的检测方法 终点法 连续检测法 比浊法 均相酶免疫分析
免疫散射比浊法和免疫透射比浊法测定免疫球蛋白结果比较
免疫散射比浊法和免疫透射比浊法测定免疫球蛋白结果比较刘少华;邓文平;李燕 【摘要】目的探讨免疫透射比浊法和免疫散射比浊法测定免疫球蛋白(Ig)水平的关系.方法用免疫透射比浊法和免疫散射比浊法检测252例健康体检人群的血清Ig,同时测定IgG高、低值水平,分析两种方法测定结果之间的关系.结果健康体检人群中血清IgG水平免疫透射比浊法[(11.46±4.92)g/L]测定与免疫散射比浊法[(11.85±3.72)g/L]测定相比,差异无统计学意义(P>0.05);免疫透射比浊法 IgM[(1.51±1.06)g/L],免疫散射比浊法IgM[(1.60±0.91)g/L]和免疫透射比浊法IgA[(2.08±1.51)g/L],免疫散射比浊法IgA[(2.15±1.19)g/L]水平差异均无统计学意义(P>0.01).高、低值IgG用两种方法均可以测定.结论了解免疫功能水平时,测定Ig用免疫透射比浊法和免疫散射比浊法均可,但免疫散射比浊法更有利于病情的监测.%Objective To compare transmission turbidity and scatter turbidity method on measuration of serum immunoglobulin (Ig) levels. Methods Serum Ig concentration was measured by transmission turbidity and scatter turbidity method in 252 healthy people. The high level and low level of IgG were also measured. The relationship between the two methods was analyzed. Results The results showed that the levels of IgG[(11. 46 ±4. 92)g/L,(11. 85 ± 3. 72)g/L] ,IgM[(l. 51 ± 1. 06)g/L,(l. 60 ± 0. 91)g/L] and IgA [(2. 08± 1. 51)g/L, (2. 15 ± 1. 19)g/L] had no significant difference in healthy people(P>0. 05) measured by transmission turbidity and scatter turbidity method. High and low level of IgG can detect by transmission turbidity and scatter turbidity method. Conclusion Transmission turbidity and scatter turbidity method can both be used for
免疫透射比浊法和免疫散射比浊法检测特定蛋白的抗干扰能力比较-精选文档
免疫透射比浊法和免疫散射比浊法检测特定蛋白的抗干扰能力比较 在临床上，对于人血清内特定蛋白的检测，一般是采取免疫散射比浊法、免疫透射比浊法进行检测;然而，在检测的过程中，如游离血红蛋白、脂蛋白等会对检测的结果带来一定的干扰，继而影响检测结果的准确性[1]。对此，为保证血清检测的准确性，笔者对免疫透射比浊法、免疫散射比浊法在特定蛋白抗干扰能力的效果进行探讨，具体报道如下。 1.资料与方法 1.1对象 本次研究的样本源自于某医院门诊与住院患者当天的新鲜 血清，其中排除存在脂血、溶血、浑浊等血清。同时，事前准备好IgM、CRP等浓度不等的混合血清，具体为IgM低浓度1.0～1.5g/L，高浓度大于2.0g/L;CRP低浓度4～10mg/L，高浓度大于100mg/L。 1.2仪器设备 选用Dade Behring BNProSpec特定蛋白测定仪、Roche Modular P全自动生化分析仪，试验所用试剂皆为仪器配套试剂。同时选取三个干扰物，即FBil（游离胆红素）、CH（乳糜）、Hb（血红蛋白），每种干扰物各准备两瓶试剂盒，一瓶作为空白对照使用，另外，干扰物的浓度具体为FBil3280μmol/L、
CH15000FTU、Hb49.6μmol/L[2]。 1.3研究方法 首先，对混合血清进行制备，之后依据干扰试剂盒上的制备顺序，配制干扰物;将2ml的蒸馏水加入到每一个干扰物与空白对照内，复溶。然后，按照1：9的比例，把已经准备好的干扰物和混合血清混合在一起，制作成干扰物样本，其中含有干扰物的为样本甲，未加干扰物为样本乙[3]。把两个样本分别制定浓度不等的若干个样本，具体浓度见下表1所示。最后采取特定蛋白测定仪与全自动生化分析仪展开特定蛋白的抗干扰试验检测，同时对其干扰率进行计算。 1.4统计学分析 本次研究所得全部数据，均采取软件Excel加以分析与处理。其中，干扰率计算公式为：含有干扰物组的均值减去空白对照组的均值，之后再除以空白对照组的均值。注意，特定蛋白（已加入干扰物）所测得的均值，高于浓度相同的空白对照组的正负5%，那么则判定为检测受到了干扰[4]。 2. 结果 经检测发现，CH在9000与15000时，免疫散射比浊法对IgM 进行检测时，受到干扰影响;Hb在9.9与29.8浓度时，免疫散射比浊法对高浓度IgM、低浓度CRP检测时，受到干扰影响。采取免疫透射比浊法对三种含有干扰物的特定蛋白进行检测时，未受到任何干扰影响。具体情况见下表1所示。
免疫球蛋白G(IgG) 免疫比浊法
项目免疫球蛋白G（IgG） 方法免疫比浊法 目录1．检测原理 2．标本采集与处理 2.1 受检者的准备 2.2 静脉采血 2.3 抗凝剂 2.4 标本处理 3．试剂 3.1 试剂 3.2 校准血清 3.3 试剂与校准血清的稳定性 4．仪器 5．操作 6．计算 7．操作性能 7.1 精密度 7.2 准确度 7.3 灵敏度 7.4 可报告范围 7.5 特异性 7.6 干扰 8．参考值 9．临床意义 附录A: 参数 1. 检测原理 405nm
样本中IGG + 试剂中的IGG抗体-----------------大分子免疫复合物 在405nm监测生成的复合物的浊度变化，与样本中IGG含量成正比。 2. 标本采集与处理 2.1 受检者的准备： 病人空腹12h，不饮酒24h后采集血样。体检对象抽血前应有两周的的正常状况记录。注意有无应用影响测试项目的药物。此外，对于体检者，采血的季节都应做相关记录，因为样本中各项目的含量有季节性变动，为了前后比较应在每年同一季节检验。应嘱体检对象在抽血前24小时内不做剧烈运动。 2.2 静脉采血： 除非是卧床的病人，一般在采血时取坐位。体位影响水分在血管内外的分布，会影响测试项目的浓度。在采血前至少应静坐5分钟，一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过1分钟，穿刺成功后立即松开止血带。 2.3 抗凝剂： 不使用抗凝剂。 2.4 标本处理： 血标本室温放置30min～45min后离心分离血清，在两小时内检测完毕；如两小时内不能检测完毕，将离心分离血清置洁净试管加盖2-8℃保存。 3．试剂 3.1 试剂： R1：PEG4 缓冲液： 包含高分子强化剂的磷酸盐缓冲液。含有0.095%的叠氮化钠。 R2：IgG抗血清，含0.095%的叠氮化钠。 3.2：校准血清 使用湖南永和阳光科技有限责任公司提供的多项免疫类标准液。其中包含免疫球蛋白G的定值。 校准频次： 全点定标：试剂换批号使用时或质控结果超过规定的2SD范围，需要全点定标。 3.3 试剂与校准血清的稳定性： 原包装试剂储存在2-8℃至标签所示失效日期。试剂开瓶后，在仪器中至少可保存30天。
免疫透射比浊法
免疫透射比浊法 一、原理 当光线通过一个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法。这一方法早于1959年Schultre和Schuick 等报道应用于血浆蛋白与其抗体结合后形成复合物，导致浊度的改变，再进行透射比浊测定，一般采用抗体对抗原定量的透射比浊法，称为免疫透射比浊法。其原理是，利用抗原和抗体的特异性结合形成复合物，通过测定复合物形成量的多少对抗原或抗体进行定量的方法。在介质溶液中，抗原与特异性抗体在一定条件下才能形成复合物，一定的条件包括：①对抗体的要求，作为体液或组织中蛋白质种类很多，若要快速特异检测，要求有单价特异抗体才能与抗原形成复合物。某一种蛋白质，有其特异抗体才能与该抗原结合，形成免疫复合物进行定量，若抗体不纯混杂有另一种或两种少量的抗体，这种免疫复合物就不是单一复合物而是大杂烩，结果偏高；②抗原抗体比例适当，因免疫复合物形成有三个阶段，第一阶段是复合物形成抗原抗体复合物；第二阶段是初步形成抗原抗体复合物，此阶段是复合物交联成大的网格状结构；第三阶段是复合物聚合产生絮状沉淀。只有在抗原与抗体等价时即无过剩抗体，此时，复合物的结合与解离处于平衡状态，其混浊程度达高峰。在抗体过量时，随抗原量的增加而复合物形成也增加，其测定只能在反应曲线的左侧进行（见图18-4）；③一般要求溶液中有非离子性亲水多聚体促进免疫复合物的形成，如聚二乙醇6000等。溶液pH为6.5～8.0之间为宜。载脂蛋白有形成两性螺旋片（amphipathic helix）的特性，对脂质（特别是磷脂）有高度亲和力，与脂质结合后有时会掩盖抗原位点或构象改变，可以部分或完全丧失对抗血清的特异反应。为此，载脂蛋白检测过程中有必要先暴露抗原位点，所用试剂有表面活性剂，尿素，盐酸胍和吐温等解离蛋白剂，或用四甲基脲脱脂或有机溶剂脱脂等暴露抗原决定簇等方法，血清脂蛋白颗粒中的载脂蛋白，能在短时间内形成抗原抗体复合物进行定量；④抗原不能过量，因为抗原过量，抗原抗体复合物形成不但不增加，反而会减少，光散射或光吸收减少，检测结果反而偏低。
免疫散射比浊法
免疫散射比浊法 免疫散射比浊法是一种近年来发展迅速的检测技术，它是一种非常有效的检测方法，能够快速准确地检测出物质的病原体和药物抗体。本文将重点讨论免疫散射比浊法的工作原理、优缺点以及实际应用。 首先，我们来看看免疫散射比浊法是如何工作的。散射可以将一个物质分解成一系列衍射线，而比浊法则利用物质的衍射线的强度变化来检测物质的结构。与其他衍射技术（如X射线衍射）相比，比浊可以更快速地检测物质结构，因为它可以利用衍射瓦数的变化来进行衍射数据的分析。此外，比浊法也具有更高的灵敏度，因此能够检测出更多的病原体和药物抗体。 免疫散射比浊法的主要优点是检测速度快、灵敏度高、数据分析方便、精度高，能够在短时间内准确地检测出病原体和药物抗体。另外，由于免疫散射比浊法所分析的数据是不可见的，因此可以有效避免偏见和偶然性，使得结果更加准确可靠。 但是，这种技术也存在一些弊端。首先，免疫散射比浊仪的费用高昂，这一衍射装置的成本非常高，在普通实验室范围内难以实现；其次，免疫散射比浊法需要高精度的衍射装置，偶尔可能会受到其他衍射技术影响；最后，由于免疫散射比浊法只能检测物质的分子形状，因此无法直接检测物质的化学结构。 免疫散射比浊法在实际应用中被广泛应用于生物学领域，如检测病毒和细菌的形态及分子结构、检测抗体的类型及效力以及检测药物的活性成分以及作用机制等。例如，近年来研究人员利用免疫散射比
浊法成功地检测出了一种新型的HIV拮抗药物，它能够在体外有效抑制HIV病毒的复制。此外，免疫散射比浊法还可用于分析生物分子活性成分，例如乳糖苷酶等，以及其他药物分子。 综上所述，免疫散射比浊法是一种技术上先进、灵敏度高、数据分析方便、精度高的检测技术，广泛应用于生物学领域，能够快速准确地检测出物质的病原体和药物抗体。尽管其存在一定的缺点，但是它仍然是检测病原体和药物抗体的理想选择。
免疫浊度法
免疫浊度法 经典的沉淀试验有4个缺点无法克服，即操作繁琐、敏感度低（10～100μg/ml）、时间长和难以自动化。根据抗原与抗体能在液体内快速结合的原理，70年代出现了微量免疫沉淀测定法，即免疫透射浊度测定、免疫胶乳浊度测定和免疫散射浊度测定法。这3种技术皆已常规用于临床体液蛋白的检测，并已创造出了多种自动化仪器。 免疫浊度测定的基本原理是：抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。当反应液中保持抗体过量时，形成的复合物随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出受检物的含量。 免疫浊度测定法按照仪器设计的不同可以分为两种，即比浊仪测定（turbidimetermeasure）和散射比浊仪测定（nephelomitermeasur e）。比浊仪测定是测量由于反射、吸收或散射引起的入射光衰减，其读数以吸光度A表示。A什反映了入射光与透射光的比率（A＝2－log10 T，T代表浊度百分比）。散射比浊仪测定是测量入射光遇到质点（复合物）后呈一定角度散射的光量，该散射光经放大后以散射值表示。两者的比较见图12-12。 图12-12透射光和散射光测定比较 由于免疫复合物的形成有时限变化，当抗原抗体相遇后立即结合成小复合物（＜19S），几分种到几小时才形成可见的复合物（＞19 S）。作为快速比浊测定，这种速度太慢，加入聚合剂（或促聚剂）可中速大的免疫复合物形成。目前促聚剂多用聚乙二醇（MW6000～800
0），浓度约为4％。 浊度测定亦有其弱点。其一是抗原或抗体量大大过剩时易出现可溶性复合物，造成测定误差，测定单克隆蛋白时这种更易出现。其二是应维持反应管中抗体蛋白量始终过剩，这个值要预先测定，使仪器的测定范围在低于生理范围到高于正常范围之间；其三是受血脂的影响，尤其是低稀释度时，脂蛋白的小颗粒可形成浊度，使测定值假性升高。 二、免疫胶乳浊度测定法 在上述比浊法中，少量的小的抗原抗体复合物极难形成浊度，除非放置较长时间；如形成较大的复合物，则抗原和抗体用量也较大，显然不符合微量化的要求。于是发展了免疫胶乳浊度测定，其基本原理是：将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，则使胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波之内不阻碍光线透过，两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少，这种减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度呈正比，当然也与待测抗原量呈正比。见图12-13。 图12-13载体胶乳免疫比浊原理 （a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线；（b）结合后，则形成光线衰减 该技术的关键在于两个方面。首先是选择适用的胶乳，其大小（直径）要稍小于波长。用500nm波长者，选择100nm颗粒较适合；用5
免疫比浊法伪浊度的原因和处理方法做分析和总结。
免疫比浊法伪浊度的原因和处理方法做分析和总结。 免疫浊度分析法包括透射免疫比浊法、散射免疫比浊法、免疫乳胶浊度测定法等。免疫浊度分析由于其反应的特殊性，决定了该方法容易受到抗体性质和质量、抗原抗体的比例以及检测体系等一系列因素的影响。 1、抗体质量 免疫比浊测定法要求抗体的特异性强、效价高，亲和力强。特异性差的抗血清，由于含有大量杂抗体，反应后可形成非特异性浊度(“伪浊度”)，出现假性升高。使用低效价(<1:20)抗体会使试剂消耗增多，同时也可增加“伪浊度”的产生。 2、抗体类型 根据抗血清来源的动物种类不同，抗体可分为R型 (rabbit type)和H 型(horse type)。R型抗体亲和力较强，与抗原结合后不易解离，在抗体过剩时易形成大而稳定的复合物；但抗原过剩时，则形成可溶性复合物。H型抗体亲和力弱，抗原、抗体结合后极易解离，而且抗原或抗体过剩易形成可溶性复合物。R型抗体是用于免疫比浊测定的较为理想的试剂。 R型 H型抗体的定义总结 1、用沉淀反应对不同来源的免疫血清进行比较后，可将抗体按等价带范围大小分为两种类型，即R型抗体和H型抗体。R型抗体的等价带较
宽，具有较大的抗原、抗体合适比例范围，与相应抗原结合易出现可见的抗原-抗体复合物，仅在抗原过量时，才出现小分子的可溶性抗原-抗体复合物，如兔、羊的免疫血清。H型抗体的等价带较窄，其抗体与抗原的合适比例范围较窄，抗原或抗体过量，均可形成可溶性免疫复合物，如马、人的免疫血清。 2、抗原、抗体比例 抗原和抗体的比例是浊度形成的关键因素，抗原和抗体必须在一个适当的浓度才会出现最高结合率。当抗原过量时，形成的免疫复合物分子小，而且会发生解离，使浊度下降，光散射减少；当反应液中抗体过量时，免疫复合物的形成随着抗原量的增加而递增，光散射的强度也随之递增。因此，免疫浊度测定的反应体系中必须始终保持抗体过量，以保证免疫复合物的生成量与浊度的改变一致，这是免疫浊度测定的基本原则。 抗体过量必须适量，因此实验中掌握抗体的浓度是关键。一般原则是事先确定某一被测物的正常值，以高于或低于此正常值的50%作为测定范围，抗体在此范围内均应保持过剩。为了减少“伪浊度”的出现，还应对抗原（待测样品）进行适当的稀释。 目前全自动免疫浊度测定仪一般具有抗原过量的自动监测功能，并能对含过量抗原的待测样品进行自动稀释，重新监测。其设计原理是：在抗体过量的前提下，待测抗原在反应液中与抗体快速反应形成稳定
免疫散射比浊法与PCR
散射比浊法是指一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液使遇到抗原抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物颗粒大小和多少密切相关。散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测抗原越多，形成的复合物也越多，散射光也越强。散射光的强度还与各种物理因素，如加入抗原或抗体的时间、光源的强弱和波长、测量角度等密切相关。 （一）散射颗粒与散射光 悬浮在反应溶液中的分子，无论是固体或胶体粒子都可以是散射中心，当入射光通过时，如果颗粒直径比入射光的波长小很多，则散射光的分布比较均匀，称为Rayleigh散射。如果颗粒直径接近于入射光的波长，则散射光的分布明显不均匀，称为Mile散射。 （二）反应物含量与散射浊度 抗原抗体结合反应中，遵守典型的Heidelberger曲线，即当抗体量恒定时，抗原与抗体结合，形成免疫复合物的反应与散射信号响应值的上升呈正比。 多聚集链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术发明至今已近20年了，在这期间技术得到了不断的发展，近年来出现的实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，本文就此技术及其应用做一综述。 1 实时荧光定量PCR技术的方法学 1.1 原理所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在real-time 技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能。（2）此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-time Q-PCR方法在研究工作中的运用。 PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在real-time Q-PCR中，对整个PCR 反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值（threshold）是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline），荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数（Ct）。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 1.2 荧光化学目前real-time Q-PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：DNA结合染色，水解探针，分子信标，荧光标记引物，杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。 扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子，如SYBR green 1等荧光染料。Real-time Q-PCR发展早期就是运用这种最简单的方法，在PCR反应体系中，加入过量SYBR green 1荧光染料，SYBR green 1荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA（如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（melting curve）分析的软件加以解决。
免疫比浊法检测免疫球蛋白(3页)
免疫比浊法检测免疫球蛋白 (3页) Good is good, but better carries it. 精益求精，善益求善。
免疫比浊法检测免疫球蛋白 一、实验目的 利用免疫比浊法绘制标准曲线，并检测样品中免疫球蛋白的浓度。（本小组检测的为IgG样品） 二、实验原理 1.抗原抗体反应(Antigen-antibody reaction)：抗原与其刺激机体产生的相应抗体在体内或体外发生特异性结合的反应。反应特点有：特异性、比例性、可逆性、敏感性。影响因素有：电解质、温度、酸碱度。 2.免疫比浊法：合适比例的抗原抗体形成的免疫复合物，在PEG作用下形成微粒，使样品浊度发生变化。当一束光线通过溶液受到光散射和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱，根据光的强度改变可测得微粒浓度。 分类：①透射比浊法（Transmission tubidimetry）当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于被不溶性免疫复合物吸收而减弱，故在一定范围内吸光度与免疫复合物量呈正相关。当抗体浓度固定（过量），样品的浊度与其中所含抗原量成正比。（特点）透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的时间较长。②散射比浊法（Nephelometry）光线通过检测溶液时，被其中所含的抗原抗体复合物折射而部分偏转，产生散射光，其强度与复合物的数量和散射夹角成正比，与光的波长成反比。（特点）优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。
本实验采用透射法。 3.聚乙二醇PEG的作用：在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，3~4％的聚乙二醇，可破坏抗原抗体的水化层，促进抗原抗体靠近反应，但如浓度不适合，会影响其它溶质或产生非特异性聚集影响结果。 三、实验材料 免疫球蛋白A,G(IgA,IgG)测定试剂(试剂1[PEG]，试剂2[羊抗人IgA, IgG]）（1管/每组） 免疫球蛋白A, G(IgA,IgG)校准品，蒸馏水，血清样本（1管） 微量加样枪、ep管（1.5mL离心管） 酶标仪、水浴箱 四、实验步骤 1.在7个EP管中各加250µL IgG试剂1（PEG）。 2.7管分别加入蒸馏水、校准品原液、1：2校准品、1：4校准品、1：8校准品、1：16校准品、样本各2μL。 3.混匀后37℃水浴5min。 4.7管各加入85μL IgG试剂2（羊抗人IgG）。 5.混匀后37℃水浴10min。 6.分别吸取200µL至96孔酶标板中，用酶标仪在700nm处读取OD值。 五、实验结果与数据处理 1.实验数据 >'￥!￥）；&%，\：：{—\·:。.(*~??}·、，}
免疫比浊法测C反应蛋白
免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。 抗体（Ab）与可溶性抗原（Ag）反应，形成一定结构的免疫复合物，成为悬浮于反应溶液中的微粒。在沉淀反应中形成的复合物微粒具有特殊的光学性质，可用仪器检测，提高了检测的速度、灵敏度和易操作性。 免疫比浊测定注意事项： 1、抗原或抗体量大大过剩，可出现可溶性复合物，造成误差。 2、应维持反应管中抗体蛋白始终过剩。 3、易受到脂血的影响。 分类 1.免疫透射比浊法抗原抗体结合后，形成免疫复合物，在一定时间内复合物聚合出现浊度。当光线通过溶液时，可被免疫复合物吸收。免疫复合物量越多，光线吸收越多。光线被吸收的量在一定范围内与免疫复合物的量成正比。利用比浊计测定光密度值，复合物的含量与光密度值成正比，同样当抗体量一定时，光密度值也与抗原含量成正比。本法较单向琼脂扩散试验和火箭电泳等一般免疫化学定量方法敏感、快速简便，但要求免疫复合物的数量和分子量达到一定高度，否则就难以测出。 2.免疫散射比浊法一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液使遇到抗原抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物颗粒大小和多少密切相关。散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测抗原越多，形成的复合物也越多，散射光也越强。散射光的强度还与各种物理因素，如加入抗原或抗体的时间、光源的强弱和波长、测量角度等密切相关。散射比浊法又分为速率散射比浊法和终点散射比浊法。 3.免疫胶乳比浊法胶乳比浊法即是将待测物质相对应的抗体包被在直径为15－60nm的胶乳颗粒上，使抗原抗体结合物的体积增大，光通过之后，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而提高试验的敏感性。 实验八免疫比浊法测定C-反应蛋白 【原理】 血清C反应蛋白（CRP）与试剂中抗人CRP抗体结合，形成免疫复合物，一起吸光度增加，在波长340nm和700nm处测定免疫复合物浊度。根据吸光度增加