一文读懂免疫组化步骤、结果分析及注意事项
免疫组化原理、步骤及要注意的事项
免疫组化原理、步骤及要注意的事项免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。
在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。
直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。
目前通常选用免疫酶组化间接染色法。
三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。
免疫组化原理步骤及要注意的事项
免疫组化原理步骤及要注意的事项免疫组化是一种常用的细胞和组织学检测方法，通过利用免疫学原理，使用特异性抗体对目标分子进行检测，主要应用于分析蛋白质分子的表达，可以帮助研究者了解不同细胞和组织中蛋白质的分布和功能，对于疾病的诊断和治疗也具有重要意义。
下面将介绍免疫组化的原理、步骤及要注意的事项。
原理：免疫组化是利用特异性抗体与抗原发生特异性反应的原理来进行的。
主要包括两种反应：免疫定位反应和信号测定反应。
-免疫定位反应：通过组织抗原表面与抗体的结合，将目标分子定位于细胞或组织的特定位置。
-信号测定反应：将已定位的抗原-抗体复合物进行颜色或荧光标记，发出可见信号，用于检测和记录。
步骤：免疫组化的主要步骤包括标本制备、抗原修复、非特异性反应阻断、一抗染色、二抗染色和显微镜观察。
1.标本制备：选择合适的组织样本，常用的样本有组织切片、细胞涂片和细胞悬液。
样本制备主要包括取材、固定、包埋等步骤，其中固定是关键步骤，常用的固定剂有福尔马林、乙酸乙酯和交联剂等。
2.抗原修复：组织样本在固定过程中往往会导致抗原的空间结构改变和蛋白质交联，使其成为免疫组化的目标结构。
为了恢复抗原的免疫反应性，常常需要进行抗原修复，包括酶解法、消化法、热解法等。
3.非特异性反应阻断：为了减少非特异性结合，需要采取一些措施来阻断非特异性背景信号。
常用的方法包括用蛋白质阻断剂进行封闭、用牛血清白蛋白或BSA预处理等。
4.一抗染色：在经过上述步骤之后，用特异性抗体与目标抗原结合，构成抗原-抗体复合物。
为了增强抗原-抗体的结合力，常采用多种放大手段，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或二级抗体等。
5.二抗染色：一抗与抗原结合后，用特异性二级抗体进行检测，二级抗体上带有标记物（如荧光素、酶等），对抗原-抗体复合物进行定位。
6.显微镜观察：通过显微镜观察，检测特定信号的强度和位置，同时进行结果的记录和分析。
注意事项：-选择合适的抗体：免疫组化的关键在于合适的抗体选择，需要选择高度特异性和高亲和力的抗体。
免疫组化实验结果分析
免疫组化实验结果分析在免疫组化实验中，结果分析是一个关键的步骤，它能够帮助研究者准确评估目标分子的表达情况。
通过对免疫组织染色结果的观察和分析，我们可以了解到免疫反应的程度和位置，从而为研究提供有力的依据和指导。
本文将围绕免疫组化实验结果的分析展开讨论。
1. 实验结果描述在开始分析之前，首先要对实验结果进行描述。
描述应当包括样本编号、实验日期、染色报告等基本信息，并对结果进行文字描述，如颜色的强度、分布情况、阳性细胞数量等。
此外，还可以结合图像或照片进行结果展示，以便更直观地表达实验结果。
2. 染色结果的分析根据染色结果的颜色强度和阳性细胞的分布情况，可以分析免疫反应的程度和位置。
通常，颜色较深且阳性细胞较多的区域表示目标分子的高表达区域，而颜色较浅或无阳性细胞的区域则表示其低表达或无表达区域。
通过对颜色和阳性细胞数量的定量分析，可以量化目标分子的表达水平，并与其他样本进行比较和分类。
3. 阳性细胞计数和分布情况在免疫组化实验中，阳性细胞的计数和分布情况是结果分析的重要指标之一。
通过对染色结果图像的定量分析，可以计算出阳性细胞的数量，并使用统计学方法对不同样本之间的差异进行比较和验证。
此外，还可以通过细胞计数的分析，了解阳性细胞在组织中的分布情况，从而为目标分子的功能和作用机制提供线索。
4. 结果的统计学分析除了定性和定量分析，还可以使用统计学的方法对结果进行进一步的分析。
例如，可以计算平均值、标准差和标准误等统计指标，并进行方差分析和t检验等统计检验，以评估不同样本之间的显著性差异。
此外，还可以使用聚类分析、主成分分析等多元分析方法，对大规模的实验结果进行系统整理和分类。
5. 结果的生物学意义和临床应用最后，要将实验结果的分析归纳到生物学意义和临床应用上。
通过对目标分子的表达情况进行分析，可以了解其在生理和病理过程中的功能和作用机制，进而为相关疾病的预防、诊断和治疗提供新的线索和靶点。
此外，还可以将实验结果的分析与其他实验数据进行综合，构建更完整和准确的分子机制模型。
免疫组化步骤总结
免疫组化步骤总结免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和定位特定分子在组织和细胞中的表达情况。
本文将对免疫组化的步骤进行总结，以帮助读者更好地了解和应用这一技术。
免疫组化步骤主要包括样本制备、抗原修复、阻断非特异性结合、一抗孵育、二抗孵育、信号放大、显色与染色、显微镜观察和结果分析等环节。
下面将对这些步骤进行详细介绍。
1. 样本制备：首先，需要选择合适的组织样本或细胞，可以通过切片、细胞培养等方法获得。
然后，将样本固定在载玻片上，常用的固定剂有福尔马林和乙醛等。
固定后，需要进行脱水和透明化处理，使样本适合于免疫组化的进一步步骤。
2. 抗原修复：有些抗原在固定和加工过程中可能会丧失免疫反应性，需要进行抗原修复。
常用的方法有热处理、酶解等，目的是使抗原恢复其免疫原性，提高抗体的特异性和敏感性。
3. 阻断非特异性结合：在进行免疫反应之前，需要阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。
可使用一些蛋白质，如牛血清蛋白、牛血清、小鼠血清等，进行预处理，将其涂覆在样本上，阻断不特异性结合位点。
4. 一抗孵育：将特异性抗体（一抗）与样本接触，孵育一定的时间，使抗体与靶分子发生特异性结合。
一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体，具体选择要根据实验需求和抗体的特异性来确定。
5. 二抗孵育：一抗与抗原结合后，需要加入与一抗来源物种不同的二抗。
二抗是与一抗来源物种的免疫球蛋白发生反应的抗体。
二抗可以标记有荧光物质、酶物质等，以便于后续的信号放大和显色。
二抗的选择要根据一抗的来源物种和实验需要来确定。
6. 信号放大：为了增强免疫反应的信号，可以使用一些信号放大的技术。
常用的信号放大方法有生物素-链霉亲和素系统(Biotin-Streptavidin System)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。
这些方法可以使目标物质的信号增强，提高实验的灵敏度和准确性。
7. 显色与染色：信号放大后，需要进行显色与染色步骤。
这一步骤可以根据实验需要选择适当的染色剂，如荧光染料、酶标记物等。
免疫组化流程
免疫组化流程免疫组化是一种利用抗体与特定抗原结合的技术，用于检测细胞或组织中特定分子的存在和分布。
其流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
本文将以免疫组化的流程为主线，介绍各个步骤的具体操作方法和注意事项。
第一步是标本制备。
要制备免疫组化的标本，可以使用细胞悬液、细胞刮片、冰冻切片或石蜡切片等。
标本制备的关键是保持细胞和组织的完整性和形态。
对于固定的细胞和组织，需要将其处理成适合免疫组化的形式，例如通过冰冻切片或石蜡切片的方法。
第二步是脱脂。
脱脂是将细胞或组织中的脂肪和非脂肪物质去除的过程，以便更好地显示目标分子的分布。
通常可以使用乙醇、醚或甲醇等有机溶剂进行脱脂处理。
需要注意的是，脱脂时间不宜过长，否则可能导致抗原失活。
第三步是抗原修复。
抗原修复是为了使被固定的细胞或组织中的抗原恢复或暴露出来，以便与相应的抗体结合。
常用的抗原修复方法包括煮沸法、酶解法和酸碱解法等。
不同的抗原修复方法适用于不同的标本类型和抗原性质。
第四步是抗体处理。
在免疫组化中，需要使用一种与目标分子特异性结合的抗体。
通常可以使用一抗和二抗的结合用于检测。
一抗是与目标分子特异性结合的主抗体，而二抗则与一抗结合，用于产生荧光或酶标信号。
在抗体处理过程中，需要进行固定、洗涤和孵育等步骤。
第五步是染色。
染色是将经过抗体处理的样本显色或标记的过程，以便更好地观察目标分子的分布。
染色的方法可以根据需要选择，常用的有免疫荧光染色、酶标染色和银染等。
在染色过程中，需要根据实验要求和标本特点进行适当的控制，以获得准确的染色结果。
最后一步是显微镜观察。
经过以上的操作，样本已经准备好进行显微镜观察和分析。
观察时需要注意光线的调节和对焦的正确，以获得清晰和准确的图像。
同时，还需要根据实验要求和预定的结果指标进行分析和解读。
总结起来，免疫组化的流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
每个步骤都需要精确控制和注意细节，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化实验结果分析
免疫组化实验结果分析免疫组化实验是一种常用的生物学实验方法，用于检测细胞或组织中特定蛋白质的表达情况。
通过特定的抗体与目标蛋白质结合的方式，可以在光学显微镜下观察到颜色反应，从而得出关于该蛋白质表达水平的结论。
本文将对免疫组化实验结果进行详细分析。
一、实验结果描述在分析免疫组化实验结果之前，首先需要对实验结果进行描述。
描述应该包括实验样本的来源、处理方法、实验抗体及其稀释倍数、染色方式以及显微镜下观察到的颜色和形态特征等信息。
例如，可以描述实验使用的抗体是针对肿瘤标志物CA125的，样本来源于人体卵巢癌组织，实验过程中使用了免疫组化染色试剂盒，并观察到染色结果具有明显的细胞膜表达。
二、结果分析1. 强阳性表达：强阳性表达意味着目标蛋白质在细胞或组织中高水平表达。
在显微镜下观察到明亮的染色，通常是在细胞膜、细胞质或核内。
这种结果表明目标蛋白质与相关疾病或生物学过程密切相关，可以作为潜在的治疗靶点或疾病诊断标记物。
2. 弱阳性表达：弱阳性表达意味着目标蛋白质在细胞或组织中低水平表达。
在显微镜下观察到的染色较为淡色，并且通常在少数细胞中出现。
这种结果可以表示目标蛋白质在特定细胞类型或条件下的表达受到抑制，或者表达水平较低对于疾病进展的影响较小。
3. 阴性表达：阴性表达意味着目标蛋白质在细胞或组织中未被检测到。
在显微镜下观察不到明显的染色。
这种结果可能表明目标蛋白质在该细胞类型或该疾病中不表达，或者实验方法存在技术问题导致无法检测到目标蛋白质。
4. 零值控制：在免疫组化实验中，通常会设置阴性对照或零值对照来验证实验结果的准确性。
零值控制是指阴性对照样本在实验中未出现任何染色反应。
这一结果证明实验方法的特异性良好，不会对非特异性信号产生干扰。
三、结果解释对实验结果进行解释是免疫组化实验结果分析的重要环节。
在解释时，需要结合实验目的、已有的相关研究和临床实际进行综合考虑。
根据实验结果的阳性或阴性表达情况，可以推测目标蛋白质在疾病发生发展中的作用以及其潜在的临床应用前景。
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种通过使用抗体来检测组织或细胞中特定蛋白质的方法。
该技术的原理基于抗体与其特异性抗原结合的特性。
下面将详细介绍免疫组化的步骤。
第一步，固定组织：将待检测的组织或细胞固定在载玻片上。
常用的固定剂包括甲醛和乙醛，可通过浸泡、喷洒或滴加等方式施加在组织上，使细胞和蛋白质保持其形态和结构。
第二步，脱水：将固定的组织经过一系列浓度逐渐升高的酒精溶剂中处理，以去除水分，使组织逐渐与酒精混合。
第三步，脱脂：将组织在适当的溶剂（如二甲苯或苯）中脱脂，以去除酒精和脂质。
第四步，石蜡浸渍：将脱脂的组织浸泡在液态石蜡中，使其渗透并替代脱脂剂和二甲苯，然后固化组织。
第五步，切片：使用微tome切割固化的样本，制备出薄片，常见的切片厚度为4-5μm。
第六步，脱离：将切好的薄片与载玻片分离，常用的方法是利用热水浸泡薄片，使其松散分离。
第七步，抗原修复：利用高温和压力的方法，如蒸汽煮沸或压力锅，对薄片上的蛋白质进行解散，以恢复其免疫活性。
第八步，阻断非特异性结合：使用一些蛋白质如牛血清蛋白、动物血清或其他蛋白质来包裹薄片上的非特异性结合位点，以减少假阳性反应。
第九步，抗体处理：将特异性抗体加到薄片上，与待检测的蛋白质结合。
抗体可以是原代抗体（直接与靶蛋白质结合）或二抗（与原代抗体结合）。
第十步，洗涤：用缓冲液洗去未结合的抗体，并去除阻断剂和非特异性结合物。
第十一步，检测：将检测试剂滴加到薄片上，以产生特定色素或荧光信号。
常用的检测方法包括酶标法（如辣根过氧化物酶法，HRP法）和荧光标记（如荧光素酶法，AP法）。
第十二步，显微镜检查：使用显微镜观察薄片上的染色结果，评估标记物的定位和表达情况。
通过上述步骤，免疫组化技术可以帮助研究人员检测并定位组织或细胞中感兴趣的蛋白质。
其广泛应用于生物医学研究、临床诊断以及药物研发等领域，为揭示疾病的分子机制和开发新的治疗手段提供了重要的工具。
免疫组化方法和步骤
免疫组化方法和步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测细胞或组织中特定蛋白质的表达水平，以及研究细胞或组织中的蛋白质定位和相互作用。
免疫组化方法涉及一系列步骤，包括样本固定、抗原检测与标记、抗体与抗原结合、可视化和结果分析。
以下是免疫组化方法及步骤的详细介绍。
一、样本固定免疫组化实验的第一步是固定样本，通常使用福尔马林或乙醛等化学物质进行固定。
固定的目的是保持细胞和组织的形态结构，并防止蛋白质的降解。
固定过程中，需要将样本固定在载玻片或膜上，以便之后的实验操作。
可使用刷子或杆状工具将样本涂布在载玻片上，或者使用离心管和离心机将细胞沉淀在载膜上。
二、抗原检测与标记样本固定后，下一步是检测和标记目标抗原。
有两种常用的方法供选择：直接法和间接法。
1.直接法：直接法在一个步骤中同时检测和标记抗原。
直接法可以快速获得结果，但受到抗体的特异性和标记物的可用性的限制。
2.间接法：间接法需要两个步骤，先使用特异性初级抗体与抗原结合，再使用标记有染料或标记物的二级抗体与初级抗体结合。
间接法具有较高的灵敏度和特异性，可以用于多重标记和检测多个蛋白质。
三、抗体与抗原结合蛋白质和抗体结合是免疫组化的关键步骤。
待检样本上固定的抗原与抗体结合可以直接检测或通过信号增强来检测。
抗体与抗原结合的时间和温度取决于抗体的亲和力和特异性，通常需要在较低的温度下进行孵育，并在孵育过程中提供充分的抗体与抗原接触时间。
四、可视化可视化是将抗原抗体结合信号转化为可见光信号的过程。
最常见的可视化方法之一是使用酶标测定法。
酶标测定法将酶（如辣根过氧化物酶）结合到标记物（如荧光素黄标记的二级抗体）上，然后通过加入底物（如DAB）产生可见的色素反应。
除了酶标测定法外，还有其他可视化方法，如免疫荧光技术和原位杂交。
免疫荧光技术使用标记的荧光染料标记一级或二级抗体，然后通过荧光显微镜观察样本。
原位杂交使用与DNA序列互补的标记探针识别特定的DNA序列，并通过可视化标记（如荧光）来检测靶标。
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文读懂  免疫组化步骤、结果分析及注意事项
导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟：想拿高分
文章，不学免疫组化怎么行？” 免疫组化王子毛博旁边插话：
是这个理，今天我就豁出去，将我十多年的心得和经验奉献给小师弟你了。
”小师弟感激涕零，唯诺细听两位前辈的教诲免疫组化，免疫组织化学技术（immunohistochemistry ），是
项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。
免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。
石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。
免疫组化步骤详解免疫组化结果分析很多时候，我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。
但是却不知道如何正确地分析，得出理想的结果。
这实在是一件憾事。
如下图，正常的结果应该是这样的：镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一的棕色。
结果分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。
前者是在40*光镜下，随机10 个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色程度（0 分阴性着色，1 分淡黄色，2 分浅褐色，3 分深褐色）
和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。
免疫组化结果分析是毛博的特长，以下是他传授的独门绝技。
1.对照染色
和做实验的时候必须设立对照组一样，免疫组化也必须设立对照染色。
没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。
对照
般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身
对照。
般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照
就足够了。
2.定位
抗原表达必须在特定部位。
如LCA 应定位在细胞膜上；CK
应定位在细胞浆内；PCNA 及p53 蛋白应定位在细胞核内等等。
不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果。
有可能是非特异性染色或者假阳性。
不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。
3.半定位
现在一般用图像分析系统进行定量。
如果你的实验室不幸没有那么高大上的话，就只好赶鸭子上架，用肉眼定一下量了。
因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。
免疫组化的
半定量一般就分为三级：弱（+ ），中++ ），强（+++ ）。
以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和
x 2 +（+++）% x 3 计算出数值；总数值 图像分析仪 如果要进行精确定量的话，就要用到图像分析
仪。
图像分析 仪类型很多。
这里就不一一介绍了。
其实毛博最想隆重推荐 的是一款图像分析软件：Image J 。
毛博当年在米国做博士猴
的时候，就是用的这款软件。
这是 NIH 开发的免费软件 般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。
现在已经开发到 了 1.50 版。
网上可以免费下载。
其界面非常简洁，如下图所 示。
现在，根据一个实例来看看如何用 Image J 来进行图像 分析。
如下图所示， 我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。
那么，如何用Image J 来计数细胞的个数呢？首先，要把彩
色的图像转换成黑白图像。
步骤如下：Image 宀Type 宀16-bit 。
转换成黑白图像后，将要计数的部分用高亮标示出来。
步骤 如下：Image 宀Adjust 宀Threshold 。
然后拖动鼠标，直到所有 的细胞被标示出来。
有时候 2 个细胞靠得比较紧密，会被计 数为1个细胞。
这个时候可以采用 Image J 的水洗功能。
步
骤如下：Image 宀Binary 宀Watershed 。
如下图的蓝色箭头所示， 这些是本来计数成一个的细胞，经过水洗之后，更加精确地 被计数成了 2 个细胞。
然后，就可以正式开始分析了。
步骤 如下：Analyze 宀Analyze Particles 。
在得出最后的结果之前，
亮绿色耀眼荧光。
弱（ +）=1 ， 中（ ++ ）
=2，强（ +++） =3。
至少随机观察5-10个HPF 。
然后根据（
+)% x 1 +(++)% 1.5 者为 (+++) 。
4.
还有一些选项需要选择。
如果想要计数全部的细胞，那么Size
项里面选择“0-infinity ”。
Circularity 的默认值为“ 0.00-
1.00”。
般就取默认值。
最后的结果如下图所示。
软件自动测量了每个细胞的大小。
这里因为是二维图像，所以就是每个细胞的面积。
然后计数了一共有72 个细胞，总面积为21286.00，
平均大小为295.64。
免疫组化是个苦活，时间长，步骤多，
还要经常接触有毒致癌物质。
大家辛辛苦苦染出了漂亮的片子，最后都希望
得出自己想要的结果。
以上，毛博介绍了些自己的心得体会。
希望广大的实
验狗们都能做出自己想要的结果，早点发文章。
非特异性染色的八大原因然而，结
果却未必都是那么如意的，常常出现下面这种状况，好好的体问题，真的是
一分钱一分货啊！
张片子染得脏脏的，这就是最常见的非特异性染色。
1. 抗抗用多克隆抗体容易出现非特异性染色，建议用高纯度，高效价的针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
单克隆抗体很贵，不过结果真的很好。
尤其是背景非特异性染色不会太深。
真是一分价钱一分货。
一抗过期也会造成杯具，所以要注意抗体的有效期。
2. 抗体浓度过高/孵育时间过长一抗浓度太高也是出现非特
异性染色的常见原因。
解决的办法就是预实验。
每次使用新抗体前应该多做
预实验，摸索出最理想的工作浓度，不能简单地按照说明书来用。
另一个常
见原因就是孵育时间过长。
解决的办法就是定时器。
加上抗体后，立刻调好定时器，提醒自己及时终止反应，就会避免这个问题。
3. DAB 染色时间太长/变质DAB 的孵育时间过长，会造成背景非特异性染色。
DAB 的显色时间不是一成不变的，主要靠自己在显微镜下盯着，一旦出现浅浅的棕色的时候，就要马上冲洗。
出现棕色的时间过短，表明抗体浓度过高；出现棕色的时间过长，表明抗体浓度过低。
DAB 要保存于避光干燥
的地方，现用现配，临用前才加入H2O2。
图1就冲洗的有
些晚了；图2 就是刚刚好，染色效果棒棒哒!4. 内源性酶和生物素内源性酶和生物素也会造成非特异性染色，特别是些内源性酶生物素含量丰富的组织，如肝脏，肾脏，脾脏等。
处理的办法为：灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑(24 mg/mL )加入底物液中，并保持PH 值在7.6-8.2，即
能除去大部分内源性碱性磷酸酶；对于酸性磷酸酶，可以用
50 mmol/L 的酒石酸抑制；对于内源性过氧化物酶，可以用
0.9%的双氧水来灭活。
对于内源性生物素，染色前将切片浸
于25卩g/mL亲和素溶液中15 分钟，PBS 清洗15 分钟后即
可染色。
也可以24 mg/mL 的卵白素封片15分钟。
5. 组织变干
子染太多片子的时候，容易出现这种情况。
解决的办法就是不要贪多嚼不烂。
一次少染几张。
还有就是试剂充分覆盖组织，超出组织边缘2 mm。
然后用PAP笔在组织周围画
个圈圈，把修复液圈在里面。
避免修复液流走。
圈圈应该距离组织边缘3-4 mm。
6.浸泡时间过长
切片在缓冲液或修复液里面浸泡过夜，也会引起杯具。
这都是偷懒的做法。
但是有时候也是可以偷一下懒的。
毛博的独门秘技就是4°C 冰箱。
只要把容器放在4°C 冰箱里，过夜完全没有问题。
7. 清洗不充分清洗一定要充分。
PBS 液一定要双蒸水新配，用之前再次测
PH 值。
缓冲液用0.05 mol/L 的Tris-HCL , 0.15 mol/L 的NaCI 即可。
如果加一点去垢剂Tween-20 就更好了。
8. 封闭血清问题
是否选择了正确的封闭血清。
原则是选择二抗动物的非免疫稀释为3- 1 0%的溶液孵育切片，37°C 10-30分钟。
这里不用
血清，例如二抗是羊抗兔，就要选择非免疫羊血清。
用PBS 洗，直接甩掉即可。
毛博再贡献一个独门绝招，直接用奶粉也可以。
用5%的脱脂奶粉就可以了。
而且效果还不错。
怎
么样？简单吧。
师傅领进门，造化看个人了。