叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定分光光度法
叶绿素含量的测定分光光度法叶绿素是植物和一些原生生物中重要的光合色素之一，它在光合作用中起到接收和转换光能的关键作用。
测定叶绿素含量可以帮助我们了解植物的光合效率和健康状况，以及研究光合作用的机制和调控。
分光光度法是一种常用的测定叶绿素含量的方法，本文将介绍该方法的原理、实验步骤和数据分析。
一、原理分光光度法测定叶绿素含量的原理是基于叶绿素对光的吸收特性。
叶绿素分子可以吸收特定波长的光，特别是蓝光和红光，而对绿光的吸收较弱。
利用分光光度计测量叶绿素溶液在不同波长的光下的吸光度，可以通过比较吸光度与叶绿素浓度的标准曲线，计算出待测样品中叶绿素的含量。
二、实验步骤1. 制备叶绿素提取液：将适量的鲜叶片（去除茎和大的叶脉）放入离心管中，加入少量酒精，并用研钵捣碎，使叶绿素释放到酒精中。
然后用酒精将研钵中的残渣洗入离心管中，最后用酒精将叶绿素完全溶解。
注意，酒精的使用要避免火源。
2. 离心沉淀：将叶绿素提取液离心10分钟，以沉淀残渣和悬浮物。
3. 分光光度计测量：取离心后的叶绿素提取液，用分光光度计在特定波长下（如645 nm和663 nm）测量其吸光度。
记录吸光度值。
4. 制备标准曲线：取不同浓度的叶绿素标准溶液，用同样的方法测量其吸光度，记录吸光度值。
5. 计算叶绿素含量：根据标准曲线，将待测样品的吸光度值代入，通过计算叶绿素浓度的公式，得出叶绿素的含量。
三、数据分析1. 标准曲线的绘制：将各个标准溶液的叶绿素浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标，绘制曲线。
利用标准曲线可以通过待测样品的吸光度值，反推出其叶绿素的浓度。
2. 计算待测样品中叶绿素的含量：根据标准曲线，将待测样品的吸光度值代入，通过计算叶绿素浓度的公式，得出叶绿素的含量。
四、注意事项1. 实验中应尽量避免阳光直射，以免光线对实验结果的干扰。
2. 操作时应注意安全，避免酒精接触到火源。
3. 叶绿素提取液的制备应充分溶解，避免残渣和悬浮物的影响。
叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定之答禄夫天创作一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C 和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在分歧波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在分歧波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。
这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、叶绿素b的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm处。
已知在波长663nm下叶绿素a、叶绿素b 在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。
根据加和性原则列出以下关系式：A663=82.04Ca+9.27Cb（1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2）式（1）（2）A 663nm 和A645nm 为叶绿素溶液在663nm 和645nm 处的吸光度，C a C b 分别为叶绿素a 、叶绿素b 的浓度，以mg/L 为单位。
解方程（1）（2）组得C a 2 A 663—2.59 A 645 (3) C b =22.88 A 645—4.67 A 663 (4) 将C a +C b 相加即得叶绿素总量C TC T ＝ C a 十C b ＝20.29A 645—5 A 663 (5)从公式（3）、（4）、（5）可以看出，，就可计算出提取液中的叶绿素a 、b 浓度另外，由于叶绿素a 叶绿素b 在652nm 的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为），也可以在此波长下测定一次吸光度（A 652）而求出叶绿素a 、叶绿素 b 总量所测定资料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算： C T ＝5.341000652 A (6)有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。
实验10叶绿素含量的测定
叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶 剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡提取。 叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长旳光有最大吸收， 用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液旳吸光度(也 称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下旳吸收系数即 可计算叶绿素含量。 利用分光光计测定叶绿素含量旳根据是Lambert-Beer 定律，即当一束单色光经过溶液时，溶液旳吸光度与溶 液旳浓度和液层厚度旳乘积成正比。其数学体现式为： A=Kbc 式中： A为吸光度；K为吸光系数；b为溶 液旳厚度；c为溶液浓度。
叶绿素a、b旳丙酮溶液在可见光范围内旳最大吸收峰 分别位于663、645nm处。叶绿素a和b在663nm处旳吸 光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g·L-1时旳 吸光度）分别为82.04和9.27；在645nm处旳吸光系数 分别为16.75和45.60。根据Lambert-Beer定律,叶绿素 溶液在663nm和645nm处旳吸光度（A663和A645）与 溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十 b，单位为g·L-1），旳关系可分别用下列方程式表达：
叶绿素含量旳测定
一.试验原理
根据叶绿体色素提取液对可见光谱旳吸收， 利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度， 即可用公式计算出提取液中各色素旳含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液旳吸光 度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即 A＝αCL.式中：α百分比常数。当溶液浓度以百 分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质 旳吸光系数。多种有色物质溶液在不同波长下 旳吸光系数可经过测定已知浓度旳纯物质在不 同波长下旳吸光度而求得。
漏斗、大试管
三. 试验环节
叶片洗净、吸干、去大叶脉 ↓
称0.5g叶用丙酮研磨 ↓
叶绿素含量的测定方法
叶绿素含量的测定叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，叶绿素含量的测定无论是在生理上，还是在选育品种以及抗性研究等方面都很有必要。
叶绿素含量的经典测定方法是光电比色法，即用光电比色计以无机有色溶液为标准进行比色测定。
该方法不仅要配制无机标准溶液，而且不能对溶液中不同色素分子进行定量测定；分光光度法则不需配制标准溶液，又可对溶液中不同色素分子进行定量测定，已得到广泛应用。
一、原理分光光度法测定叶绿素含量，就是利用叶绿素 a和叶绿素b吸收光谱的不同，测定各特定峰值波长下的光密度，再根据色素分子在该波长下的消光系数，计算出浓度。
叶绿素 a、叶绿素b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于 663nm、 645nm处，同时已知叶绿素a和叶绿素b在663nm处的消光系数分别为82.04和9.27；在645nm处的消光系数分别为16.75和45.60。
这样叶绿素a和叶绿素b的浓度与他们在663nm、645nm处的光吸光密度的关系可用下式表示：D663=82.04C a+9.27C bD645=16.75C a+45.60C b式中D663和D645分别为叶绿素溶液在波长663nm、645nm处的光密度；C a、C b分别为叶绿素a和叶绿素b的浓度，单位g.·L-1。
解方程可得到：计算：C a=12.7D663-2.59D645C b=22.9D645-4.67D663C a+b=20.3D645+8.04D663C a ,C b分别为叶a和叶b的浓度，C a+b为叶a和叶b的总浓度，单位为mg·L-1所测材料单位重量或单位面积的叶绿素含量可按下式进一步计算：叶绿素含量（mg·L-1或mg·dm-2）= C*VA*1000式中C：叶绿素浓度（mg·L-1）；V：提取液总体积（ml）；A：叶片鲜重（g）或面积（dm2）二、丙酮乙醇混合液法提取叶绿素：药品：丙酮：乙醇按1：1体积混合成浸提液仪器：分光光度计-1-1-1方法：丙酮乙醇混合液法1．将丙酮、无水乙醇按1：1比例配成混合浸提液。
叶绿素含量的测定
Cb=24.96 A649—7.32A665(11)
Cx.c＝ (12)
2、材料、仪器设备及试剂
（一）材料
新鲜（或烘干）的植物叶片。
（二）仪器设备
1.分光光度计；2.电子顶载天平（感量0.01g）；3.研钵；4.棕色容量瓶；5.小漏斗；6.定量滤纸；7.吸水纸；8.擦境纸；9.滴管。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、叶绿素b的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm处。已知在波长663nm下叶绿素a、叶绿素b在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据加和性原则列出以下关系式：
A663=82.04Ca+9.27Cb（1）
解方程16632596454672029a645805从公式345可以看出就可计算出提取液中的叶绿素ab浓度另外由于叶叶绿素b在652nm的吸收峰相交两者有相同的吸光系数均为305也可以在此波长下测定一次吸光度a652而求出叶绿素a叶绿素总量所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算
四、实验结果计算与分析
按公式(10)、(11)、(12)（如用80%丙酮，按公式7、8、9）分别计算绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的浓度（mg/L）。(10)、(11)式相加即得叶绿素总浓度。
叶绿素含量测定方法
叶绿素含量测定方法一、引言叶绿素是植物体内的一种重要的生物色素，对于植物的光合作用和生长发育有着至关重要的作用。
因此，测定叶绿素含量对于研究植物生理生态学、环境保护等领域具有重要意义。
本文将介绍几种常用的叶绿素含量测定方法。
二、材料与仪器1. 乙醇：纯度为95%。
2. 醋酸：纯度为99%。
3. 氯仿：纯度为99%。
4. 石油醚：纯度为95%。
5. 甲醛：纯度为37%。
6. 碳酸钠：分析纯。
7. NaOH溶液：浓度为0.1mol/L。
8. 蒸馏水：去离子水或超纯水均可。
9. 离心管、比色皿、移液管等实验器具。
三、方法1. 乙醇法步骤：（1）取适量新鲜叶片，洗净后切成小段；（2）加入95%乙醇中，放置在室温下静置20-24小时；（3）将样品离心，取上清液；（4）将上清液转移到比色皿中，加入等体积的95%乙醇；（5）用分光光度计在663nm和645nm处测定吸光度，计算叶绿素含量。
2. 醋酸法步骤：（1）取适量新鲜叶片，洗净后切成小段；（2）加入80%醋酸中，放置在室温下静置24小时；（3）将样品离心，取上清液；（4）将上清液转移到比色皿中，加入等体积的80%醋酸；（5）用分光光度计在652nm和665nm处测定吸光度，计算叶绿素含量。
3. 氯仿-甲醛法步骤：（1）取适量新鲜叶片，洗净后切成小段；（2）加入95%甲醛中，在水浴中加热至90℃保持10分钟；（3）将样品离心，取上清液；（4）将上清液转移到比色皿中，加入等体积的氯仿，并振荡混合均匀后静置10分钟；（5）用分光光度计在649nm和665nm处测定吸光度，计算叶绿素含量。
4. 石油醚-乙醇法步骤：（1）取适量新鲜叶片，洗净后切成小段；（2）加入石油醚中，放置在室温下静置2-3小时；（3）将样品离心，取上清液；（4）将上清液转移到比色皿中，加入等体积的95%乙醇；（5）用分光光度计在663nm和645nm处测定吸光度，计算叶绿素含量。
5. NaHCO3-NaOH法步骤：（1）取适量新鲜叶片，洗净后切成小段；（2）加入NaHCO3-NaOH缓冲液中，在冰箱中保持暗处理2小时；（3）将样品离心，取上清液；（4）将上清液转移到比色皿中，并用蒸馏水稀释至一定浓度；（5）用分光光度计在665nm处测定吸光度，计算叶绿素含量。
叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定(分光光度法)一、直接浸取法1.将新鲜的小麦叶片剪成0.2cm左右的细丝或小块混合均匀后，称取0.1—0.2g，放入25ml的容量瓶或具塞试管中。
2.在容量瓶或试管中加入0.5ml纯丙酮和10—15ml 80%的丙酮，并仔细将粘附在瓶壁边缘的叶子碎末洗到丙酮溶液中，盖上瓶塞，室温下置暗处浸提过夜，其间摇动3—4次3.次日取出容量瓶，观察叶组织已全部变白时，表示叶绿素已浸提干净，然后用80%丙酮定容至25ml，过滤或离心后，波长645nm，663nm，652nm 比色二、研磨法根据朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律，某有色溶液的吸光度A值与其中溶质浓度C以及光径L成正比，即A＝aCL（a为该物质的吸光系数）。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光值可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下的吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素提取液中叶绿素a、b含量，只需测定该提取液在2 个特定波长下的吸光度度值，并根据叶绿素a与b在该波长下的吸光系数即可求出各自的浓度。
在测定叶绿素a、b含量时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、b的80 ％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm 和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04 和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：A663=82.04Ca +9.27Cb (1)A645=16.75Ca+45.6Cb (2)式中A663、A664分别为波长663nm和645nm处测定叶绿素溶液的吸光度值；Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(g/L)。
解联立方程(1)、(2)可得以下方程：Ca=0.0127A663-0.00269A645 (3)Cb=0.0229A645-0.00468A663 (4)如把叶绿素含量单位由g/L改为mg/L，(3)、(4)式则可改写为：Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645 (5)Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663 (6)叶绿素总量CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663 (7)叶绿素总量也可根据下式求导A652=34.5×CT由于652nm为叶绿素a与b在红光区吸收光谱曲线的交叉点(等吸收点)，两者有相同的比吸收系数（均为34.5 ），因此也可以在此波长下测定一次吸光度（A652）求出叶绿素总量：CT(g/L)=A652/34.5CT(mg/L)=A652×1000/34.5 (8)因此，可利用(5)、(6)式可分别计算叶绿素a与b含量，利用(7)式或(8)式可计算叶绿素总量。
叶绿素含量测定方法
叶绿素含量测定方法叶绿素是一种存在于植物和一些浮游植物中的绿色色素，其主要功能是吸收并转化太阳能，参与光合作用。
叶绿素含量是评估植物光合能力和健康状况的重要指标，因此测定叶绿素含量对于研究植物生理学、生态学以及农业领域等具有重要意义。
目前，常用的测定叶绿素含量的方法主要有光谱法、色素提取法和光度法等。
下面将介绍其中的几种常见方法。
1.光谱法光谱法是通过测定叶绿素在特定波段下吸光度的变化来间接推算得到叶绿素含量的方法。
不同波段吸光度值之间存在一定的线性关系，通过建立吸光度与叶绿素含量的标准曲线，可以快速准确地测定样品中的叶绿素含量。
常见的仪器有分光光度计、近红外分析仪等。
2.色素提取法色素提取法是将叶片中的色素溶解出来，然后根据提取溶液的吸光度或荧光强度来测定叶绿素的含量。
常用的溶剂有乙醇、二甲基亚砜等。
该方法具有简单、快速、操作方便等优点，但需要注意的是不同溶剂对叶绿素的提取效果可能不同，需要选择适合的溶剂。
3.光度法光度法是直接测定叶绿素溶液的吸光度或荧光强度来推算叶绿素的含量。
其中叶绿素吸光度法是通过测定在特定波长下叶绿素溶液的吸光度值，利用比色法或定量法来计算出叶绿素的含量；而叶绿素荧光法则是通过激发叶绿素分子产生荧光，然后测定荧光强度来推算叶绿素的含量。
这两种方法操作简单，结果稳定可靠。
除了以上方法外，还有一些新的测定叶绿素含量的方法正在不断研究和发展，如高效液相色谱法、激光诱导荧光法等。
这些方法具有高灵敏度、高分辨率、可同时测定多种色素等特点，适用于复杂体系和微量叶绿素的测定。
无论采用何种方法测定叶绿素含量，需要注意的是在测量前，应选择新鲜健康的叶片，避免叶片受损和老化对测量结果的影响；同时要控制样品之间的处理和测量条件的统一性，保证结果的准确性和可比性。
总之，叶绿素含量的测定方法有多种选择，根据实际需要选取合适的方法进行测定。
这些方法可以应用于对植物的生长状态、光合能力以及环境胁迫的评估，对于植物生理研究和农业生产具有重要意义。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
叶绿素含量的测定
一、 实验目的
1. 了解分光光度计的工作原理；
2. 掌握不同型号分光光度计的操作方计；
3. 通过本实验的学习掌握叶绿素含量测定的一种常见的方法------分光光度法。
二、 实验原理
叶绿素是脂溶性色素，主要存在于以叶绿体为首的色素体中。
在活体中，叶绿素与脂蛋白结合并受到还原系统的保护，对氧和光是稳定的。
叶绿素的80%丙酮提取液在波长663nm ，645nm 有吸收峰，叶绿素a 和叶绿素b 的浓度符合以下公式：
C a =0.0127A 663-0.00259A 645
C b =0.0229A 645-0.00467A 663 浓度单位是：g/L
C a =12.7A 663-2.59A 645
C b =22.9A 645-4.67A 663 浓度单位是：mg/L
叶绿素总浓度为： C T =C a +C b
若以试液中色素含量来表示，则
1000
)()()/(/⨯⨯=g ml L mg C ）g （mg 样品重提取液总体积鲜样叶绿素含量
三、 仪器、试剂和材料
1. 仪器
紫外-可见分光光度计、研体、25ml 容量瓶、玻璃漏斗、玻璃棒、皮头滴管
2. 试剂
丙酮（分析纯）、85%丙酮、80%丙酮
2. 材料
滤纸、石英砂、碳酸镁
四、操作步骤
1. 在遮光条件下取出等测样品，剪碎，混匀，称取鲜样0.1-0.5g；
2. 样品置于研钵内，加入少量碳酸镁和石英砂，加入一定体积的丙酮研磨匀浆，再加85%丙酮适量继续研磨至组织白色；
3. 经铺有滤纸的漏斗将匀浆液转入25ml的容量瓶中，并用80%的丙酮分次清洗研钵和滤纸，最后用80%的丙酮定容。
4. 以80%的丙酮为参比液，在663和645nm波长处测定吸光值（A应在0.2-0.8范围内，浓度过大应用80%丙酮适当稀释）。
五、结果处理
按照公式计算出叶绿素a和叶绿素b的浓度，再计算出叶绿素的含量。
六、注意事项
1. 在活体内，结合态叶绿素是稳定的，组织一经破坏，叶绿素易被光解。
因此，抽提和测定工作应尽可能避光快速完成。
2. 对含有大量酸性液泡的样品，应首先加入微碱性的缓冲液，仔细研磨后加入丙酮进行抽提。
3. 分光光度计的精度对测定的结果有至关重要的影响，使用前对仪器进行校正。
七、思考题
1. 当溶液中有两种成分共存时，利用分光光度计进行测定时，如何选择测定波长？
附属实验：
1.溶剂极性对有机物精细结构影响
苯-环己烷、苯-乙醇、苯-水
2.溶剂pH对光谱的影响
苯酚、苯酚—H+（pH=6）、苯酚—OH-（pH=10）。