2011 基因工程动物模型
分子生物学课件-基因打靶和遗传修饰动物模型
1. Vector construction
Neomycin belongs to aminoglycoside class of antibiotics that contain two or more aminosugars connected by glycosidic bonds.
1. Vector construction
The BIG Breakthroughs
到1987年，T。
到目前為止，運用基因同源重組、非同源末端 連接（non- homologous end-joining, NHEJ）或 同源 指導修復（homology-directed repair, HDR ）進 行基因敲除（替換）依然是構建基因敲除 （遺傳 修飾）動物模型中最普遍的使用方法。
Non-homologous DNA Flanked by Homologous DNA
a
b
c
d
a'
b'
c'
d'
a
b'
c'
d'
3. Homologous recombination
❖Cre/loxP System or Cre-Lox recombination
Cre (Causes Recombination) ; loxP (locus of crossing (x) over, P1)
- results in: - endogenous DNA replaced with exogenous - specific - targeted - copy number = 1
3. Homologous recombination
遗传工程动物模型ppt课件
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
5. 在医学中的应用
✓遗传病研究 ✓肿瘤的研究 ✓生物制药
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列的调控；因此，只有通过转基因的动物 才有可能研究基因的表达、调控及基因之 间的相互作用。
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➢ 进行功能基因组学的研究，研究外源基 因在动物整体水平的表现调控规律。
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二 、 技术手段
➢ 显微注射转基因技术 ➢ 基因定位突变技术 ➢ 化学或放射诱变技术
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（二）胚胎干细胞（ES）法
ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培 养建立起来的多潜能细胞系。
将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的 早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。
3. 缺 点：
如何应用基因编辑技术进行动物模型建立
如何应用基因编辑技术进行动物模型建立基因编辑技术是一种革命性的生物技术，它已经广泛应用于动物模型的建立。
通过利用基因编辑技术，科学家可以对动物的基因组进行精确的改造，从而模拟人类疾病和研究基因功能。
本文将详细介绍如何应用基因编辑技术进行动物模型建立的方法与应用。
首先，基因编辑技术最常用的工具之一是CRISPR-Cas9系统。
这个系统利用CRISPR序列和Cas9蛋白质，可以在基因组中精确地编辑、插入或删除特定的DNA序列。
通过设计引导RNA (gRNA)，可以将Cas9蛋白导向到目标基因的特定位点，从而实现基因编辑。
这项技术的优点在于操作简单、高效，并且可以应用于多种不同的物种。
在建立动物模型时，第一步是选择合适的动物种类。
根据研究目的和模型需求，可以选择小鼠、大鼠、斑马鱼等模式动物。
小鼠是最常用的动物模型之一，因为它们与人类基因组相似度高，并且具有可调控的生殖周期。
大鼠与小鼠相比具有更大的体型和更强的生理相似性，适用于研究一些大型哺乳动物相关的疾病。
斑马鱼则是一种常用的无脊椎动物模型，其透明的胚胎和快速的发育周期使其成为研究发育生物学和遗传学的理想模型。
第二步是设计和合成适合的CRISPR-Cas9工具。
在设计引导RNA时，需要选择目标基因靶点，并确保gRNA能够准确地指向目标位点。
此外，还需要避免与其他基因的序列相互重叠，以减少不必要的副作用。
合成适当的CRISPR-Cas9工具后，可以采用经典的注射或转染技术将其导入到模型动物中。
注射或转染之后，下一步是筛选突变体。
由于CRISPR-Cas9系统在细胞中引入了突变，因此需要选择合适的筛选方法来检测突变的结果。
常用的筛选方法包括PCR、限制性酶切分析、DNA测序等。
这些筛选方法可以快速而准确地鉴定突变的细胞或个体，并用于后续的繁殖和后代分析。
在建立适用的动物模型后，研究人员可以进行一系列的实验来研究基因的功能、相关疾病的机制以及新药的测试。
例如，通过基因敲除或突变，可以模拟某些遗传疾病，并探究可能的治疗方法。
基因工程动物模型定制方案
基因工程动物模型定制方案概述基因工程动物模型是利用基因编辑技术对动物进行人为改良，使其具有特定的遗传特征，以用于科学研究、药物研发等应用领域。
定制一种合适的基因工程动物模型需要考虑多方面因素，包括基因编辑方法、目标基因的选择、动物品种的适用性等。
本文将从设计流程、技术路线、实验流程等方面对基因工程动物模型定制方案进行详细介绍。
一、设计流程1、确定研究目的定制基因工程动物模型的首要步骤是确定研究目的。
研究者需要明确自己的研究方向和目标，以便有针对性地选择合适的基因编辑方法和目标基因。
2、选择动物种类基因工程动物模型可以包括小鼠、大鼠、猪、猴等多种动物种类。
研究者需要根据自己的研究需求和目标选择合适的动物种类，考虑到动物的生活习性、生长速度、繁殖能力等因素。
3、选择基因编辑技术基因编辑技术包括CRISPR/Cas9、TALENs、ZFNs等多种方法。
研究者需要根据目标基因的特性和编辑效率选择合适的基因编辑技术，以确保编辑效果的准确性和稳定性。
4、选择目标基因研究者需要根据自己的研究目的和需要选择合适的目标基因进行编辑。
目标基因可以是与某种疾病相关的致病基因、某种生理过程相关的关键基因等。
5、确定编辑方案在选择了目标基因和编辑技术之后，研究者需要设计具体的编辑方案，包括编辑位点的选择、编辑方式的确定等。
编辑方案需要考虑到编辑效率、编辑精准度、编辑后是否会引发其他不良影响等因素。
6、建立动物模型在确定了编辑方案之后，研究者需要进行基因编辑实验，将编辑后的细胞移植到动物的受精卵中，从而建立基因工程动物模型。
建立动物模型需要严格控制实验条件，确保编辑效果的稳定性和准确性。
二、技术路线1、基因编辑技术基因编辑技术是定制基因工程动物模型的核心部分。
研究者需要根据目标基因的特性选择合适的基因编辑技术。
CRISPR/Cas9是目前最常用的基因编辑技术之一，它具有编辑效率高、操作简单等优点，适用于大多数动物种类。
对于一些特定的目标基因，也可以选择其他基因编辑技术，如TALENs、ZFNs等。
基因工程模式动物模型研究
基因工程模式动物模型研究随着科技的不断进步，基因工程模式动物模型研究正在成为一种越来越受关注的领域。
这种研究方式通过基因编辑技术来改变动物的基因组成，从而使得动物表现出基因编辑所带来的变化特征。
基因工程模式动物模型研究对于我们了解基因的功能和生物学的本质有着重要的意义，在医学领域、人类疾病的防治、药物研发等方面也具有广泛的应用价值。
一、基因工程模式动物模型的相关理论基因工程模式动物模型研究的基础理论主要包括基因编辑技术、人工合成生物学、以及出现的各种工具和技术，这些理论构成了我们对于基因工程技术和模式动物模型的认识。
其中，基因编辑技术是基因工程模式动物模型研究的核心技术，主要包括CRISPR/Cas9、ZFNs和TALENs三种，这三种技术都可以帮助我们对于动物基因组进行编辑和操控。
人工合成生物学则是研究如何设计和合成生物分子和生物系统，从而达到生物学领域一些关键问题的解决。
这种技术会认为将分子和生物学元件之间的联系和结构关系抽象化和繁衍化，将生物学中的“基因、蛋白质、信号传递等生物分子都遵循一定的规律，通过特定的方法进行操控”这种思想转变成程序化的设计而实现生物工程学的研究目的。
二、基因工程模式动物模型研究的应用意义基因工程模式动物模型研究对我们的生物学认识和医学研究都有相当重要的意义。
首先，我们可以通过操控动物的基因来实现对不同性状的控制和模拟，从而更好地了解这些性状的功能和本质。
例如，模拟人类疾病通过基因编辑技术将会有助于我们揭示疾病的本质并找到相应的治疗方法。
其次，基因工程模式动物模型研究可以为新药物的研发提供动物模型，从而更好地对药物的成效和安全性进行检测。
再者，基因工程模式动物模型研究在医疗方面的应用可以说是开创了全新的领域。
基因编辑技术可用于修复患有基因疾病的人的基因组，从而达到治愈疾病的效果。
而且除了针对疾病体现的单一基因进行修复之外，基因编辑技术还能够对DNA序列中的任意位置进行编辑，因此催生了大量基于基因编辑的个性化医疗方法。
基因工程课程综合实验转基因斑马鱼的构建
基因工程课程综合实验转基因斑马鱼的构建基因工程是一项对生物的基因进行精确调整的技术。
通过使用基因工程技术，人们可以设计出更加优良的生命体，并为生命体的研究提供更加有力的工具。
此前，学生们在课堂上只是通过书本等介质来学习基因工程的相关知识，而课程实验则更多的停留在理论层面，无法给学生们带来更加深刻的印象。
针对以上问题，一些高校开设了基因工程课程综合实验。
通过此课程，学生们可以在实验室中亲手操作各种基因工程实验，并更好的掌握相关的基因工程实验技术。
本文以某高校为例，介绍一项基因工程课程综合实验——转基因斑马鱼的构建，并从实验的背景、实验步骤和实验意义三个方面来进行详细剖析。
一、实验背景斑马鱼是一种热带淡水鱼，其生长发育周期短，幼鱼透明，移植简便等优点使它成为了许多生物学门类研究的模型生物。
斑马鱼表层神经细胞活动强烈，非常适合用来研究感知、运动和认知的神经环路。
因此，斑马鱼成为神经科学研究、药物筛选、疾病诊断等领域的重要模型生物。
转基因斑马鱼的构建是一项基因工程研究中的重要课题。
通过向斑马鱼中植入人类基因或与斑马鱼有关的基因，可以使得斑马鱼显示出人类疾病的症状，从而更好的研究这些疾病的发生和发展机制。
例如，植入人类神经退行性疾病相关基因的斑马鱼，可以展现出某些神经退行症的症状，可以更好地研究这些疾病的病理涅槃。
二、实验步骤1、设计转基因构和转基因斑马鱼的构建需要进行基因克隆，制备转基因构建质粒。
课程设计中的实验制备的是pPtre-3xFlag-Nf1（Nf1:神经母细胞瘤），这是一种携带3xFlag标签的神经母细胞瘤基因，可用于斑马鱼的转基因实验。
2、制备大量转基因质粒使用大肠杆菌进行转基因质粒大量制备，获得足够多的质粒进行后续操作。
Ptre-3xFlag-Nf1质粒用水切割得到15Kb和6.3Kb的两个DNA段，经过凝胶电泳后得到目标DNA。
3、定量测序分析对转基因质粒进行定量测序分析，保证重要区域为正确序列。
动物模型的建立与应用
五、严重联合免疫缺陷小鼠（Severe combined immunodeficient mice，SCID）
1. 1983年由美国学者Bosma首先发现于C.B-17近交系小 鼠，位 于16号染色体的scid的单个隐性突变基因所致。
2. 纯合scid基因导致编码免疫球蛋白重链（IgH）和T细胞抗原 受体基因（TCR）V-D-J基因重排异常，抑制B细胞和T和T 细胞前体的正常分化，造成T、B淋巴细胞自身不能分化成特 异性功能淋巴细胞，
循环中免疫球蛋白减少或缺损
C.B-17小鼠是BALB/cAnIcr小鼠的同源近交系，差别在 于该小鼠携带了C57BL/ka小鼠的免疫球蛋白重链Igh-1b 等位基因.
C.B-17小鼠的遗传背景与BALB/cAnIcr基本相同，其H-2 抗原均为H-2d.
此外目前已有C3H-SCID等其他品系遗传背景的SCID小 鼠出现.
孤立动物模型 Orphan disease models
孤立动物模型是指某种疾病最初在一些动物身上发现并 被研究，但到目前为止在人类自身体内无法证实。包括：马 立克氏病（Marek’s disease）, 多发性乳头瘤（Papillomatosis）, 牛 海绵状脑病（bovine spongiform encephalopathy）, 绵羊脱髓鞘性 脑白质炎（Visna virus in sheep）, 猫白血病病毒感染（feline leukemia virus）。
医学动物模型的分类
按产生原因分类
诱发性动物疾病模型：是指通过使用物理、化学、生物等致病 手段，人为地造成动物组织、器官或全身形成人类疾病动物模 型，在功能、代谢、形态结构等方面有所改变，即人为地诱发 动物产生类似人类疾病模型。 主要用途：药理学、毒理学、免疫学、肿瘤和传染病等。
人类疾病动物模型分类
疾病动物模型的种类 疾病动物模型的注意事项
学习重点
谢谢！
5.3基因工程高脂蛋白血症动物模型
5.3.1 转 基因小鼠 荷兰有一个Ⅲ型高脂蛋白血症家系，呈显性遗传。病人和 都增高，早发冠心病。在基因编码第120—126氨
基酸的基因缺失，称 3 。 1993年报告：从先证者切下基因和在肝细胞内所有必须的调节元件），克隆后制成溶液，原核注射获得的
转基因小鼠，常规食物就有高和，但无病灶。喂高和高，可达40—60,整个主动脉树病灶从泡沫细胞组成的 脂肪条纹到纤维斑块、钙化病灶都有。
缺点：在高胆固醇血症并发高甘油三酯血症，的异种杂交体没有发生高胆固醇血症。前者可能是人与兔种 系差异，后者则是生活环境的不同所引起的。
5.2 诱发型动脉粥样硬化模型
5.2.1食饵性动脉粥样硬化 家兔： 优点：家兔对高脂膳食敏感性高，对外源性胆固醇吸收率高，对高脂血症清除率低, 家兔在高脂血症一个月 后可造成动脉内皮损伤，2-3个月后可有斑块。 缺点: 家兔是草食动物, 其脂代谢与人有很大不同，病变主要分布在胸主动脉、冠状动脉小分支； 而冠状动 脉大分支不出病灶。病灶主要是血源性巨噬细胞源性泡沫细胞。
主要是基因工程小鼠: 小鼠基因组了解的很清楚，与人基因相同最多，在疾病表现型上小鼠与人类也十分相似。 小鼠体积小、生命周期短、繁殖快，操作方便。
分类： (1)转基因小鼠( ）
(2)基因敲除小鼠( ）
(3)基因替换小鼠（ ）
雄 原 核 注 射 转 基 因 小 鼠
基 因 敲 除 转 基 因 动 物
人类疾病动物模型分类
1、人类疾病动物模型概念
人类疾病动物模型是指生物医学研究过程中所建立起来的具有人类疾病模拟表现的动物实验对象及相 关实验材料。
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第十一讲基因工程模因工程模型梁虹中国医学科学院医学实验动物学研究所2011-10-28WASHINGTON, DC - The international MouseGenome Sequencing Consortium today announcedthe publication of a high-quality draft sequence ofthe mouse genome - the genetic blueprint of amouse - together with a comparative analysis ofthe mouse and human genomes describing insightsgleaned from the two sequ en ces. Th e paperappears in the Dec. 5 issue of the journal Nature.The Mouse Genome And The Measure of ManDecember 2002基因工程技术，包括基因打靶、基因沉默和转基因技术等首先在小鼠的基因修饰和品系培育上广泛使用，并产生了大量的基因剔除、转基因疾病小鼠模型和基因功能研究模型，成为生命科学研究、医学研究和药学研究的重要支撑条件，并推动了对生命规律的探索和医药研究的发展。
基因导入方式一、显微注射法在倒置显微镜下通过显微操作系统用注射针将DNA样品注射到受精卵雄原核中，利用外源基因整合到DNA中，从而得到转基因动物。
�特点：对DNA大小无限制，不需要载体，转基因成功率约20%，外源基因在小鼠染色体上常呈成串的头尾项链的多拷贝插入。
�缺点：外源基因的插入位点和插入拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变。
二、慢病毒感染法将具有一次性感染的病毒注射到小鼠受精卵透明带下。
�特点：转基因成功率和转基因表达率可达到70%以上，且大多为单拷贝或低拷贝整合。
�缺点：目的基因插入容量＜10kb，制备病毒需要一定的安全考虑。
三、精子载入法将精子与DNA混合，然后通过单精注射或IVF获得转基因小鼠。
1.2 原核注射与受精卵移植1.31.4 转基因小鼠外源基因表达的检测�染色体和基因水平：分离基因组DNA，进行Southern 杂交和PCR分析，以评估外源基因的整合情况。
�转录水平：Northern杂交，RT-PCR。
�蛋白质水平：Western印迹分析。
1.5 转基因动物应用1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达的时相；2、在活体内研究或发现基因的功能；3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究；4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型；5、遗传性疾病的研究；6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据；7、动物新品种的培育；8、基因工程产品的制备。
1.6 转基因技术存在的问题1、不能将外源基因定向地插入受精卵细胞染色体的特定部位；2、外源基因随机整合可能引起插入突变，破坏宿主基因组功能；3、外源基因随机整合在宿主染色体上的拷贝数不同，可能出现不同表现型；4、整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳定遗传。
基因打靶（gene targeting ），是利用DNA 同源重组原理，在基因组中的某一特定部位进行定点的基因重组，是研究基因的功能的有效手段。
包括基因敲除（gene knock out ）和基因敲入（gene knock in ）。
目前，基因打靶技术已经被广泛应用于几乎所有生物医学领域——从基础研究到新疗法，使得人类对于心脏病、癌症和糖尿病等多种疾病有了更加深入的了解。
美国犹他大学 马里奥.卡佩奇美国北卡罗来纳州大学 奥立佛.史密斯英国卡迪夫大学 马丁.埃文斯由于在基因打靶技术的贡献分享2007年诺贝尔生理学或医学奖。
第二节第二节基因打靶动物模型（嵌合体小鼠）•胚胎干细胞：ESC 是从早期胚胎内细胞团（ICM ）分离的一种具无限增殖能力和全向分化能力的细胞。
胚胎干细胞（Embryonic Embryonic Stem Stem Stem CellCell ，ES ) 全能性 是ES 细胞具有可塑性的基础；无限扩增性 为实验和应用提供了大量的原材料或工具；可操作性 导入异源基因，报告基因或标记基因，诱导基因突变，基因打靶或导入额外的原有基因使之过度表达。
Selectable Markers and Reporter �Select markerNeomycin phosphotransferase gene (neo R)(drug:G418)Puromycin selection (Puro)(drug:puromycin)�Reporter�-geo (LacZ and neo) was the most widely used reporter (X-gal stain）EGFP is now popularLength of Homology•1.7 kb or less of total homology resulted in 0 target clones using Hprt vectors.1.9 kb of total homology resulted in targeted clones。
Targeting frequency increased as the total length of homology increased up to 6.0 kb。
Increases in total homology greater than 6.0 kb did not increase the targeting frequency (Data from Hprt locus Hasty et al., 1991; MCB) Positive/negative Selection•Positive selection to identify all transformants (both targeted and non-targeted)•Negative selection to enrich for targeting events•A proportion of double selected ES cell clones are targetedMethods for Identifying Homologous Recombinants •PCR•Southern blotES cell injection into the blastocystsMouse ChimeraCre-lox P和FLP/FRT系统�Cre/loxP：来自P1噬菌体，Cre重组酶基因和loxP序列位于P1噬菌体基因组内，loxP是Cre酶的识别序列，FLP/FRT：来自酵母，FRT是FLT酶的识别序列。
�Cre（FLP）重组酶有删除/整合、倒位、转位等功能。
�基本策略是通过类似于基因敲除的方法将两个loxP位点同向引入到要删除的基因片段两侧。
The FLP recognition target (FRT)has the same architectureTissue-specific deletion strategyMouse Knock-ins–WHY?�Test function of a specific residue or domain �Create model for equivalent change indisease state�Tag protein�Test functional equivalence of genes�and many, many more…1. promoter trap vector2. Poly-A Trap VectorOne trap cloneWild mouseChimera mouseF1+/+ +/trap +/trap +/+IGTC–The International Gene Trap Consortium•GOALS�Create an international resource ofES cells with gene-trap insertions inmost genes�Develop a standardized identificationand annotation protocol for gene trap lines�Integrate gene trap insertion tags into public genome databases andbioinformatics sites�Facilitate public access to the gene trap insertion lines and gene trapinformation IGTC Cell lines in database: 63244 IGTC Ensembl genes represented: 8176 IGTC current genome coverage: 41.9102 %RNA干涉实验的基本过程1、确定干涉靶点选择目标基因是进行RNA干涉的第一步，根据靶基因序列，确定干涉的具体靶点。
一般作为干涉的靶点序列应具备：①、目标RNA上被干涉的靶点应尽量避开蛋白结合位点②被干涉的靶序列一般应具有AA（N19）TT或AA（N21）序列特征，同时G：C比为50%左右③被干涉的靶序列应该是特异性的，和其它RNA没有同源性。
2、双链干涉RNA的合成；化学合成法；体外转录法3、双链干涉RNA对目标RNA的干涉：首先，将干涉RNA转染到靶细胞；其次，对目标RNA干涉程度进行分析：可采用RT-PCR在RNA水平上监测、Western blot在蛋白质水平上进行监测RNAi实例：Target gene：c-myc�查找靶基因mRNA�利用网络在线支持，寻找siRNA序列�根据目的选择实现RNAi的策略：推荐载体法。
�根据查找的siRNA序列，合成长链oligo�构建载体�转染�检测效应（包括干扰效应和生物学效应）。