补体、补体检测.
补体检测及应用
1:4
4444 4 4 3
2
0
1:8
4444 4 3 2
1
0
1:16
4444 3 3 2
±
0
1:32
4444
3
2
±
0
0
1:64
4444 2 1 0
0
0
1:128
4210 0 0 0
0
0
1:256
3100 0 0 0
0
0
1:512
0000 0 0 0
0
0
抗原对照
0000 0 0 0
0
0
注:1、2、3、4分别表示补体结合反应强度 ; 0表示全溶血,补体结合试验阴性
（二）试验方法
1.2%-5%绵羊红细胞（SRBC）的配置
2.溶血素：抗绵羊红细胞抗体，是以SRBC免疫 家兔所得的兔抗血清。试验前要进行溶血素的 稀释和滴定。
3.稀释缓冲液:PH7.2-7.4磷酸盐缓冲液 Ca+2、Mg
+2
不同稀释度溶血素的配置
最终稀释度 稀释液(ml) 稀释度
溶血素（ml）
3
0.20
1.30
4
0.25
1.25
5
0.30
1.20
6
0.35
1.15
7
0.40
1.10
8
0.45
1.05
9
0.50
1.00
10
0,00
1.50
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
第18章-补体检测及补体参与试验
系统性红斑狼疮（SLE)•病因：•遗传•内分泌(雌激素（受体），催乳素、生长激素）•感染(麻疹、副伤寒、单纯疱疹、风疹、EB病毒等）•物理因素（紫外线等）•药物•免疫异常（BC功能亢进，TC失衡，CK表达异常，淋巴细胞凋亡异常）•致病机制：•机体产生大量抗细胞核样物质(DNA、RNA、核内可溶性蛋白）的抗体，形成大量IC，沉积于周身毛细血管，关节滑膜，心脏瓣膜等处，导致全身性损伤实验室检查•1.血常规：三系减少（RBC、WBC、PLT）•2.血沉：增快•3.毛细血管镜检查•4.免疫血清学检查：•狼疮细胞、类风湿因子、补体等补体检测•1.补体是什么？•2.为何要检测补体？•3.如何测？有哪些方法？第十八章补体的检测及补体参与的试验Contents第一部分 补体第二部分 补体的检测第一节 血清总补体活性测定第二节 单个补体成分的测定第三节 补体受体的测定第三部分 补体参与的试验掌握：补体的概念及其理化性质；血清总补体活性测定（CP-CH50）的实验原理；补体结合试验的原理。
熟悉：CP-CH50方法、结果判定及方法评价；单个补体成分测定。
了解：其他第一部分 补 体补体的发现1补体的生物学特性2补体系统的激活、调控3补体的生物学功能4补体与疾病的关系5Jules Bordet (1870-1961),Discoverer of Complement （ Nobel Prize for Physiology or Medicine in 1919）19世纪末，在发现抗体后不久，Bordet 通过霍乱弧菌溶菌实验发现，新鲜血清中存在一种不耐热的成分，可辅助特异性抗体介导的溶菌作用。
Ehrlich 同时独立发现了类似现象，他认为这种因子是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件，故将其命名为补体一、补体的发现正常豚鼠血清（溶菌）感染霍乱弧菌的豚鼠的血清霍乱弧菌菌液（溶菌）感染霍乱弧菌的豚鼠的血清56℃30分钟（凝集）（溶菌）（凝集）Presumptions:1. There is a component in the fresh serum that helps the antibody to lyse the bacteria.2. The chemical property of this component is not stable.3. This component is not antigen specific.补体（complement,C)：存在于人和动物血清、组织液和某些细胞上的一组与免疫有关，但无抗原特异性，激活后具有酶样活性的，不耐热的糖蛋白。
临床医学检验技士备考资料：溶血反应的检测试剂
临床医学检验技士备考资料：溶血反应的检测试剂临床医学检验技士备考资料：溶血反应的检测试剂溶血反应的检测试剂(一)补体检测血清补体水平或补体活性时需要从受检者采血及分离血清。
做补体结合试验时多采用豚鼠血清作为实验用补体的来源。
因为补体在体外极易衰变，所以检测补体活性的血清标本和作为补体试剂的血清必须新鲜。
受检者一般做静脉采血，在动物可做心脏采血。
血清分离后应及时使用，最好在当日用完。
必须保存时采用小量分装的办法，置-70℃下可保存数月，避免反复冻融。
冻干制品可长期保存，但其活性都不同程度地比新鲜血清降低。
以豚鼠血清作补体来源时，应考虑到个体差异。
为了确保血清中补体的有效活性，必须取3只以上豚鼠的血清混合后使用。
(二)绵羊红细胞从绵羊颈静脉无菌采血，抽出血液后立即小心地注入放有璃珠的无菌干燥三角烧瓶中，充分旋摇15～20min，以除去纤维蛋白。
也可将羊血与等量或2倍量的'Alsever血液保存液混合，既有抗凝作用，又适于储存;分装后置4℃，可使用3周。
实验前，取适量抗凝血，加入8～10倍的生理盐水，轻轻混匀后2000r/min离心5min;弃上清，沉淀的红细胞用生理盐水再洗一次，这时上清为无色澄清，如显红色说明有溶血现象，应更换新鲜羊血;第三次用缓冲液洗涤，弃上清，取压积红细胞用缓冲液配制SRBC悬液，使用浓度一般为2%～5%。
为使红细胞浓度标准化，可吸取少量红细胞悬液，中入20～30倍的稀释液中，在542nm波长比浊，以吸光度为标准调整红细胞浓度。
(三)溶血素溶血素即抗绵羊红细胞抗体，多是以绵羊红细胞免疫家兔而得到兔抗血清。
一般没有必要进一步提纯抗体，但在试验前需先进行加热56℃30min或60℃3min以灭活补体。
由于补体溶血试验及补体结合试验均是比较精密的试验，其结果与溶血素的效价有关，所以试验需要滴定溶血素效价;在制备抗血清的过程中，于动物采血前和分离抗血清后也需要滴定溶血素效价。
1.溶血素稀释稀释溶血素时，要先对效价有个大概的估计，以便确定稀释度的范围。
临床免疫学补体检测及应用
第十九章补体检测及应用本章考点1.概述2.补体的活化途径3.有关补体测定的试验4.补体测定的应用补体是存在于人和脊椎动物正常新鲜血清及组织液中的一组具有酶样活性的球蛋白。
补体系统是补体加上其调节因子和相关膜蛋白共同组成一个反应系统，称为补体系统。
补体系统参与机体的抗感染及免疫调节，也可介导病理性反应，是体内重要的免疫系统和放大系统。
第一节补体系统的组成和性质一、命名根据l968年WH0命名委员会对补体系统进行了统一命名。
参与补体激活经典途径的固有成分按其被发现的先后顺序分别称Cl、C2、……C9。
Cl由Clq、Clr、Cls 三种亚单位组成；补体系统旁路激活途径及调节因子中另一些组分以英文大写字母表示，如B因子、D因子、P因子、H 因子等；补体调节成分多以其功能进行命名，如C1抑制物、C4结合蛋白、衰变加速因子等；补体活化后的裂解片段以该成分的符号后面加小写英文字母表示，如C3a、C3b等；具有酶活性的成分或复合物在其符号上划一横线表示，如、，灭活的补体片段在其符号前面加英文字母i表示，如iC3b等；对补体受体以其结合对象命名，如CLrR、C5Ar、对C3片段受体则用CRl、CR2……CR4表示。
二、分类构成补体系统包括30余种活性成分，按其性质和功能可以分为三大类：1.在体液中参与补体活化级联反应的各种固有成分；2.以可溶性形式或膜结合形式存在的各种补体调节蛋白；3.结合补体片段或调节补体生物效应的各种受体。
三、理化性质补体的大多数组分都是糖蛋白，且多属于β球蛋白，约占血清球蛋白总量的l0%；Clq，C8等为γ球蛋白；Cls，C9为α球蛋白。
正常血清中各组分的含量相差较大，C3含量最多，C2最低。
各种属动物间血中补体含量也不相同，豚鼠血清中含有丰富的补体，故实验室多采用豚鼠血作为补体来源。
补体性质不稳定，易受各种理化因素影响，如加热、机械振荡、酸碱、酒精等均可使其失活；在0℃～10℃下活性只保持3～4天，冷冻干燥可较长时间保持其活性；加热56℃30min可使血清中绝大部分补体组分丧失活性，称为灭活或灭能。
第十九章补体检测及应用
经典途径
2、补体激活的替代途径
替代途径的激活剂：某些细菌、革兰氏阴 性菌的内毒素、细菌的脂多糖、肽聚糖、 葡聚糖、酵母多糖、凝聚的IgG4和IgA聚 合物等。
激活过程：C3是启动替代途径并参与其 后级联反应的关键分子。 经典途径产生或自发产生的C3b与B因子 结合，血清D因子的作用，形成C3转化 酶（ C3bBb ）， 不稳定，与血 清 P 因 子 结 合 则 形 成 稳 定 的 C3 转 化 酶 （ C3bBbP ）； C3转化酶水解C3，形 成C5转化酶（ C3bnBb 或 C3bnBbP ）；
免疫调节作用 C3可参与捕捉并固定抗原，通过与抗原提呈细 胞上的CR1及CR2受体结合，使抗原易被APC处 理和提呈 作用于多种免疫细胞，调节细胞的增殖分化： C3b与B细胞表面CR1结合，促进B细胞增殖分 化 参与调节多种免疫细胞效应功能：NK结合C3b 增强ADCC作用
第二节 补体总活性测定
激活的特点： 可以识别自己与非己：C3b的中止与 激活 替代途径是补全权系统重要的放大机 制：替代途径C3转化酶对经典途径补 体的活化是一种放大机制。
3、MBL途径
激活物：病原微生物感染所诱导产生的急性期蛋白 ，如 MBL、CRP等。
激活过程：MBL与细菌的甘露糖残基结合；再与丝氨酸蛋 白 酶 结 合 ， 形 成 MBL 相 关 的 丝 氨 酸 蛋 白 酶 （ MASP-1 、 MASP-2），MASP具有与活化的C1q同样的生物学活性，可 水解C4和C2，形成C3转化酶；其后过程与经典途径相同。
甘 露 聚 糖 结 合 凝 集 素 （ mannan binding tectin，MBL） 途 径 ， 简 称 MBL途径：MBL结合至细菌而启动激 活的途径，此途径不依赖于抗原抗体 复合物的形成，在感染的早期就能发 挥免疫防御效应，为急性期蛋白途径。
免疫补体测定实验报告
免疫补体测定实验报告实验目的了解免疫补体测定实验的原理和步骤，掌握实验操作技巧，培养动手能力和数据分析能力。
实验材料和仪器- 血清标本- 96孔板- 微量移液管和移液器- 酶标仪- 正常兔血清- 抗兔血清- 反应溶液：0.01M PBS（pH=7.4）- 辅助溶液：0.1%鸡蛋清溶液- 免疫附加试剂盒（ELISA Kit）实验步骤1. 准备工作：- 预热酶标板洗涤缓冲液至37C；- 将试剂盒中的标准品和待测标本复苏。
2. 实验操作：1. 将标准品、待测标本和对照血清按照试剂盒说明稀释，并加入96孔板中；2. 加入酶标试剂，混匀后孵育1小时；3. 倒掉孵育液，用洗涤缓冲液洗板3次，每次吸干；4. 加入显色液，避光孵育30分钟；5. 加入终止液，避光混匀。
3. 结果测定：- 使用酶标仪测量各孔的吸光度（OD值）；- 计算样本中的免疫补体含量。
结果分析根据实验测得的吸光度值和标准品的吸光度-浓度曲线，可得出待测标本中免疫补体的含量。
实验结果的相关系数越接近1，说明实验结果的可靠性越高。
误差分析实验中可能存在的误差源包括：- 操作误差：如加样本和试剂时的体积误差；- 实验条件误差：如温度、湿度不稳定等；- 仪器误差：如酶标仪的测量误差。
在实验中应注意操作规范，严格控制实验条件，并使用优质可靠的仪器和试剂，以减小误差的影响。
实验应用免疫补体测定实验在临床诊断中具有广泛的应用，例如：- 检测血清中的免疫补体含量，以判断机体免疫功能的活性程度；- 鉴定自身免疫性疾病和补体相关性疾病；- 监测药物治疗的效果和疾病进展情况。
实验总结通过本次免疫补体测定实验，我们了解了实验的原理和步骤，并掌握了实验操作技巧。
实验结果与标准品的相关系数表明实验结果具有较高的可靠性。
在实验中，我们也发现了一些误差源，并提出了应对误差的策略。
免疫补体测定实验具有广泛的应用价值，在临床诊断中发挥着重要的作用。
我们希望通过不断学习和实践，不断提高实验操作技能和数据分析能力。
医学免疫学：第5 第6 第19 章 补体、补体检测及细胞因子 (2)
C4bp的抑制作用（C4 Binding Protein)
结合C4b，抑制C4b与C2的结合，防止C3转化酶的组装。 促进I因子对C4b的蛋白水解
四. 补体的生物学作用
在细胞表面激活并形成 MAC，介导溶细胞效应； 激活过程中产生的水解片段，介导各种生物学效应
1. 溶菌、溶解病毒和细胞的细胞毒作用
CH50(U/ml)=1/血清用量*稀释倍数
取10只试管，分别编号，按照下表加入各试剂
试管号 BBS 1：20稀释血清 2％SRBC 2U溶血素
补体溶血活性
1 1.40
0.10
0.5
0.5
200
2 1.35
0.15
0.5
0.5
133
置
3 1.30
0.20
0.5
0.5
100
37℃
4 1.25
0.25
2. 调理作用 C3b、C4b
3. 免疫粘附 C3b
4. 炎症介质作用 过敏毒素 C3a、C5a 趋化因子 C5a
第十九章 补体检测及应用
补体总活性测定
• 补体最主要的活性是溶细胞作用 • 特异性抗体+红细胞→激活补体→溶血 • 在适当的、稳定的反应体系中，溶血反应
对补体的剂量依赖呈一特殊的S形曲线
阳性
阴性
阴性
阳性
二、方法评价
➢优 点
灵敏度高、所测定的抗体水平可达0.05μg/ml ， 出现交叉反应的机率较小， 可检测的抗原或抗体范围广泛， 无需特殊设备、结果容易观察、试验条件要求不高
➢现 状
影响的因素多、各种制剂需要繁琐的稀释和滴定等， 现代化、自动化抗原抗体检测方法的不断涌现，补体结合试验逐 渐被遗弃 补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型，其设计和原理仍对 新型免疫方法的建立有着启迪和指导作用
补体的测定及应用
正式试验
分类:小量法、微量法，以小量法常用 实验过程:
稀释和处理后的标本与已知抗原或抗体、补体温育
与指示系统共育
结果判度: 对照管: 阴性对照管:溶血 阳性对照管:不溶血 抗体或抗原对照管:完全溶血 待检血清对照管:完全溶血 绵羊红细胞对照管:不出现自发性溶血
2个单位:全溶 ➢ 补体对照管： 1个单位:全溶或略带少许红细
4、补体的性质不稳定，试验前均应进行滴定
待测标本 1、采血并及时分离血清用于检测或－20℃保存备用。 2、试验前，应先将血清56℃加热30min（或60℃3min）以灭活补体。
血清标本遇有抗补体现象时，可作下列处理： 加热灭活时提高12℃ －20℃冻融后离心去沉淀 以3mmol/L盐酸处理 加入少量补体后再行灭活 以白陶土处理 通入CO2 以小白鼠肝粉处理 用含10％新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释血清
补体的活化途径
1、经典途径 以抗原抗体复合物结合C1q启动激活的途径，又称第一途径或传统 途径，是抗体介导的体液免疫应答的主要效应方式
2、MBL途径 MBL结合至细菌启动的途径，激活剂是机体的炎症反应急性期时 产生的MBL和C反应蛋白等
3、旁路途径 通过微生物表面等膜性物质，从C3开始，不依赖特异性抗体的形 成，在感染早期可为机体提供有效的防御。
方法学评价和临床意义
方法简便、快速，但敏感性低，补体的活性除与反应体积成反比 外，还与反应所用的缓冲液、SRBC的数量以及反应温度有关
总补体活性的参考范围为50～100U/ml
CH50增高见于： 急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等
CH50降低见于： 系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎 、急性肾小球 肾炎等
➢现 状
影响的因素多、各种制剂需要烦琐的稀释和滴定等， 现代化、自动化抗原抗体检测方法的不断涌现，补体结合试验逐 渐被遗弃 补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型，其设计和原理仍对 新型免疫方法的建立有着启迪和指导作用
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大写英文字母命名（B、D、P因子等）
调节蛋白多按功能命名 裂解片断加英文小写字母作为后缀 灭活片断在前加字母i
C3→C3a+C3b
iC3b
（二）补体的理化性质
各组分均为糖蛋白，但有不同的肽链结构 各组分分子量及血清含量不一，C3含量最高 血清补体蛋白约占血清总蛋白的 5%~6% ，含 量相对稳定，疾病时可有波动
1919 for his discovery of immunity factors in blood
serum; this was a
development vital to the diagnosis and treatment of many dangerous contagious diseases.
3. 活化过程
（三） 凝集素途径（MBL途径）
1. 激活物：病原体表面以甘露糖、甘露糖胺等为末端糖基的糖结构 2. 参与成分：MBL、MASP、C2~C9 3.活化过程： MBL-MASP 病原体表面糖结构 MBL构型改变 激活MBL相关的丝氨酸蛋白酶
(MBL-associated serine protease, MASP)
Medical Immunology 6th
第五章
补体系统
温州医科大学检生学院 病原生物学与免疫学系
王彩虹
Belgian bacteriologist and immunologist who received the Nobel Prize for
Physiology or Medicine in
某些固有成分对热不稳定，56℃、30min即可 灭活
（三）补体的代谢
1.补体的来源：广泛、以肝细胞和巨噬细胞为主
2.补体生物合成的调节：①补体的基因表达存在组织特异
性，不同细胞各自调节其补体的生物合成②补体合成 可受多种因素调节，包括局部组织特异的因子和多种 全身激素 3.补体的分解代谢：补体代谢率极快，血浆补体每天约有 一半被更新
的经活化后具有酶活性的蛋白质，包括30余
种组分，又称为补体系统。
（一）补体系统的组成
1、补体固有成分 2、补体调节蛋白
3、补体受体
1、补体固有成分
存在于体液，参与补体激活级联反应。
参与经典激活途径的：C1、C2、C4
参与旁路激活途径的：B、D、P因子
参与MBL激活途径的：甘露糖结合的凝集素
三条激活途径的特点
比较项目
激活物
经典途径
IgM/IgG1~3与抗原 形成的免疫复合物 C1q
凝集素途径
病原体表面N氨 基半乳糖或甘露 糖 MBL、FCN MBL, MASP, C2~C9
旁路途径
细菌、真菌、病 毒感染细胞 C3 C3 、B、D、P因 子、C5~C9
Jules Bordet (1870-1961), discoverer o 菌的豚鼠的 血清 霍乱弧菌菌液
（凝集）
正常豚鼠血清 感染霍乱弧 菌的豚鼠的 血清
56℃30分钟
（溶菌）
（溶菌） （凝集） （溶菌）
Presumptions:
1. There is a component in the fresh serum that helps the antibody to lyse the bacteria.
2. The chemical property of this component is not stable.
3. This component is not antigen specific.
第一节 补体概述
补体的概念：
Complement（C）----是存在于正常人和动
物血清、组织液和细胞膜表面的一组不耐热
C1r C1s
C1qr2s2
抗
体
抗原
<40nm
抗原
IgG 分 子 结 合 抗 原 前 后 的 构 象 变 化
结合抗原之前 结合抗原之后
CH1
CH2
Fc段
C1q 结合 位点被屏 障
暴露的 C1q结合 位点
IgM CH3区，IgG CH2区
活化阶段
经典途径C3转化酶的形成
C4b2a is C3 convertase
C4b
经典途径C5转化酶的形成
C4b2a3b
is C5 convertase
b C4b
C3b
（二）旁路途径（替代激活途径）
不依赖于抗体，由微生物或外源异物直接激活C3，是最早出现 的补体活化途径，是抵御感染的非特异性防线 1. 激活物 某些细菌、内毒素、酵母多糖、葡聚糖（提供接触表面） 2. 参与成分 C3、C5-C9、 D因子、 B因子、P因子。
第二节 补体激活途径
补体固有成分以非活性形式存在于体液中，通过级
联酶促反应被激活，产生具有生物学活性的产物
三条补体激活途径
--经典途径（classical pathway） --旁路途径（alternative pathway） --凝集素途径（lectin pathway）
(一) 经典途径
1. 激活物：与Ag结合的IgG、IgM分子
2. 参与成分：C1-C9
3. 活化过程
C1(C1q→C1r→C1s)→C4→C2→C3→C5→C6→C7→C8→C9 识别阶段 活化阶段 膜攻击阶段
识别阶段
C1q
C1由一个C1q、两个C1r 和
两个C1s分子的共同组成。 C1q与2个以上Fc段结合可 发生构型改变，使与之结合的 C1r活化，继而激活C1s的丝 氨酸蛋白酶活性，启动补体活 化的经典途径。
（MBL）、MBL相关的丝氨酸蛋白酶（MASP）
共同组分：C3、C5～C9
2、补体调节蛋白
可溶性或膜型分子，调节补体活化，如C1抑制
物、C4结合蛋白、衰变加速因子（DAF）等
3、补体受体
表达于各种细胞表面，与补体活性片段结合，如
CR1-CR5、C3aR、C4aR、C5aR等
补体系统的命名原则
+
MASP有两类
活化的MASP2具有丝氨酸蛋白酶 活性，先后裂解C4、C2 形成与经 典途径相同的C3转化酶。 活化的MASP1直接裂解C3，生成 C3b，进入补体激活的旁路途径。
凝集素途径对经典途径和旁路途径的活化有交叉促进作用
（四）补体激活的共同终末过程
MAC（membrane attack complex)的形成