总杞菊地黄丸定性鉴别和含量测定研究

杞菊地黄丸中各药材的定性鉴别及含量测定一、处方枸杞子40g 菊花40g 熟地黄160g 酒萸肉80g 牡丹皮60g 山药80g 茯苓60g 泽泻60g二、制法以上八位味，取酒萸肉、牡丹皮、山药粉碎成细粉;泽泻、茯苓加水煎煮两次，第一次3小时，第二次2小时，滤过，滤液合并浓缩至相对密度为1.30—1.35（60—80℃）的稠膏；熟地黄切片，加水煎煮三次，第一次3小时，第二次2小时，第三次1小时，滤过，滤液合并浓缩至相对浓度为1.30—1.35（60—80℃）的稠膏；枸杞子以45%乙醇作溶剂，剩余的酒萸肉和牡丹皮及菊花已70%乙醇作溶剂，浸渍24小时后分别进行渗漉，收集渗漉液，合并上述渗漉液，回收乙醇浓缩至相对浓度为1.30—1.35（60—80℃）的稠膏；与上述细粉与稠膏混匀，制成浓缩丸，干燥，打光，即得。

三、性状本品为棕色至棕黑色的浓缩丸，微甜而酸。

四、各药材的定性鉴别及含量测定1、枸杞子定性鉴别研究实验仪器：冷凝管3个，圆底烧瓶3个，离心管6个，硅胶G薄层板，分液漏斗1个实验试剂：乙酸乙酯，甲醇，甜菜碱对照品，甲苯薄层板：硅胶G薄层板展开剂：甲苯-乙酸乙酯-甲酸（15:2:1)的上层溶液供试品溶液的制备方法：取本品15g，研碎，加水100ml，加热回流30分钟3次，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯50ml振摇提取3次，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备：取枸杞子对照药材0.5g，加水50ml，加热回流30分钟3次，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯30ml振摇提取3次乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为对照药材溶液。

对照品溶液制备：取甜菜碱对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液。

阴性对照溶液的制备：取阴性样品（缺枸杞子药材的样品），按照供试品溶液制备的条件制备样品，得阴性对照溶液。

操作方法：照薄层色谱法（通则0502)试验，吸取上述两种溶液各10微升，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（15:2:1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm)下检视。

供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

2、山药定性鉴别研究实验仪器：冷凝管1个，圆底烧瓶1个，分液漏斗1个，蒸发皿1个，硅胶G薄层板2个，离心管2个实验试剂：95%乙醇，乙酸乙酯，二氯甲烷，甲醇，浓氨试液，氯仿，10%磷钼酸乙醇溶液，香兰素硫酸溶液薄层板：硅胶G薄层板展开剂：乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（9：1：0.5）；氯仿:甲醇:水（64:50:10）显色剂：10%磷钼酸乙醇溶液；香兰素硫酸溶液供试品溶液的制备：取本品8粒研碎，加二氯甲烷30ml，加热回流2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加二氯甲烷1ml使溶解，作为对照药材溶液。

对照药材溶液的制备：取山药对照药材5g，加二氯甲烷30ml，加热回流2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加二氯甲烷1ml使溶解，作为对照药材溶液。

操作方法（薄层色谱法）吸取上述2种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（9：1：0.5）或氯仿:甲醇:水（64:50:10）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以显色剂：10%磷钼酸乙醇溶液或香兰素硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。

供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

3、茯苓定性鉴别研究实验仪器：冷凝管1个，圆底烧瓶1个，分液漏斗1个，硅胶G薄层板2个实验试剂：甲醇，乙醇，乙酸乙酯，乙醚，10%硫酸乙醇溶液，2%香草醛酸溶液-乙醇（4: 1)，三氯甲烷，茯苓多糖对照品。

薄层板：硅胶G板展开剂：三氯甲烷-甲醇（3 : 1)或正丁醇-冰乙酸-水（4:1:5上层）或甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20:5:0.5）显色剂：10%硫酸乙醇溶液或2%香草醛酸溶液-乙醇（4: 1)混合溶液供试品溶液的制备：取本品杞菊地黄丸（浓缩丸）15g，研碎，加水100mL，加热回流30分钟，放冷，离心，取上清夜，用乙酸乙酯50mL振摇提取3次，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：取茯苓多糖加甲醇溶液1ml制成对照品溶液。

阴性对照品溶液的制备：取阴性样品（缺茯苓药材的样品），按照供试品溶液制备的条件制备样品，得阴性对照溶液。

对照药材溶液的制备；取茯苓对照药材1g，加乙醚50ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，制成对照药材溶液。

操作方法：照薄层色谱法（通则0502)试验，吸取上述供试品溶液,对照药材溶液,阴性对照液，分别点于同一块硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇（3 : 1)或正丁醇-冰乙酸-水（4:1:5上层）或甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20:5:0.5）或为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液或2%香草醛酸溶液-乙醇（4: 1)混合溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，在紫外光(365nm)下检视。

4、泽泻定性鉴别研究实验仪器: 冷凝管3个、圆底烧瓶3个、硅胶G薄层板2个、离心管2个实验试剂: 乙酸乙酯、乙醇、乙醚、丙酮，环己烷，石油醚，5%硅钨酸乙醇溶液，薄层板: 硅胶G薄层板展开剂: 环己烷-乙酸乙酯(1 : 1)或石油醚-乙酸乙酯（3:1）或三氯甲烷-丙酮（3:1）显色剂: 5%硅钨酸乙醇溶液供试品溶液的制备:方法1取本品杞菊地黄丸（浓缩丸）15g,加水100ml,加热回流30分钟3次，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯50ml振摇提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml 使溶解，作为供试品溶液。

方法2取本品杞菊地黄丸（浓缩丸）6g，研碎，加乙醚40ml,加热回流1小时3次，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮1ml使溶解，作为供试品溶液。

方法3取本品杞菊地黄丸(浓缩丸)3g,研细，加乙醇40ml,加热回流30分钟3次，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

对照药材溶液制备:方法1取泽泻对照药材0.5g,加水50ml,加热回流30分钟3次，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯30ml振摇提取3次，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。

方法2取泽泻对照药材1g,加乙醚40ml,加热回流1小时，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮1ml使溶解，作为对照药材溶液。

方法3 取泽泻对照药材1g,加60%乙醇40ml,加热回流30分钟，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。

阴性对照溶液的制备：按处方比例称取除泽泻外的其他药材同法制成阴性对照品溶液。

操作方法:照薄层色谱法（通则0502)试验，分别吸取上述供试品溶液,对照药材溶液,对照品溶液和阴性对照液各5 μL、3 μL、3 μL、5μL点于同一块硅胶G板上，以环己烷-乙酸乙酯(1 : 1)或石油醚-乙酸乙酯（3:1）或三氯甲烷-丙酮（3:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷5%硅钨酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。

5、熟地黄定性鉴别研究实验仪器：容量瓶，玻璃漏斗1个，分液漏斗1个，硅胶G薄层板2个实验试剂:水饱和正丁醇，甲醇，毛蕊花糖苷对照品,0.1% 2 ,2 -二苯基-1-苦胼基无水乙醇溶液薄层板：硅胶G薄层板展开剂：乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16 : 0. 5 : 2)显色剂：0.1% 2 ,2 -二苯基-1-苦胼基无水乙醇溶液供试品溶液的制备：取本品（以下“本品”均指：杞菊地黄丸，2010版药典中规定每8丸相当于饮片3g）8粒，研碎，加80%甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过,滤液蒸干，残渣加水5ml使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4 次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。

取熟地黄药材粉末lg ,同法制成对照药材溶液。

对照品溶液制备：取毛蕊花糖苷对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液。

阴性对照溶液的制备：取阴性样品（缺熟地黄药材的样品），按照供试品溶液制备的条件制备样品，得阴性对照溶液。

操作方法：照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液5^1,对照品溶液2pl，分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16:0.5:2)为展开剂，展开，取出，晾干，用0.1%的2,2 -二苯基-1-苦胼基无水乙醇溶液浸渍,晾干。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点。

6、牡丹皮定性鉴别研究实验仪器：冷凝管3个，圆底烧瓶3个，硅胶G薄层板2个，玻璃漏斗1个实验试剂：乙醚，丙酮，环己烷，三氯甲烷，丹皮酚对照品,盐酸酸性5%三氯化铁乙醇溶液薄层板：硅胶G薄层板两个展开剂：环己烷-乙酸乙酯（3:1)；环己烷-三氯甲烷-无水乙醇（7:3:1）显色剂：盐酸酸性5%三氯化铁乙醇溶液取本品6g，研碎，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮l ml使溶解，作为供试品溶液。

对照药材溶液制备：取牡丹皮对照药材lg，同法制成对照药材溶液。

对照品溶液制备：取丹皮酚对照品，加丙酮制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。

阴性对照溶液的制备：按处方比例称取除牡丹皮外的其他药材同法制成阴性对照品溶液。

阴性对照溶液制备其它各药材用量操作方法：照薄层色谱法通则（0502)试验，吸取供试品溶液，对照品溶液，阴性对照溶液各10ul 分别点于同一硅胶G薄层板上,使成条状,以环己烷-乙酸乙酯（3 : 1)或者环己烷-三氯甲烷-无水乙醇（7:3:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5%三氯化铁乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。

供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的条斑。

同时用阴性对照品与对照药材对比以排除浓缩丸中其他药材的干扰。

定量鉴别研究本品方中牡丹皮为较主要的一味中药，故选其为测定对象。

根据文献的有关报道，牡丹皮中有效成分为丹皮酚及芍药苷等，中国药典2015年版该方中以丹皮酚为其含量测定项目，故本品以丹皮酚为含量测定指标，采用HPLC色谱法，并参考有关文献进行系统的方法学研究。

实验仪器：高效液相色谱仪，具塞锥形瓶2个，25ml移液管1个，1ml移液管1个，分析天平（万分之一），冷凝管2个，圆底烧瓶2个。

实验试剂：70 %甲醇，甲醇-水（7:3），丹皮酚对照品。

供试品溶液的制备：取本品1.5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70 %甲醇25ml ，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液制备：取丹皮酚对照品适量，精密称定，加7 0 % 甲醇制成每l ml中含丹皮酚45ug的溶液,即得。

阴性对照溶液的制备：按处方比例称取除牡丹皮外的其他药材,按杞菊地黄丸的制备工艺及供试品的制备方法制备阴性溶液。