免疫组化流程
免疫组化的原理及流程介绍
免疫组化原理及流程介绍
(2)封闭内源性过氧化酶
其主要目的是降低内源性过氧化 物酶的活性。在传统的ABC法和SP 法中，免疫组化反响结果简洁受到 内源性过氧化物酶的干扰，必需用 过氧化氢等进展灭活。
免疫组化原理及流程介绍
具体操作:
1)用封闭通透液浸润切片 30 min〔RT 避 光〕。 其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30％H2O2。
80年月 Hsu 等建立了抗生物素—生素 〔ABC〕法之后，免疫金—银染色法、半 抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 90年月 分子杂交技术、原位杂交技术、免 疫细胞化学分类方法快速进展。 2023年 各种免疫组化技术更加成熟，使免 疫组化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合争论的一项有力工具。其应用范 围深达医学各个学科，是目前生命科学工作 者应当把握的根本技术之一。
免疫组化原理及流程介绍
留意事项：
• 1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳 性染色的位置。
• 2.切片脱蜡和水化要充分；加反响液时要掩 盖组织充分；每次加 液前甩干洗涤液，但 又防止干片 。
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• 3.以下缘由可能导致片子着色不均匀： • ① 脱蜡不充分。可以 60 ℃烤 20 min，马上放入新颖
具体操作：
1)将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次； 2)用滤纸将圆圈四周的水吸去，参加已 稀释的二抗后放入 37℃恒温烤箱中 30 min。 3)用 PBS 洗 5 次×5 min
7.SP反响
SP染色法即链霉素抗生物素蛋白 生 物素过氧化酶连接法。
该法是ABC法根底上的进一步改进， 使卵白素与链霉〔而非生物素〕结合， 而后再结合PO基。
免疫组化实验步骤流程
免疫组化实验步骤流程1.样品制备：a.组织样品：从动物或人体获得的组织样品首先需要固定在福尔马林中，然后通过蜡包埋技术将组织固定在蜡块中。
之后，将蜡块切成薄片，然后将薄片分别放置于载玻片上。
b.细胞样品：将细胞悬浮液放置在载玻片上，并用福尔马林进行固定。
2.抗原恢复：固定的组织或细胞样品经过脱水和脱脂处理后，需要通过抗原恢复来揭示隐藏的抗原。
抗原恢复的方法可以是热处理、酶切或化学处理等。
3.形成蛋白结合位点：将载玻片上的样品用蛋白结合剂如牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶或生物素素蛋白结合剂等进行封闭处理，以防止非特异性结合。
4.孵育抗体：a.主抗体：将特异性的首要抗体加入到样品中，与目标抗原结合形成抗原抗体复合物。
b.辅助抗体：添加荧光素或酶标记的次抗体，与主抗体结合，以扩大信号的产生。
5.洗涤：用缓冲液洗涤载玻片，以去除未结合的抗体和其他无关物质。
6.信号增强：a.酶标记的实验，为了增加信号强度，可以加入荧光素或发光底物。
b.荧光标记的实验，可以直接观察荧光。
7.显色：在酶标记的实验中，加入染色底物以产生可见的颜色，从而定位并显示目标抗原的存在。
8.盖玻片：在涂抹适当封片剂后，将载玻片盖上一片封片玻片，以保护样品并减少光的干扰。
9.显微镜观察：使用显微镜观察载玻片下的样品，并通过图像系统进行图像捕捉和分析。
10.结果评估：评估图像和数据以确定抗原的表达和分布情况。
根据实验目的，可以进行半定量或定量的数据分析。
需要注意的是，免疫组化实验中的条件、试剂和步骤会因实验目的不同而略有差异。
因此，在进行实验前需仔细阅读相关文献和制定适合的实验方案，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化及PCR操作流程
细胞免疫组化步骤1. PBS冲洗两次2. 丙酮固定10min3. 浸入0.75%H2O2-PBS(30%H2O2 0.05 ml+PBS 2ml) 37℃30 min4. PBS振洗2次,每次3min5. 加封闭血清,湿盒内37℃30 min6. 弃去血清7. 加一抗, 37℃30~60min (1:200 1:150稀释)8. PBS振洗3次,每次3min9. 加二抗, 37℃30 min10. PBS振洗3次,每次3min11. 加ABC复合剂, 37℃30 min12. PBS振洗2次,THB(Tris-HCl缓冲液0.5mol/l,PH 7.6 )振洗1次,每次3min13. 浸入新鲜底物溶液（DAB50mg+100ml THB）,在室温下暗处10~20min14. 自来水洗5min15. 染核浸入苏木素染液2min,自来水洗，迅速过盐酸酒精，自来水洗，过氨水，自来水洗16. 逐级脱水，70％1次，95％2次，无水3次每次1min17. 透明，过二甲苯3次，每次1min18. 封片将有细胞的一面向下封片一、免疫组化操作规程（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。
2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。
3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。
免疫组化手工流程介绍
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1. 组织制备。
采集新鲜组织或福尔马林固定组织，切成4-5μm厚度的石蜡包埋切片。
免疫组化实验步骤
免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
免疫组化操作流程
1.脱蜡复水：
（1）石蜡切片浸泡在二甲苯中2次（分别置入两个装有二甲苯的染缸），每次10min；
（2）无水乙醇、95%、85%、75%、50%乙醇、纯水中依次放置5min；
（3）PBS缓冲液中浸泡5min。
2.抗原修复：
（1）加入H2O2，湿盒中孵育10min，PBS浸泡冲洗3次，每次5min；
（2）放入0.01M枸橼酸缓冲液中，微波炉大火加热至沸腾（保持8min）；
（3）待修复液温度降至室温，PBS冲洗2次，每次5min。
3.免疫反应：
（1）滤纸擦去多余的PBS，低价PBS稀释的10%正常山羊血清，室温下湿盒封闭30-60min；
（2）孵育结束后去除封闭液，滴加一抗工作液，4度孵育过夜；
（3）移去一抗工作液后，用PBS冲洗2次，每次10min，擦去切片周围多余液体；
（4）滴加二抗工作液，室温湿盒孵育30min，弃去二抗后PBS洗2次，每次10min。
4.化学染色：
（1）擦去切片上多余PBS，滴加新鲜配置的DAB工作液，湿盒孵育，显微镜检测染色程度；
（2）染色结束后PBS洗去DAB染液3次，每次5min；
（3）去除残留液体，苏木素复染25min；
（4）复染结束后，清水洗去，1%盐酸酒精中风化数秒，再次水洗。
5.脱水封片：
（1）依次将切片放入50%、75%、85%、95%乙醇和无水乙醇中，各放置5min；
（2）二甲苯中透明化处理2次，每次10min；
（3）脱水处理后，擦去周围液体，滴加几滴中性树胶，盖上盖玻片，用镊子钝端轻敲盖玻片以除去气泡。
免疫组化步骤
免疫组化流程1、固定灌流后尽快取出肾脏（1-2分钟内完成），剥除筋膜和其他结缔组织，取皮质削成薄片，（易于固定液的浸透），臵于 Dwbosy Bra 液24小时，按照D程序转缸。
2、包埋蜡块皮质朝下，组织放平3、切片切2-3微米，用多聚赖氨酸处理的玻片捞组织，用吹风机吹熔组织。
如暂时不做，放-20°冻存，室温放臵过久，抗原会丢失4. 烤片：烤箱60°1小时后尽快放入二甲苯缸脱蜡5. 脱蜡及水化：二甲苯1----二甲苯2---二甲苯3---无水乙醇---90%乙醇---75%乙醇，每缸10分钟6. 抗原修复先用微波炉将缓冲液中火3分钟煮沸，再将片子臵入，低火10-20分钟修复抗原7.3﹪H2O2室温孵育10分钟，PBST3min洗三次8.羊血清室温孵育15分钟，不洗9. 一抗4°过夜， PBST3min洗三次10. 生物素化的二抗15分钟， PBST3min洗三次11.亲和素——链霉素——过氧化物酶复合物即“三抗”15分钟，PBST 3min洗三次12. DAB显色13.核复染苏木素5min——盐酸酒精1min——氨水5min，染完冲水，风干14.中性树胶封片，37°烘片2小时建议：1、全程尽可能减少干片的机会，以降低非特异性染色2、抗原修复应在H2O2之后，以便高温时进一步脱蜡重要步骤说明：1、标本固定固定的目的：1）保持组织细胞原有的形态结构2）使组织硬化固定的优、缺点：优点：使组织细胞的形态结构得到保持缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性易受损2、脱蜡及水化这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。
水化用梯度乙醇（由高到低即无水乙醇---90%---75%）。
若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。
3、抗原修复抗原修复的原因：固定液中的醛基与抗原蛋白的氨基酸残基交联形成羧甲基, 使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍, 再则由于分子间的交联形成的网格结构,可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇, 使之不能充分暴露, 这些均可造成假阴性的染色结果。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2.水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7."2―7."4）：NaC137mmol/L，KCl2."7mmol/L ,Na2HPO44."3mmol/L, KH2PO41."4mmol/L.2．"0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6."0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0."4g。
3．0."5mol/L EDTA缓冲液（ph8."0）：700ml水中溶解186."1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph 8."0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8."0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH 8."0,加水1000ml。
5.酶消化液：a.0."1%胰蛋白酶:用0."1%CaCl 12(ph7."8)配制。
b.0."4%胃蛋白酶液：用0."1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.风裱剂：a.甘油和0."5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9."0–9."5）等量混合b油和TBS(PBS)配制8．"TBS/PBS PH9."0–9."5,适用于荧光纤维镜标本;ph7."0-7."4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
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免疫组化流程
免疫组化是一种利用抗体与特定抗原结合的技术，用于检测细胞或组织中特定分子的存在和分布。
其流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
本文将以免疫组化的流程为主线，介绍各个步骤的具体操作方法和注意事项。
第一步是标本制备。
要制备免疫组化的标本，可以使用细胞悬液、细胞刮片、冰冻切片或石蜡切片等。
标本制备的关键是保持细胞和组织的完整性和形态。
对于固定的细胞和组织，需要将其处理成适合免疫组化的形式，例如通过冰冻切片或石蜡切片的方法。
第二步是脱脂。
脱脂是将细胞或组织中的脂肪和非脂肪物质去除的过程，以便更好地显示目标分子的分布。
通常可以使用乙醇、醚或甲醇等有机溶剂进行脱脂处理。
需要注意的是，脱脂时间不宜过长，否则可能导致抗原失活。
第三步是抗原修复。
抗原修复是为了使被固定的细胞或组织中的抗原恢复或暴露出来，以便与相应的抗体结合。
常用的抗原修复方法包括煮沸法、酶解法和酸碱解法等。
不同的抗原修复方法适用于不同的标本类型和抗原性质。
第四步是抗体处理。
在免疫组化中，需要使用一种与目标分子特异性结合的抗体。
通常可以使用一抗和二抗的结合用于检测。
一抗是与目标分子特异性结合的主抗体，而二抗则与一抗结合，用于产生荧光或酶标信号。
在抗体处理过程中，需要进行固定、
洗涤和孵育等步骤。
第五步是染色。
染色是将经过抗体处理的样本显色或标记的过程，以便更好地观察目标分子的分布。
染色的方法可以根据需要选择，常用的有免疫荧光染色、酶标染色和银染等。
在染色过程中，需要根据实验要求和标本特点进行适当的控制，以获得准确的染色结果。
最后一步是显微镜观察。
经过以上的操作，样本已经准备好进行显微镜观察和分析。
观察时需要注意光线的调节和对焦的正确，以获得清晰和准确的图像。
同时，还需要根据实验要求和预定的结果指标进行分析和解读。
总结起来，免疫组化的流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
每个步骤都需要精确控制和注意细节，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化技术在生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用，为大量疾病的治疗和预防提供了重要的实验依据。