黄芩素脂质体的制备及体外释放的研究

黄芩素脂质体的制备及体外释放的研究姚亚红,张立伟3(山西大学分子科学研究所,山西太原030006)摘　要:目的:研究黄芩素脂质体的制备方法。

方法:采用逆相蒸发法、薄膜-超声法制备黄芩素脂质体,利用紫外光谱测定包封率以及浆板法测定体外释放曲线。

结果:逆相蒸发制备的脂质体平均粒径179nm ,包封率和载药量分别为92.57%和23.24%;薄膜超声法平均粒径257nm ,包封率和载药量分别为60.02%和7.70%,在PH7.4磷酸盐缓冲液中体外释药符合Higuchi 方程。

结论:逆相蒸发法操作简单,重现性好,制备的脂质体粒径小、包封率高,药物具有一定的缓释性。

关键词:黄芩素;脂质体;包封率;制备中图分类号:R944.9 文献标识码:A 文章编号:1002-2392(2006)03-0031-03收稿日期:2005-09-02资助项目:山西省自然科学基金(20041102)作者简介:姚亚红,女,(1979-),硕士研究生,研究方向为天然药物提取与分离与药物制剂。

3通讯作者:张立伟,E -mail :lwzhang @ 。

黄芩素(baicalein )为黄酮类化合物,是唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis G eorgi )的主要有效成分之一。

具有抗菌、抗病毒、抑制炎症反应、保肝、利胆、利尿、抗癌等作用,具有很好的临床应用价值[1]。

但是黄芩素水溶性差,且易被氧化。

大量研究表明,脂质体有包封脂溶性药物或水溶性药物的特性,药物被脂质体包封后,保护了药物免受降解,增加了其在水中的溶解度,且在体内呈现出与药物本身不同的特点。

另外,脂质体作为药物的载体,具有靶向性、缓释性,可增加疗效,降低药物的毒副作用[2]。

根据黄芩素的性质,本研究以包封率为评价指标,探讨了黄芩素脂质体的制备方法,并对其体外释放进行考察。

1　实验材料1.1　仪器K Q3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);HP 8453UV 一ViS 吸收光谱仪(美国惠普公司);透射电子显微镜(H -600-2日本日立公司);激光粒度分析仪(ZET ASIZER 3000HS A ,Malvern InstrumentsC o.L td ,UK );冷冻干燥机(ct60e Heto );旋转蒸发仪RE -52A (上海亚荣生化仪器厂);TG L -16C 型台式离心机(上海安亨科学仪器厂);FSH -2A 可调高速匀浆机(江苏金坛医疗仪器厂)。

1.2　试剂黄芩素为自制;蛋黄卵磷脂(E pc ,北京双旋微生物培养机制品厂);胆固醇(Chol ,北京奥博星生物技术责任有限公司);其它化学试剂均为分析纯。

2　方法和结果2.1　黄芩素标准曲线的制作精密称取黄芩素10.4mg 置10ml 容量瓶中,用叔丁醇溶解并稀释至刻度。

再分别吸取53、58、64、70、77、85、110、142μl ,用蒸馏水定容至10ml ,制成不同浓度的溶液,以蒸馏水为空白,测定各溶液在272nm 处的吸收值。

结果表明,黄芩素在272nm 处的吸光度A 与其浓度C 呈良好的线性关系,线性范围为50～140Πml ,其线性回归方程为:C =0.73818+16.04372A (r =0.9998)。

2.2　脂质体的制备2.2.1　逆相蒸发法　称取一定比例[3]的E pc 和Chol 溶于无水乙醚中,将适量黄芩素溶于10ml 磷酸盐缓冲液(P BS ,PH6.8)中。

再将含有药物的P BS 与有机相混合,水浴超声处理,直至形成稳定的W ΠO 型乳剂,然后于旋转蒸发仪中减压蒸发除去乙醚,达胶态后再加入10mlP BS 水化,继续减压蒸发,即得淡乳黄色脂质体混悬液。

2.2.2　薄膜-超声法[4]　称取同样比例的类脂溶于无水乙醚中,然后于旋转蒸发仪中减压蒸发除去乙醚,使类脂在圆底烧瓶内壁形成一层均匀薄膜。

加入适量黄芩素磷酸盐缓冲液,水化脂膜,冰浴超声破碎一定时间,即得淡乳黄色脂质体混悬液。

2.3　包封率和载药量的测定分别精密吸取2种不同方法制备的黄芩素脂质体混悬液1.0m1,进行离心(13000rpm ,30min ),取上清液于10ml 容量瓶,用蒸馏水和叔丁醇(2∶lv Πv )的混合溶剂定容。

于272nm 处测定吸光度,代入标准曲线方程计算游离药物的量(W 游)。

同时精密量取1.0ml 的混悬液于25ml 容量瓶中,同法处理,得总药物的量(W 总)。

按下式计算包封率和载药量:包封率=(W 总-W 游)ΠW 总×100%;载药量=(W 总-W 游)ΠW 载×100%,结果见表1。

・13・中医药学报2006年第34卷第3期表1　2种方法制备的黄芩素脂质体各项指标黄芩素脂质体逆相蒸发法薄膜超声法平均粒径(nm )179258粒径分布(nm )150～23080～560平均包封率(%)88.8660.02平均载药量(%)8.897.702.4　形态学与粒径分布的研究2.4.1　形态的研究取少量黄芩素脂质体混悬液,滴至专用铜网上,自然挥干后,在放大5万倍的透射电镜下观察粒子形态并拍摄照片,2种不同方法制备的脂质体结果见图1。

由透射电镜照片可见,制备的脂质体呈完整的圆球形或椭圆形的小囊泡。

图1　逆相蒸发法制备的黄芩素脂质体(×50000)2.4.2　粒径测定　取脂质体少量,适量蒸馏水稀释后,用激光粒度分析仪测定2种方法制备的脂质体的平均粒径及粒度分布。

由表1可明显看出,采用逆相蒸发法制备的脂质体粒径小,分散性好,包封率高。

由此确定脂质体制备方法为逆相蒸发法。

2.5　不同药脂比对包封率的影响固定药物的用量,选择不同的药物与类脂的比例,其它条件不变。

实验表明:当药物与类脂的比在1:4左右时,包封率最高,载药量最大,见表2。

表2　不同药脂比制备的黄芩素脂质体的包封率(n =3)药物:类脂(W ΠW )平均包封率(%)平均载药量(%)1∶2082.32 5.141∶1088.868.891∶489.2321.382.6　不同比例的E pc 和Chol 对脂质体包封率的影响加入胆固醇,可使脂膜固化,减少脂质的流动性,从而降低了药物的渗漏。

为此,设计了不同比例的E pc 和Chol ,并固定药脂比为1∶4。

考察了其包封率和载药量的变化,实验表明,随着胆固醇的增加,包封率和载药量有明显的增大。

结果见表3。

表3　不同比例E pc 和Chol 制备的黄芩素脂质体(n =3)E pc ∶Chol (w Πw )平均包封率(%)平均载药量(%)6∶176.9518.584∶189.2321.382∶192.5723.241∶288.5621.362.7　分散方法对脂质体包封率的影响在形成稳定的乳剂时,不同的分散法对脂质体的粒径和包封率均有影响。

采用匀浆法和超声法测定其包封率,结果见表4。

表4　不同分散法制备的黄芩素脂质体(n =3)分散法平均包封率(%)平均载药量(%)匀浆法89.8122.36超声法92.5723.242.8　脂质体稳定性的考察将制备的混悬液用适量蒸馏水稀释后,室温保存1个月,未见有沉淀聚集,而包封率降低了约10%。

可见,药物有明显的渗漏。

但是,将制备的脂质体混悬液加入冻干保护剂,冷冻干燥[5]后,放置1个月,几乎未见有渗漏。

2.9　黄芩素脂质体的体外释放动力学研究[6]称取30mg 的黄芩素脂质体干粉,加2ml 蒸馏水溶解,置透析袋中,放在装有50m10.2M 的PH7.4磷酸盐缓冲液锥形瓶中,在(37±0.5)℃恒温下以浆板法测定体外释药性能(100rpm 搅拌,间隔1h 吸取外液3ml ,然后补加3mlP BS )。

于272nm 处测定所取溶液的吸光度,以PH7.4磷酸盐缓冲液为空白。

代入标准曲线方程,计算不同时间药物的释放量,结果:在PH7.4磷酸盐缓冲液中体外释药符合Higuchi 方程:Q =25.4525+8.69484t 1Π2,(r 2=0.942)见图2。

图2　黄芩素脂质体的体外释放曲线3　讨论在黄芩素脂质体混悬液的制备过程中,对逆相蒸发法、薄膜-超声法进行了单因素考察,薄膜-超声法制备的粒径大、包封率低、稳定性也较差,而逆相蒸发法当控制水相与有机相在1∶3～1∶6时,重现性好,且粒径小、包封率高。

结果表明,逆相蒸发法更适合黄芩素脂质体的制备;对逆相蒸发法进行了不同药脂比、膜・23・AC MP 1Aug ,2006,V ol 134,N o 13材比、分散法的因素考察,以包封率和载药量为评价指标,对黄芩素脂质体制备方法进行了优选,得出黄芩素脂质体的最佳制备条件为:卵磷脂与胆固醇的比2∶1;药脂比1∶4。

胆固醇具有亲水亲油双亲性,能与磷脂的亲水和亲油基团作用,稳定磷脂膜。

适当提高脂膜中胆固醇的量,可以提高药物的包封率,但胆固醇的量也不能过高,否则由于胆固醇与磷脂双分子的作用,穿插在磷脂膜中间的药物与磷脂的作用被削弱,反而使得包封率下降[7],一般它与磷脂的比例在1∶2左右。

本试验是采用HP 8453UV -Vis 吸收光谱仪测定包封率和载药量,在测定过程中,未包封的药物采用离心法分离。

但是,离心法不能很好地分离游离药物与脂质体,速率太小只能使较大的脂质体沉淀下来,还有部分较小颗粒的脂质体仍浮于上层液中,速率太大或离心时间太长,部分游离药物也可能同时沉淀下来[8]。

本实验采用的速率和时间基本上能很好地分离游离药物和脂质体。

本实验制备的脂质体包封率为92.57%,载药量23.24%,室温保存1个月,药物未见有明显的渗漏。

药物的体外释放符合Higuchi 方程,可能由于其不均匀分布于载体上[9]。

脂质体的形态为封闭的多层囊状或多层圆球。

其大小直接关系到其在体内的分布部位,也是评价脂质体质量的一个重要指标。

当粒径大于100nm 小于200nm 时,药物载体能被网状内皮系统的巨噬细胞从血液中清除,最终达到肝脏枯否细胞的溶酶体中[9]。

本实验所制备的脂质体平均粒径为179nm 左右,符合肝靶向要求。

本实验考察了在形成稳定的乳剂时不同的分散法、匀浆法和超声法对包封率的影响,结果2种分散法的包封率和载药量差别不是很大,但超声法费时且随着超声时间的增加,药物就会有一定的渗漏。

参考文献:[1]　张喜平,李宗芳,刘效恭.黄芩素的药理学研究概况[J ].中国药理学通报,2001,17(6):711-31[2]　胡景莲.脂质体制备方法的研究进展[J ].中国临床医药研究杂志,2004,(113):11872-118741[3]　仵文英,席枝侠,薛红安,等.黄芩苷脂质体制备工艺的研究[J ].中国药师,2004,7(9):664-6661[4]　马淑贤,丁玉玲,王海波,等.卡氮芥脂质体注射液的研究[J ].中国药学杂志,l995,30(6):345-3481[5]　邓意辉,王绍宇,吴琼.中药生物碱类脂质体及其制备.中华人民共和国国家知识产权局[P].专利申请号02158899.6.[6]　杨时成,朱家壁,梁秉文,等.喜树碱固体脂质纳米粒的研究[J ].药学学报,1999,34(2):146-150.[7]　于波涛,张志荣,刘文胜.提高脂质体包封率的方法及其研究进展[J ].中国医药工业杂志,2002,33(11):564.[8]　万东华,高瑜,周训胜,等.硫酸氢黄连素脂质体的制备工艺研究[J ].福州大学学报,2004,32(1):98-100.[9]　徐辉碧.纳米医药[M].北京:清华大学出版社,2004.38-40.高效液相色谱法测定青羚散中甘草酸的含量杨玉静,刘玉成,韩雪梅,李文春(哈药集团中药二厂,黑龙江哈尔滨150078)摘　要:目的:为了更好的控制青羚散的产品质量,对该药中甘草酸进行定量研究。