禽流感采样方法
禽流感病毒标本采集及PPT课件
汇报人：可编辑 2024-01-11
目录
• 禽流感病毒概述 • 禽流感病毒标本采集方法 • PPT课件制作技巧 • 禽流感病毒防控措施 • 案例分析
禽流感病毒概述
01
定义与特性
定义
禽流感病毒是一种属于正粘病毒 科甲型流感病毒属的病毒，主要 感染鸟类，尤其是家禽和野生鸟 类。
成功案例三
介绍第三个成功的禽流感病毒防控案例，总结其 防控策略和效果。
疫苗研发与应用情况
疫苗研发进展
介绍当前禽流感病毒疫苗的研发情况，包括疫苗类型、研发进程 等。
疫苗应用情况
分析疫苗在本地区的应用情况，包括接种范围、接种效果等。
疫苗未来发展
展望未来疫苗研发和应用的趋势，提出相关建议和展望。
THANKS.
地方建场。
养殖场布局
合理规划养殖区、生活 区和工作区，保持一定 距离，减少交叉污染。
养殖场消毒
定期对养殖场进行全面 消毒，包括禽舍、工具
、饲料和水源等。
养殖场管理
加强养殖场管理，保持 环境卫生，及时清理粪 便和废弃物，避免病毒
传播。
公众的日常防护措施
01
02
03
04
避免接触活禽
尽量避免在活禽市场和养殖场 逗留，不购买和食用未经检疫
按照标准操作规程进行采集，确保采 集过程中无菌操作，避免交叉感染。
采集后的处理与保存
01
02
03ห้องสมุดไป่ตู้
标本标记与记录
对采集的标本进行详细标 记，记录相关信息，以便 后续分析。
标本保存
将采集的标本保存在适当 的介质中，如细胞培养液 或生理盐水中，并保持低 温状态，以便后续检测。
禽流感实验室检测方法
禽流感实验室检测方法一、标本的采集与处理(一)标本的采集1、病毒分离标本的采集病毒分离成功与否很大程度上取决于采集标本的质量，及其保存、运输等环节。
多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物，有时也采用肺活检材料等。
标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，常用的采样液为：普通肉汤，pH7.4-7.6的Hank's、Eagle's或水解乳蛋白液。
为防止细菌和真菌生长，在采样液中需加入抗菌素，以往抗菌素多用青、链霉素，近来发现不少种类细菌对它们具有耐药性，故近来多用庆大霉素（其终浓度为每ml采样液中加入0.1 ml的10mg/ml）和抗真菌药物（终浓度为每毫升采样液中加入0.008 ml的250ug/ ml）。
主要的采集方法有以下几种：1)鼻拭子：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。
以同一拭子拭两侧鼻孔。
将棉签浸入4-5 ml采样液中，尾部弃去。
2)咽拭子：用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将棉签头浸入4-5 ml 采样液中，尾部弃去。
注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。
3)鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器（国外有售）从鼻咽部抽取粘液。
先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。
收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器3次。
由于该收集器国内难买到，也可采用国内一种设计装置（见郭元吉、程小雯著，流行性感冒病毒及其实验技术。
中国三峡出版社P186，1997）。
4)鼻洗液：患者取坐姿，头微后仰，用移液管将1-1.5ml洗液注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。
然后让患者低头使洗液流出，用平皿或烧杯收集洗液。
重复此过程数次。
洗两侧鼻孔最多可用10-15 ml洗液。
5)漱口液：用10 ml洗液漱口。
漱时让患者头部微后仰，发“噢声”，让洗液在咽部转动。
然后，用平皿或烧杯收集洗液。
注：取鼻洗液和漱口液时，需预先了解患者是否对抗菌素有过敏史，如有则洗液和含漱液中不应含有抗菌素。
人禽流感标本采集及实验室检测技术方案
标本包装
表1
姓名 性 别
人禽流感待查病例标本送检单
年 龄 现住址 发 病 日 期 标 本 种 类 主要临床表现
标本量 （g或ml）
采集 日期
体温 (℃）
咳 嗽
咽 痛
肺 炎
其 他
备注
注：主要临床表现：体温填写最高温度，其它栏符合的打“√”。 采样人： 收样人： 采集单位： 收样单位： 送样人 ： 收检日期： 送检日期： 年 月 年 日 月 日
MEM/DMEM液
∆
在采样液中加入的抗菌素 青、链霉素（终浓度100U＜mg ＞ /ml） 庆大霉素（终浓度1mg/ml） 抗真菌药物（终浓度2µg/ml）
标本包装
标本采集后在生物安全Ⅱ级实验室生物安全柜内分装成一式
三份（分装标本的生物安全柜不能用于提取核酸）。一份当地
检测用，一份送中国疾病预防控制中心检测，一份保存以备复 核
可用小孩导尿管接在50ml注射器上来替代收集）。
∆
胸水:在B超定位下进行胸腔穿刺，抽取胸水5ml，置于无菌的塑
料螺口管中。
标本采集方法
∆
肺组织活检标本：在超声或X线定位下,经皮穿刺取肺组织活检
标本,置于含3ml采样液的塑料螺口管中。
∆
尸检标本：每一采集部位分别使用不同消毒器械，以防交叉污 染；每种组织应多部位取材，各部位应取20～50g，淋巴结取 2个。
人禽流感标本采集、保藏、运送 及实验室检感疑似病例 人禽流感临床诊断病例 需要进一步研究的确诊病例 其他需要排除人禽流感诊断或排除者 需要采集的环境标本
标本采集要求
∆
从事人禽流感检测标本采集的技术人员必须经过生物安全培
训和具备相应的实验技能。在标本采集过程中，采样人员参
人禽流感标本采集、运送、处理及保存的操作规程
人禽流感标本的采集、运送、处理及保存操作规程一、目的规范人禽流感标本的采集、运送、处理及保存操作。
二、适用范围本操作规程适用于人禽流感标本的采集、运送、处理及保存。
三、简介人禽流感检测过程中，采集的标本包括鼻咽拭子、漱口液、血液等。
本实验室一般用鼻咽拭子或漱口液进行病毒分离与分子生物学检测，血清用于人禽流感抗体检测，采集血液部位一般位于前臂肘静脉。
四、器材1、用于血液收集的基本耗材包括：医用（5ml和10ml）一次性注射器、一次性乳胶手套、止血带、碘酒、无菌拭子、血清储藏管、标本标签、创可贴、可封口塑料袋、标本采集表格、带有冰袋的冰壶、棉拭子、污物桶、笔、试管架。
2、用于鼻咽拭子、漱口液等收集的基本耗材包括：一次性乳胶手套、防护服、十二层口罩（或N95口罩）、采样无菌棉签、采样液（螺口塑料管装）、可封口塑料袋、带有冰袋的冰壶、污物桶、样品登记表、笔、试管架。
附：血清保存管：2 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）；鼻咽拭子保存管：10 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）；尸检组织冻存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)；记号笔：油性，防水。
五、人禽流感标本采集操作规程（一）标本采集要求1．采样人员须以无菌操作采集各类标本。
采集标本所使用的容器、采样液等均应无菌。
编制：福建省疾控中心病毒性疾病防治科审核：沈晓娜批准：严延生2. 每份标本必须标明标本编号、标本种类及采集日期。
采集单位应指定专人负责标本的登记、收集和管理，并认真填写“人禽流感标本采集登记表。
”3.所有标本的收集、运输和保藏都应装在有螺旋盖的塑料管中，以防止开、关标本管时产生气溶胶，并用两层清洁塑料袋包裹严实。
4.采集的标本应立即送当地疾病预防控制机构，同时附上标本送检单。
如不能立即送交，可置-20℃以下冰箱短暂保存（24小时之内）。
（二）标本采集种类与方法标本采集的时间、位置及质量对能否分离到病毒或提取到有活性的RNA至关重要，而标本保存与运输不当，也会影响病毒的分离。
禽流感环境标本采集及运输
环境标本处理和分装
➢环境标本置4℃可以保存1天，超过1天需置-70℃或以下保存。 ➢每份擦拭标本内采样液5ml，水标本每份5-10ml。
标本的送检和运输
INFECTIOUS SUBSTANCE In case of damage or leakage
Immediately notify Public Health authority
❖ 例：九龙坡2016年环境样编号：C16070001-C16070072，血样编号：B16070001-B16070050。 ❖ 南岸：C16070073-C16070144，血样编号：B16070073-B16070122。
II.血清标本采集
标本要求：采集监测对象血5mL（当年10月至次年3月）。 采集方法：使用真空负压采血套装管或注射器均可，同时做好标记，采集后填写相应的 附表。
III.环境标本采集
采样液： 采用RPMI1640、MEM、DMEM、Hank’s液或Eagle’s等培养液加入以下抗菌素。
每份标本采样液5ml。
环境标本种类及采集方法
1、水标本 1.1禽类饮用水：在每个笼具旁的饮水槽采集一份饮用水标本,将水槽中的水样用无菌的、一次旋盖的管内。 1.2水沟或水池：在水沟或水池不同部位共收集水标本5-10ml置于15ml外螺旋盖的管内。 1.3清洗禽类的污水：采集方法与禽类饮用水采集方法相同。
方法与采集笼具表面擦拭标本的方法相同拭子要擦拭禽肉接触最多的部位20201114103粪便标本从禽舍或环境中采集新鲜禽类粪便新鲜禽类粪便样品35g左右放入含5ml采样液的采样管中充分混匀
禽流感环境标本采集及运输
主要内容 标本的种类和采集方法
标本的处理和分装 标本的送检和运输 采样送检存在的一些问题
禽流感采样方法
二、环境标本采集、处理、保存和运输（一）标本采集和处理1、采样液环境标本采样液可用Hank's或Eagle's等培养液加入以下抗菌素和0.5%BSA：氨苄青霉素(2x106 IU/L)、链霉素(200mg/L)、多粘菌素B(2x106 IU/L)、庆大霉素(250mg/L)、制霉菌素(0.5x106 IU/L)、盐酸氧氟沙星(60mg/L)、磺胺甲基异恶唑(200mg/L)。
2、标本种类、采集方法及处理（1）水标本在禽类活动或笼具旁的水沟或水池不同部位共收集水标本5-10ml置于15ml外螺旋盖的管内。
水样标本到实验室后应在采样管中加入上述抗生素和0.5%BSA，再分装。
如果采集水标本中存在固体等物质，应将采集标本在无菌条件下反复吹打，以打碎固体物质，置4℃待其自然沉淀30min，也可3000rpm离心10min，取上清分装。
（2）笼具表面标本每个笼具采集1份标本放在1个单独采样管中。
用蘸有采样液的带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭笼具表面禽类最常接触的3-5个不同部位（包括笼具底部），然后将擦拭过的拭子放入含5ml采样液采样管中，尾部弃去。
也可用多个拭子充分擦拭笼具表面后放到1个采样管中。
环境标本要在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以打碎固体，置4℃待其自然沉淀30min，也可3000rpm离心10min，取上清分装。
（3）宰杀或摆放禽肉案板表面的擦拭标本如宰杀或摆放禽肉使用不同案板，可采集擦拭标本放到不同采样管中。
方法与采集笼具表面擦拭标本相同，拭子要擦拭禽肉接触最多部位。
（4）粪便标本从禽舍或环境中采集新鲜禽类粪便样品3-5g左右，放入含5ml采样液的采样管中。
采集的粪便标本要在无菌条件下反复吹打，以打碎粘液和固体物质，置4℃待其自然沉淀30min，也可3000rpm离心10min，取上清分装。
（5）清洗禽类的污水如有清洗禽类的污水盆或桶，可采集清洗禽类的污水标本。
将水槽中水样用无菌的、一次性的玻璃棒或棉签充分混匀后采集5-10ml置于15ml外螺旋盖的管内。
人感染H7N9禽流感病毒鼻咽拭子标本
人感染H7N9禽流感病毒鼻咽拭子标本采集方法
采样物品：
•采样液、专用病毒采样拭子由市疾控中心提供，其他物品（如冷藏箱，采样时的生物安全防护用品等）自备。
•二、鼻咽拭子采样方法
•1、鼻拭子：将带有聚丙烯纤维头的鼻咽拭子轻轻插入鼻道内，轻轻转动鼻咽拭子，并向鼻腔内部推进至鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出，将拭子头浸入采样液中，尾部折断弃去。
•2、咽拭子：用带有聚丙烯纤维头的鼻咽拭子用力擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入采样液中，尾部折断弃去。
禽流感标本送检流程
一、标本的采集(一)标本采集人员医疗机构的医生、护士或当地疾病预防控制中心专业人员负责标本采集并填写标本登记表，标本采集人员按照《与禽流感病禽密切接触者个人防护指导原则（试行）》做好个人防护。
(二) 采集对象禽流感病人，疑似病人，根据需要可采集病禽以及人禽流感密切接触者。
（三）标本采集种类和时限1. 采集标本的种类疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液、血清、粪便以及死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物、其它脏器。
2 .采集标本时间1）咽、鼻拭子或含漱液、粪便在发病的头3天采集。
2）急性期血清在发病后7天内采集，恢复期血清在发病后2-4周采集。
3）尸检标本尸检时采集。
3. 标本的运送采集的标本若不能在24小时内送达，则应尽快在－70 ℃以下保存。
无－70 ℃条件的需在－20 ℃冰箱短时间暂存，并尽快联系递送标本。
4. 标本采集的方法4.1病毒分离标本应采集发病后3天内相关标本进行分离病毒。
标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，常用的采样液为：普通肉汤，pH7.4-7.6的Hanks，Eagles或水解乳蛋白液。
在采样液中需加入抗菌素，抗菌素多用青、链霉素（1000U/ ml），庆大霉素（其终浓度为每ml 采样液中加入0.1 ml的10mg/ ml）和制霉菌素（终浓度为50ug/ ml）。
主要的采集样本的方法有以下几种：1）鼻拭子：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。
以同一拭子拭两侧鼻孔。
将棉签浸入4-5 ml采样液中，尾部弃去。
2）咽拭子：用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将棉签头浸入4-5 ml采样液中，尾部弃去。
3）鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。
先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。
收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器3次。
4）鼻洗液：患者取坐姿，头微后仰，用移液管将1-1.5 ml洗液注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。
然后让患者低头使洗液流出，用平皿或烧杯收集洗液。
禽流感的采样及实验室诊断L
禽流感送检样品的采集
3
采样器械的准备
动物检疫器械箱，保温箱或保温瓶，解剖刀， 剪刀，镊子，酒精灯，酒精棉，碘酒棉，注射 器及针头。
样品容器（如西林瓶，平皿， 1.5mL 塑料离心 管， 10mL 玻璃离心管及易封口样品袋，塑料 包装袋等）。
试管架，塑料盒（ 1.5mL 小塑料离心管专用）， 铝饭盒，瓶塞，无菌棉拭子，胶布，封口膜， 封条,冰袋。 采样刀剪等器具和样品容器须经无菌处理。
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封锁令解除后无病监测
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封锁令解除后无病监测
疫区内重新使用的禽舍中饲养高致病性 禽流感非免疫禽，或者设立50只岗哨动 物，进行临床症状观察和血清学检测， 如果禽群有发病或死亡，应采集死禽样 品送检分离病原；血清学检测分别在重 新饲养非免疫鸡或设立的岗哨动物后0d、 30d和5个月时对感染场、危险接触场和 可疑场进行，检测数量按照置信水平为 95%，检出率低于5%的数量计算。
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病毒分离与NASBA的比较
病毒分离鉴定 ＋
病毒分离鉴定 －
NASBA ＋
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NASBA －
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病毒分离与PCR的比较
病毒分离鉴定 ＋
病毒分离鉴定 －
RT－PCR ＋
1
0
RT－PCR －
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0
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荧光RT—PCR技术
本方法为国家标准。理论上灵敏度较高， 但本实验室尚未应用。其基本原理与RT-PCR相 似。但结果通过荧光信号来检测，不需要取出 扩增样品进行电泳检测，对环境污染少。通过 本方法可以对H5、H7、H9亚型进行鉴定。
不干胶标签、签字笔、圆珠笔、记号笔、采样 单、记录本等；口罩、一次性手套、乳胶手套、 防护服、防护帽、胶靴等。
人感染H7N9禽流感病毒标本采集、运送及保存
100 A/chicken/Karachi/NARC-23/2003_H7N3_Pakistan A/quail/Aichi/1/2009_H7N6_Japan
87
99
A/duck/Hong_Kong/301/1978_H7N2_Hong_Kong
A/black_kite/Egypt/054/2004_H7N7_Egypt
时-70℃冻存。流感病毒在-20℃～-40℃时不稳 定，故长期保存应在-70℃温度以下，不要冻存 于-20℃，会降低流感病毒的检出率 ➢ 避免反复冻融，冰上一周也比冻融一次要好 ➢ 血清标本暂时存在可在4℃冰箱，长期保存于20℃冰箱。
标本包装和运输
➢ 根据《人感染H7N9禽流感疫情防控方案（第一 版）》规定，H7N9禽流感病毒实验室活动和样本 运输按照《人间传染的病原微生物名录》中高致 病性禽流感病毒进行管理
在无菌的带螺旋塑料管分装2-3ml采样液。最好储存在:– 20℃,4℃可放48–96h,室温1–2天。
➢ 采样拭子：使用头部为聚酯纤维的病毒采样拭子（鼻 及口咽型），铝或塑料做柄，不推荐棉拭子和木柄
采集对象
1.监测病例，同时具备以下4项条件的病例： （1）发热(腋下体温≥38℃)； （2）具有肺炎的影像学特征； （3）发病早期白细胞总数降低或正常,或淋巴细胞分类计 数减少； （4）不能从临床或实验室角度诊断为常见病原所致肺炎。
核酸检测流程
• 若检测结果为甲型通用阳性，H7N9阴性，送剩余 的2份呼吸道相关原始标本送当地市级流感网络实 验室进行其他流感病毒型别鉴定；
• 市级流感网络实验室若不能分型或H5阳性标本应 立即送省级疾控中心流感参比实验室；
• 若检测结果全部阴性，将剩余的2份呼吸道相关原 始标本送省级疾控中心进行SARS、新冠状等病原 体检测；
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二、环境标本采集、处理、保存和运输
（一）标本采集和处理
1、采样液
环境标本采样液可用Hank's或Eagle's等培养液加入以下抗菌素和0.5%BSA：氨苄青霉素(2x106 IU/L)、链霉素(200mg/L)、多粘菌素B(2x106 IU/L)、庆大霉素(250mg/L)、制霉菌素(0.5x106 IU/L)、盐酸氧氟沙星(60mg/L)、磺胺甲基异恶唑(200mg/L)。
2、标本种类、采集方法及处理
（1）水标本
在禽类活动或笼具旁的水沟或水池不同部位共收集水标本5-10ml置于15ml外螺旋盖的管内。
水样标本到实验室后应在采样管中加入上述抗生素和0.5%BSA，再分装。
如果采集水标本中存在固体等物质，应将采集标本在无菌条件下反复吹打，以打碎固体物质，置4℃待其自然沉淀30min，也可3000rpm离心10min，取上清分装。
（2）笼具表面标本
每个笼具采集1份标本放在1个单独采样管中。
用蘸有采样液的带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭笼具表面禽类最常接触的3-5个不同部位（包括笼具底部），然后将擦拭过的拭子放入含5ml采样液采样管中，尾部弃去。
也可用多个拭子充分擦拭笼具表面后放到1个采样管中。
环境标本要在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以打碎固体，置4℃待其自然沉淀30min，也可3000rpm离心10min，取上清分装。
（3）宰杀或摆放禽肉案板表面的擦拭标本
如宰杀或摆放禽肉使用不同案板，可采集擦拭标本放到不同采样管中。
方法与采集笼具表面擦拭标本相同，拭子要擦拭禽肉接触最多部位。
（4）粪便标本
从禽舍或环境中采集新鲜禽类粪便样品3-5g左右，放入含5ml采样液的采样管中。
采集的粪便标本要在无菌条件下反复吹打，以打碎粘液和固体物质，置4℃待其自然沉淀
30min，也可3000rpm离心10min，取上清分装。
（5）清洗禽类的污水
如有清洗禽类的污水盆或桶，可采集清洗禽类的污水标本。
将水槽中水样用无菌的、一次性的玻璃棒或棉签充分混匀后采集5-10ml置于15ml外螺旋盖的管内。
水样标本到实验室后应在采样管中加入抗生素和0.5%BSA，再分装。
方法与采集水标本相同。
（6）禽类饮用水
在每个笼具旁的饮水槽采集1份饮用水标本。
方法与采集清洗禽类的污水标本相同。
（7）其他
包括地面污水、地面灰尘及笼具垫草等。
（二）环境标本保存和送检
环境可置4℃存放2天，存放超过2天需置-70℃或以下保存。
环境标本处理后，将原始标本分为3份，1份用于核酸检测，1份保存备用，1份备用送国家流感中心，送检量不少于1.5ml。
检出阳性后1周内送省疾控中心急传所实验室后统一运送国家流感中心。
所有标本要求-70℃或以下保存。
（三）标本运输
标本放入专用运输箱内（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力材料。
同时寄送标本登记表。
运输要求符合国家生物安全有关规定。
病原学标本按B类感染性物质运输。