小鼠卵巢自体移植后血管重建及移植部位血管密度的实验观察

小鼠卵巢自体移植后血管重建及移植部位血管密度的实验观察作者：孙静，党玲王燕蓉，贺晓亮，崔岫，沈新生朱万平【摘要】目的观察小鼠卵巢自体异位移植物与受体移植部位的血供重建时间及移植部位血管密度对移植物存活的影响。

方法成年小鼠卵巢剥膜后一分为二，体外培养3h后进行半卵巢自体异位移植于肾被膜下和颈部皮下，实验分为新鲜组、肾背膜下移植组、颈部皮下移植组，于移植后 36 h取材，通过墨汁灌注和组织切片技术，观察卵巢移植后血管重建及卵泡存活情况。

结果肾被膜下移植组可见有贯穿肾组织至卵巢组织之间的血管，正常卵泡计数较多，与颈部皮下移植组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。

肾组织血管密度明显大于颈部皮下组织(P＜0.05)。

结论富含血管的肾被膜下移植较血管较少的颈部皮下移植更有利于卵巢组织移植后的血供重建。

【关键词】半卵巢；自体移植；小鼠；血供建立卵巢冻存后移植为恢复女性因癌症治疗而丧失的卵巢功能提供了一个可选择的途径，然而有研究表明，在冻融过程中大约有7％的卵泡丢失，而在移植后血管再生过程中有约65％的卵泡丢失［1］。

因此找到一种既有利于血管生长、避免缺血损伤，又有利于卵泡发育的办法十分必要。

目前常用于观察血管生长的方法是通过免疫组织化学的方法观察血管内皮细胞，该方法操作繁琐，费用较高，耗时较长。

为了观察卵巢移植后血管由受体移植部位进入移植物的真实状况、比较不同移植部位血管密度对移植物存活的影响，我们以成年小鼠为实验对象，采用简易的墨汁灌注法观察移植后血供建立的状况。

1 材料与方法1.1 实验动物及分组昆明种属雌性小白鼠，由宁夏医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(宁2005-001)，体重(20±2)g；将小白鼠随机分为①对照组(control group，CG)，8只；②肾被膜下移植组(kindey capsule transplantation group，KTG)，8只；③颈部皮下移植组(neck subcutaneous tissue transplantation group，NTG)，8只。

1.2 实验用液体培养用液DMEM+F12+10%FCS作为基液配制，墨汁灌注液的配制如下：中华牌墨汁∶PBS∶30％甲醛为4∶5∶1，灌注液中同时含0.5％肝素。

1.3 方法1.3.1 移植方法取动情间期昆明小鼠，用0.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(0.2mL/10g)。

75%碘酒、酒精消毒背部皮肤，在左侧肋脊角处逐层切开单侧的皮肤和肌肉，暴露该侧卵巢，自输卵管处结扎卵巢动静脉，完整切除卵巢，剥去外膜后将卵巢一分为二，体外培养3h，待移植。

1.3.2 实验分组及处理方法CG：右侧卵巢切除后进行固定、石蜡包埋、组织切片，HE染色。

KTG：切除右侧卵巢留作组织切片对照，充分暴露该侧肾脏，用显微手术镊轻轻提起肾脏被膜，用显微手术剪在肾脏上端将肾脏被膜剪开一个小口，将卵巢移入切口由肾脏上端轻柔地推向下端。

由于肾脏被膜有一定的张力，组织放入后不需缝合被膜，将肾脏送回腹腔原位后，依次缝合手术切口。

术后每只小鼠腹腔注射3～4万IU青霉素以防感染，移植术后36h取材。

NTG：切除右侧卵巢留作组织切片对照，消毒颈背部皮肤，用手术剪剪开约1.5mm的小口，钝性分离皮下组织，将培养卵巢放入小口内，缝合并留结扎线做记号，缝合皮肤，移植36h后取材。

1.3.3 取材方法腹腔注射0.5%戊巴比妥钠(0.3mL/10g)麻醉小鼠后，逐层打开胸腔，将注射器于心尖部插入左心室内，在1min内匀速注射1.5～1.8mL灌注液。

灌注的同时开窗右心耳，同时注意观察小鼠的眼、耳、口腔黏膜、趾端、尾巴。

当它们均变黑时，证明灌注成功。

停止灌注约2min后取材。

1.4 观察指标光学显微镜下观察移植卵巢内有无墨汁并计数正常卵泡数及移植部位血管密度1.4.1 组织切片观察卵巢组织或器官制作成5μm石蜡切片，经苏木精-伊红(HE)染色后观察血管内有无墨汁、卵泡、卵母细胞和颗粒细胞的结构。

1.4.2 正常卵泡计数每只小鼠随机取5张切片，每张切片随机选取3个高倍视野，HE染色后，光学显微镜下计数正常卵泡的数量。

正常的卵泡为包含一个完整的卵母细胞和排列整齐的颗粒细胞层。

相反，若卵母细胞核固缩、卵母细胞萎缩、颗粒层排列紊乱等出现一项就表明卵泡退化。

1.4.3 移植部位血管密度计数每个标本随机取5张切片，每张切片随机选取3个高倍视野，光学显微镜下计数墨汁数量。

因肾小球均显示墨汁灌注，故不计算在内。

墨汁点、墨汁条均计算为血管，1.5 统计学方法采用SPSS 11.5统计软件进行方差分析及t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 移植物与移植部位血供重建的观察通过血管内的墨汁观察，显示肾组织血管系统丰富、灌注充分。

颈部皮下组织血管明显较肾组织内少，具体结果见表1，图3、4(见封2)。

移植卵巢血管密度计数两组差异有统计学意义。

颈部移植物内未见移植卵巢内出现墨汁，但肾被膜下移植组，可见有贯穿肾组织至卵巢组织之间的血管被墨汁填充，移植物内墨汁也已充斥在卵泡和间质腺周围的卵巢间质中(图1，见封2)。

表1 KT及NT血管密度计数2.2 不同组别小鼠存活卵泡情况NTG可见多量初级卵泡，卵泡结构保存较好，卵巢组织切片中卵泡形态与新鲜卵巢相近，结构正常，卵母细胞保持圆形，透明带完整，周围颗粒细胞形态正常。

而KTG存活卵泡较少，以原始卵泡为主。

移植组卵泡计数与新鲜组间差异均有统计学意义，具体结果见表2，图1、2(见封2)。

表2 移植卵巢内存活卵泡计数3 讨论卵巢组织在切取和移植等一系列环节中，不可避免会造成一定程度的缺血损伤。

而影响移植成功的一个重要因素就是重新建立丰富的血供。

如何使卵巢组织的血管快速重建，尽可能地缩短缺血时间是移植后卵巢组织存活的关键。

有研究者认为，移植后卵巢组织的血供完全依靠周围毛细血管的生长［2］。

因此，降低缺血缺氧损伤的一种方法就是寻找到具有丰富血管的移植部位，使卵巢组织能快速恢复血液供应。

许多研究表明，肾脏因血供丰富且是免疫缺陷区而有利于移植卵巢的存活和卵泡发育［3］，也有报道将孕18d大鼠胚胎卵巢组织分别移植到颈部和肾被膜下，其最终生长发育情况有统计学意义，但以肾被膜下对血供和功能恢复更有利［4］。

有学者研究了免疫缺陷鼠不同部位的卵巢组织移植后血管形成速度，发现移植在肾被膜下的移植物血管形成较皮下移植快［5-7］。

然而，无论是肾被膜下还是颈部皮下，目前尚少见关于这两处具体血管数量与移植卵巢血供和存活状态间关系的报道。

本研究利用改良的墨汁灌注法进行移植部位与移植物间血供建立与否、移植部位血管密度和卵泡存活状况的观察，发现肾脏与颈部皮下组织间血管密度计数差异存在统计学意义。

肾被膜下移植组在移植36h后移植物与受体部位重新建立了血供，可见到贯穿肾组织至卵巢组织之间及卵巢组织内的血管，但颈部皮下移植组尚未建立。

同时肾被膜下移植组在移植36h后正常卵泡计数明显多于颈部移植组。

其主要原因可能是颈部有限的血管使血供建立延迟，免疫反应也不能除外。

尽管肾被膜下有丰富的血管有助于移植卵巢的血管重建，但肾被膜下空间有限，无法实现对大的卵巢皮质的移植。

同时，人卵巢组织的移植不可能在肾被膜下进行。

因此，肾被膜以外的移植部位就显得十分重要。

Dissen 等将未成熟大鼠卵巢皮质组织自体移植到颈部皮下，发现2d内建立其新的血液供应，卵巢组织生长良好，但很少甚至没有生长卵泡在移植后存活［9］。

我们将成年小鼠卵巢移植于颈背部皮下内，移植后36h取材未见到血管建立，但从有正常原始卵泡存在这一事实来看，卵泡并未全部退化，其确切的效果还有待延长移植观察时间来进一步证实。

国外有学者报道［10］小鼠同种异体移植实验中，背部肌肉是最理想的移植部位，其原始卵泡的存活率及血管支撑均优于肾被膜下移植，并通过IVF和ICSI辅助生殖技术均获得了健康仔代。

因此对于组织、器官最佳移植部位的选择还需要大量的研究与探索。

综上所述，移植部位血管密度影响移植物的存活和发育。

肾脏血管密度远远大于颈部，故移植卵巢内的正常卵泡数也多于颈部移植组。

因此，对于器官或组织的移植来说，应该根据移植物的大小选择血管相对丰富的部位最为恰当。

【参考文献】［1］ Aubard Y，Piver P，Cogni Y，et al.Orthotopicand heterotopyic autographts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep［J］.Hum Reprod，1999，14(8)：149.［2］张佳荣，严沁.卵巢组织冷冻保存和移植的研究进展［J］. 现代妇产科进展，2003，12(2)：132-134.［3］ Namba I，Yamamoto L，Arishima K，et al.Suppressive effects of fetal testes on development of fetal ovariestransplanted into adult males in the rat［J］. J Vet Med Sci，1994，56(6)：1113-1118.［4］曹金燕，史小林，诸定寿.大鼠胚胎卵巢移植的形态与功能分析［J］.首都医科大学学报，2000，21(4)：231-233.［5］ Abir R，Orvieto R，Raanani H，et al.Development of human fetal follicles in and immunodeficient mouse［J］. J Assist Reprod Genet，2000，17(7)：393-396.［6］Gook D A，Shaw J，Jenkin G.Transplantation of cryopreserved fetal ovarian tissue following xenografting［J］. Human Reprod，2001，16：417-422.［7］ Natalia Posa，Lisa，Kolp Jairo E.Fertility opitions for female cancer paitients：factors adfiction［J］. Fertil Steril，2001，75(4)：647-653.［8］ Gook DA，Mccully BA，Edgar DH，et al． Development of antral follicles in human cry-preserved ovarian tissue following xenografting［J］. Hum Reprod，2001，16(3)：417-422.［9］Gosden RG.Transplantation of ovaries and testes//Edwards RG(ed.).Fetal Tissue Transplants in Medicine ［M］.Cambridge：Cambrige University Press，1992：253-279.［10］ R Soleimani，J Van der Elst，et al.Back muscle as a promising site for ovarian tissue transplantation，an animal model Hum［J］. Reprod，2008 23(3)：606-618.。