实验一 小鼠抗绵羊红细胞抗体的制备与检测
溶血空斑实验报告
一、实验目的1. 掌握溶血空斑实验的基本原理和方法。
2. 了解溶血空斑实验在免疫学中的应用。
3. 检测实验动物抗体形成细胞的功能。
二、实验原理溶血空斑实验（Plaque Forming Cell assay, PFC）是一种体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的方法。
其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液，与高浓度绵羊红细胞混合后加入琼脂糖凝胶中。
其中每个释放溶血性抗体的B淋巴细胞在补体的参与下可溶解周围的绵羊红细胞，在周围形成一个可见的空斑。
一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B细胞），空斑的数量反映机体的体液免疫功能。
空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。
三、实验材料与试剂1. 器材：平皿、37℃水浴箱、离心机、显微镜、移液器、吸管等。
2. 试剂：（1）SRBC悬液：取无菌脱纤维羊血，用NS或PBS离心洗涤3次，每次以2000rpm，5min，用PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）悬成细胞浓度为2.0×10^9个/mL。
（2）Hanks液（含Ca2+、Mg2+）：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%两种浓度。
（3）底层基：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%浓度。
（4）表层基：将琼脂糖用Hanks液配成0.7%浓度。
（5）补体：新鲜豚鼠血清或小牛血清，56℃灭活30min。
四、实验方法1. 免疫脾细胞悬液的制备（1）小鼠免疫：取10只小鼠，每只小鼠腹腔注射1ml SRBC悬液，免疫3次，每次间隔2周。
（2）脾细胞悬液的制备：无菌取小鼠脾脏，剪碎，用生理盐水洗涤，加入适量生理盐水制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1.0×10^6个/mL。
2. 溶血空斑实验（1）将底层基加入平皿中，置于37℃水浴箱中溶化。
（2）取适量脾细胞悬液加入底层基中，轻轻混匀。
（3）加入适量表层基，轻轻混匀。
（4）加入适量补体，轻轻混匀。
（5）将平皿置于37℃水浴箱中孵育4h。
小鼠抗红细胞抗体elisa试剂盒样本处理及要求和操作步骤
4．
请每次测定的同时做标准曲线，zui 好做复孔。如标本中待测物质含量
过高（样本 OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值） ，请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（乘以 n 乘以 5） 。 5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6． 底物请避光保存。 7． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8． 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9． 本试剂不同批号组分不得混用。 tips:感谢大家的阅读，本文由我司收集整编。仅供参阅！
加待测样品 10μl（样品最终稀释度为 5 倍） 孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30. 配液：将 20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 20 倍稀释后备用。 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒 后弃去， 如此重复 5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50μl，空白孔除外。 7. 温育：操作同 3。 8. 洗涤：操作同 5。 9. 显色：每孔先加入显色剂 A50μl，再加入显色剂 B50μl，轻轻震 荡混匀，37℃避光显色 15 分钟. 10. 终止：每孔加终止液 50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。 11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD
（PH7.4） ，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实
验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
单克隆抗体制备流程图
单抗制备流程19７5年，Ｋｏｈｌer和Milｓtein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术.这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备(一）免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的ＭcＡb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×107/0.5ml ｉp （腹腔内注射)↓ 2～3周后第二次免疫 1×10７/0。
５ml ip↓ 3周后加强免疫（融合前三天）１×１07/0。
5ml ip或iv（静脉内注射）↓取脾融合2。
可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂,常用佐剂：福氏完全佐剂,福氏不完全佐剂.要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状,放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态．商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀.初次免疫Ag 1~50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│（一般0.８～１ml 0。
2mｌ/点）↓３周后第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ｉp│(ip剂量不宜超过０．5ｍl)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂,ｉp│(5～7天后采血测其效价，检测免疫效果）↓2~3周后加强免疫,剂量50～５０0μg为宜，ip或ｉv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新,如①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。
抗绵羊红细胞免疫血清制备
抗红细胞免疫血清的制备
一、绵羊红细胞抗原的制备
1．采血：无菌试管加EDTA-K2 5滴，静脉采血5ml，加入上述试管，混匀。
2．洗涤红细胞：抗凝血2000r/min离心5min，吸去上清，加入等量无菌生理盐水混匀，2000r/min离心5min，吸去上清，如此连续洗2次，最后一次2500r/min 离心10min以使SRBC密集管底，直至上清液透明无色再吸去上清液，留密集SRBC备用。
3．用生理盐水将SRBC配成需要浓度，即为试验用的SRBC悬液。
如需20%SRBC悬液时，则吸取1ml洗涤后的红血球加生理盐水4ml即成。
二、家兔血清的采集、分离与保存
自家兔耳缘静脉采血（用头皮针）2-3ml，加入塑料试管，温育，2000r/min
离心10min、分离血清分装于EP管中，留作阴性对照。
注：家兔耳静脉采血法：轻弹兔耳，再用75%酒精深擦，使其充血和消毒，然后刺破静脉，用注射器轻轻抽取血液。
三、免疫动物
按如下剂量及程序免疫：
1。
溶血效应实验报告
一、实验目的1. 了解溶血现象的原理。
2. 掌握溶血效应实验的基本操作方法。
3. 学习溶血素和补体在溶血反应中的作用。
4. 分析不同溶血效应的影响因素。
二、实验原理溶血现象是指红细胞破裂、溶解的一种现象。
溶血效应实验主要包括溶血素和补体在溶血反应中的作用。
溶血素是一种能与红细胞表面抗原结合，导致红细胞溶解的蛋白质。
补体是一种存在于血液中的蛋白质，参与机体免疫反应，可激活红细胞溶解。
三、实验材料与仪器1. 材料：新鲜鼠血、生理盐水、溶血素、补体、绵羊红细胞、抗绵羊红细胞抗体、小试管、移液器、离心机、显微镜等。
2. 仪器：水浴锅、振荡器、微量滴定板、温度计等。
四、实验方法1. 红细胞悬液的制备取新鲜鼠血10 ~ 20ml，放入盛有玻璃珠的三角烧瓶中振摇10分钟，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白质，使成脱纤血液。
加入生理盐水100ml，摇匀，1000~1500r/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水按上述方法洗涤2~3次，至上清液不显红色为止。
2. 溶血素和补体的添加取小试管6支，分别编号为1、2、3、4、5、6。
分别加入生理盐水、溶血素、补体、抗绵羊红细胞抗体、溶血素+补体、溶血素+抗绵羊红细胞抗体，各0.5ml。
3. 绵羊红细胞的添加向上述6支试管中分别加入0.5ml绵羊红细胞悬液，摇匀。
4. 观察与记录将试管置于37℃水浴锅中，观察30分钟，记录溶血现象。
五、实验结果与分析1. 实验结果（1）生理盐水组：红细胞无明显变化。
（2）溶血素组：红细胞明显溶解。
（3）补体组：红细胞无明显变化。
（4）抗绵羊红细胞抗体组：红细胞无明显变化。
（5）溶血素+补体组：红细胞明显溶解。
（6）溶血素+抗绵羊红细胞抗体组：红细胞无明显变化。
2. 实验分析（1）溶血素对红细胞具有溶解作用，溶血素组红细胞明显溶解。
（2）补体在溶血反应中发挥重要作用，溶血素+补体组红细胞明显溶解。
（3）抗绵羊红细胞抗体对溶血反应无影响，溶血素+抗绵羊红细胞抗体组红细胞无明显变化。
绵羊附红细胞体人工感染小鼠模型的建立
表 1 试验分组及感染方法
组号
感染来源
Ⅰ 阳性全血
感染方式 尾静脉接种
Ⅱ 纯化的羊附红细胞体 尾静脉接种
Ⅲ 阳性全血
腹腔接种
Ⅳ 纯化的羊附红细胞体 腹腔接种
Ⅴ
-
-
注：V 为空白对照组，下表同。
剂 量 （mL） 0.1 0.1 0.5 0.5 -
接种法和腹腔接种法，分别用 E. ovis 阳性全血和纯化 的 E. ovis 感染小鼠，并设空白对照组，感染 方 式 及 相 应的感染剂量见表 1。各组小鼠于室温下隔离饲养，饮 水为高 压 灭 菌 水 ， 饲 喂 经 Co60 照 射 过 的 商 品 颗 粒 饲 料。 1.2.5 感染模型的鉴定及评价 1.2.5.1 感染症状观察：自感染后 0 d 开始，每日定期 观察各组小鼠是否出现感染症状，当出现较明显的感 染症状时，对其进行剖检并观察病理变化。 1.2.5.2 鲜血压片和血液涂片染色检查：自感染后 0 d 开始，每日定期采集各组小鼠尾静脉血，分别进行鲜 血压片检查和涂片染色镜检， 观察各组小鼠感染情 况。 此外，观察并记录攻毒小鼠血液中 E. ovis 的首现 期 （首次出现 E. ovis 的天数）、 高峰期 （红细胞上 E. ovis 的数量＞75%时）和消失期（20 个视野中 E. ovis 消 失的天数）。 1.2.5.3 感染阳性、阴性及感染率的判定：将采集的新 鲜血液样品加等量生理盐水稀释后，吸取 1 滴置于载 玻片上，加盖玻片，置于 400 倍光学显微镜下观察。 判 断标准为：镜 下 观 察 10 个 视 野 ，发 现 血 液 中 有 球 形 、 卵圆形、哑铃形、逗点状和杆状小体，红细胞变成齿轮 状、星芒状、菠萝状，即为 E. ovis 感染阳性，感染 率 在 10%以下记为 “+”，10%～50%记为 “++”，50%～75%为 “+++”，75%以上记为“﹟”；镜下观察红细胞分布区 20 个视野，若无 E. ovis，且红细胞形态正常，即为感染阴 性。 1.2.5.4 小鼠血液中 E. ovis 的 PCR 检测：感染后 24 h 用尾静脉采血法，感染高峰期用心脏采血法，分别采 集小鼠血液， 按上述方法对其进行 E. ovis 的 PCR 检 测。 2 结果与分析 2.1 E. ovis 的形态特征 对附红细 胞 体 感 染 绵 羊 进
绵羊红细胞免疫小鼠实验流程
绵羊红细胞免疫小鼠实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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补体溶血实验报告
一、实验目的1. 理解补体溶血反应的原理。
2. 掌握补体溶血实验的操作方法。
3. 通过实验验证补体在免疫反应中的作用。
二、实验原理补体系统是机体免疫系统的重要组成部分，主要由一系列蛋白质组成。
当抗原与抗体结合后，可以激活补体系统，进而导致靶细胞的溶解。
本实验通过观察红细胞在补体存在下的溶血情况，来研究补体的溶血活性。
实验原理如下：1. 将抗原（如绵羊红细胞）与抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
2. 激活补体系统，产生具有溶血活性的物质。
3. 将溶血物质与红细胞混合，观察红细胞是否发生溶血现象。
三、实验材料与试剂1. 材料：绵羊红细胞、兔抗绵羊红细胞抗体、兔血清、生理盐水、蒸馏水等。
2. 试剂：溶血素、巴比妥缓冲液、NaCl溶液等。
四、实验步骤1. 准备2%绵羊红细胞悬液：取新鲜绵羊红细胞，用生理盐水洗涤3次，加入适量生理盐水制成2%悬液。
2. 准备兔抗绵羊红细胞抗体：将兔抗绵羊红细胞抗体用生理盐水稀释至适当浓度。
3. 设置实验组：将兔抗绵羊红细胞抗体加入绵羊红细胞悬液中，混匀，置于37℃水浴中孵育30分钟。
4. 设置对照组：将兔血清加入绵羊红细胞悬液中，混匀，置于37℃水浴中孵育30分钟。
5. 加入溶血素：向实验组和对照组中加入等量溶血素，混匀。
6. 观察溶血现象：将实验组和对照组分别加入等量生理盐水，观察红细胞是否发生溶血现象。
五、实验结果与分析1. 实验组：观察到红细胞发生明显的溶血现象，溶液呈粉红色。
2. 对照组：观察到红细胞未发生溶血现象，溶液呈红色。
结果表明，兔抗绵羊红细胞抗体可以激活补体系统，导致红细胞溶血。
而兔血清中不含有抗绵羊红细胞抗体，因此不能激活补体系统，导致红细胞溶血。
六、实验讨论1. 补体溶血实验是研究补体系统功能的重要方法之一。
本实验通过观察红细胞在补体存在下的溶血情况，验证了补体在免疫反应中的作用。
2. 实验结果表明，补体溶血活性与抗体种类、浓度、补体系统活性等因素有关。
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实验一小鼠抗绵羊红细胞抗体的制备与检测
实验原理：特异性免疫应答中，抗原可刺激机体产生特异性抗体。
抗原免疫动物所产生的免疫血清实际上是针对该抗原表面不同表位的多种抗原的混合物，又称为多克隆抗体。
用纯化抗原免疫动物是制备多克隆抗体的常用方法。
免疫血清的效价和特异性主要取决于抗原和实验动物两方面的因素。
欲获得高效价的免疫血清，需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性；并适时地加强免疫以诱导机体的再次应答。
欲获得高特异性的免疫血清，则必须保证抗原的纯度，在条件许可的范围内应对抗原进行最大限度的纯化。
此外，抗原的剂量、免疫途径、免疫时间以及动物和佐剂的选择等，都是影响免疫血清效价和特异性的重要因素。
实验步骤：
1、SRBC的制备：脱纤维防凝处理的绵羊血，加入适量生理盐水混匀，2000r/min离心5min，弃上清，再加入适量的生理盐水混匀，2000r/min离心5min，弃上清，利用生理盐水分别配制成上述浓度——20%SRBC、25%SRBC、30%SRBC、40%SRBC。
2、免疫小鼠：利用上述不同浓度的SRBC悬液给小鼠免疫，腹股沟皮下注射，每周1次，连续3周，每次0.1ml。
注意做好标志。
3、溶血素的检测
（1）第4周，摘眼球取血，将血置于4℃冰箱内5~10min。
（2）5000r/min离心5~10min。
（3）按表进行试验。
（4）全部加完后混匀，置于37℃水浴中30min。
4、结果判定：首先判定第7管，出现不溶血现象，说明对照正确。
然后判定1~6管如果出现溶血，说明试验成功，血清里含有溶血素。
若未出现溶血则说明血清里不含有溶血素或含量太低未检测出来。
实验结果：左边为20%的实验组，右边为40%的实验组，1~4里分别加的是空白、阴性、阳性、待测血清。
其中显色的3、4号为阳性，1、2号为阴性。
结果分析：根据4个管的颜色可知，待测小鼠血清为阳性，说明小鼠血清中含有抗绵阳红细胞抗原的抗体。
但是左边3号颜色比右边深，可能是在实验过程中操作不当所致。
实验二豚鼠过敏实验——I型超敏反应
实验原理：超敏反应是指已致敏的机体再次接触相同变应原时，所引起的自身组织损伤和（或）生理功能紊乱。
超敏反应是异常的或病理性的免疫应答。
I型超敏反应又称为速发型超敏反应或变态反应。
在I型超敏反应中，变应原首次进入机体，刺激浆细胞产生IgE，IgE的Fc段与肥大细胞或嗜碱粒细胞表面的FcɛR结合，使得IgE吸附在这些细胞的表面，这是致敏阶段。
当相同的变应原再次进入致敏机体时，即可与吸附在这些细胞表面的IgE结合，引起一系列反应，使这些细胞释放组胺等生物活性介质，引起I型超敏反应的发作，即发敏阶段。
组胺是一个主要的生物活性介质，它的迅速释放，能扩张小血管和增加毛细血管通透性、刺激平滑肌收缩、促进黏膜腺体分泌增加；导致血压下降、呼吸困难、腹痛，甚至引起过敏性休克，导致死亡。
实验方法：
1、致敏注射：在实验开始前2周，给豚鼠注射皮下注射1ml稀释的蛋清。
2、发敏注射：固定好豚鼠，找到心尖搏动处，用碘酒、乙醇溶液依次消毒后，给豚鼠心内注射1ml稀释的蛋清。
放开豚鼠，观察反应情况。
实验结果：豚鼠有轻微躁动反应，呼吸急促，但没有死亡。
结果分析：应有的现象为在注射后数分钟内，豚鼠会出现一系列症状，表现为兴奋不安、躁动、鼻翼煽动、抓鼻，呼吸急促、毛发耸立、四肢痉挛、跳跃甚至死亡。