丙型肝炎患者血清中丙型肝炎病毒交叉中和抗体的检测
病毒性肝炎血清标志物检查(一)
病毒性肝炎血清标志物检查(一)【摘要】病毒性肝炎的病原体为肝炎病毒，目前已明确的肝炎病毒有，5种，即甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)。
除HBV为双链DNA病毒外，其余均为单链RNA病毒。
我国是病毒性肝炎的高发区，尤以HAV、HBV、HCV的感染更为突出。
因此，准确、快速地检测肝炎病毒的标志物，对于病毒性肝炎的防治具有重要的意义。
临床上根据各种肝炎病毒有特异性的血清标志物，能准确地进行病毒性肝炎的分型。
【关键词】病毒性肝炎血清标志物(一)甲型肝炎病毒IgM、IgG抗体(抗-HAVIgM、抗-HAIgG)目前主要通过ELISA检测抗-HAVIgM和抗-HAVIgG两种血清标志物对甲型肝炎进行病原学的检测。
在甲型肝炎感染的早期(发病后几天)血清中即可出现抗-HAVIgM，滴度很快升至峰值并持续2～4周，发病后1～2个月滴度和阳性率下降，于3～6个月消失。
因此，抗-HAVIgM阳性，尤其是滴度较高时(>103)，常表明急性HAV感染或复发。
抗-HAVIgG出现较抗-HAVIgM稍晚，几乎可终身存在，抗-HAVIgG抗体阳性，则表示过去曾受过HAV感染，但体内已无HAV，是一种保护性抗体，可用于甲型肝炎(简称甲肝)的流行病学调查。
(二)甲型肝炎抗原(HAV-Ag)在粪便或肝组织中检测到HAV-Ag可作为急性甲肝的证据，但检测不到HAV-Ag也不能排除感染甲肝的可能性，因为HAV-Ag的排出期很短，而且通常只在潜伏晚期。
发病前1～2周内，感染者可通过常规粪便检测HAV-Ag而被发现。
此时尚未出现ALT／AST 升高，也未出现抗甲肝抗体。
早期发现对于预防治疗很重要(在接触者中给予免疫球蛋白预防)。
粪便中HAV-Ag排泄的持续时间与传染持续时间之间的相关性很好。
如果粪便HAV-Ag阴性，那么特殊的卫生措施，例如粪便消毒或隔离患者，就势在必行。
丙肝诊断需要做哪些项目的检查(专家推荐)-河南肝病专科医院
丙肝诊断需要做哪些项目的检查关于丙肝症状的诊断一直都是一个令所有人头疼的问题，因为常规的体检无法判断人体是否感染丙肝，需要做很详细的检查才能确诊，这就导致了很多患者没有及时治疗，对身体伤害极大。
现在我们就来了解一下丙肝的诊断依据都有哪些。
丙肝诊断检查项目有哪些1.河南肝病专科医院的郑州中大中医肝病医院专家指出HCV-RNA:因丙型肝炎患者血液中HCV含量很低，直接做核酸杂交，很难查到HCV-RNA,须先经核酸扩增后测定。
采用半定量聚合酶链反应(HCVcDNA/PCR,简称cPCR)测定肝和血清中HCV草药RNA,具有特异性强、灵敏度高、快速的优点。
HCV RNA阳性是HCV感染的直接证据、是HCV复制指标、有传染性。
因HCV RNA较抗-HCV出现早，故可用于早期诊断及献血员的筛查。
HCV RNA阴性，说明HCV被清除，因此，也可做为判断预后和疗效的指标。
2.抗-HCV:大部分HCV感染者，体内均出现抗HCV.因此，检测抗-HCV对丙型肝炎诊断很有价值。
抗-HCV阳性是HCV感染的标志。
但目前检测结果不能充分反映急性、慢性抑或恢复期感染。
抗体效价也不能反映HCV感染的强度，至少在动物试验中未能证实。
抗-HCV阳性可能表示近期感染后的免疫状态，但大多数表示现症HCV感染，并在一定程度上反映个体的传染性。
人感染HCV后勤工作至抗 -HCV阳转，这段时间个体长短差异很大，目前所用方法，测出抗体较晚，在该期唯一感染的标志患者始终不出现抗-RNA,此外尚有20%丙型肝炎患者始终不出现抗-HCV,故实际感染率比检出率高，抗-HCV阴性不能除外HCV感染。
丙肝诊断依据丙型肝炎病毒指标包括抗HCV及HCVRNA1.HCV RNA:即丙型肝炎病毒的核糖核酸，是HCV的遗传物质，是表示体内感染HCV的直接指标。
目前用PCR方法可以直接检测血中的HCV RNA,可用于HCV 感染的早期诊断，因其较丙型肝炎抗体出现早，故是丙型肝炎病原学诊断和判断传染性的一项有用的指标。
丙肝患者HCV-Ab、HCV-RNA、HCV-Ag试剂盒联合检测体会
（ 解放军一五 三医院 检验科 ， 郑州 ４ ５ ０ ０ ４ ２ ）
［ 摘要 ］ 目的
探讨 Ｈ Ｃ Ｖ— Ａ ｂ 、 Ｈ Ｃ Ｖ— Ｒ Ｎ Ａ、 Ｈ Ｃ Ｖ—Ａ ｇ 联合检测 的意义。方法
用丙型肝 炎抗体 （ Ｈ Ｃ Ｖ —Ａ ｂ ） 、 丙
型肝炎 病毒核酸（ ＨＣ Ｖ—Ｒ Ｎ Ａ） 扩增 （ Ｒ Ｎ Ａ） 荧光 定量及丙型肝核心抗原 （ Ｈ Ｃ Ｖ—Ａ ｇ ）三 种 试 剂 盒 分 别 检 测 血 清 中 的 Ｈ Ｃ Ｖ —Ａ ｂ 、 ＨＣ Ｖ—Ｒ Ｎ Ａ、 ＨＣ Ｖ—Ａ ｇ 三 种 标 志物 。结 果 根据 丙 型 肝 炎 病 毒 在 体 内存 在 的 时 间 ， 通过 ９ Ｏ例 疑 似 丙 型
长， 治 疗成 本高 ， 尤 其 目前 还 没有 预 防疫苗 。早 期检 测受到广大患者和医疗工作者的重视 ， ＨＣ Ｖ—Ａ ｂ 、
合荧 光探 针 的扩增 技术 。由深圳凯 杰 生物 工程有 限
公 司生产 ， 配套 Ｈ Ｃ Ｖ核 酸扩增 （ Ｐ Ｃ Ｒ） 荧 光定 量检 测
试剂 盒 ， Ｈ Ｃ Ｖ—Ｒ Ｎ Ａ载 量正 常值 为 ＜ ５ ０ ０ ｃ ｏ ｐ ／ ｍ ｌ 。
—
Ａｂ 、 ＨＣＶ — ＲＮＡ 、 ＨＣＶ —Ａｇ。
１ ． ２ ． １ Ｈ Ｃ Ｖ— Ａ ｂ检测 采用 双抗 体 夹心 时 间 分辨
免 疫荧 光 分 析 法 （ Ｔ Ｒ Ｉ Ｆ ＭＡ） ， 检 测 试 剂 盒 由江 苏 新 波 生物 制剂 有 限 公 司 生 产 。 配套 新 波 生 物 的 Ａ ｎ ｙ ．
—
９ ０例 丙肝 患者 Ｈ Ｃ Ｖ —Ａ ｂ阳性率 为 ９ ７ ％， Ｈ Ｃ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ的 阳性 率 为 ７ ４ ％， ＨＣ Ｖ—Ａ ｇ阳性 率 为 ６ １ ％，
临床检验中丙型肝炎病毒的常用检测项目及意义
临床检验中丙型肝炎病毒的常用检测项目及意义丙型肝炎病毒（HCV）为嗜肝性慢性病毒。
HCV感染后，患者的起病和临床症状极不典型，以亚临床感染为多见，容易造成漏诊。
丙肝自然转阴率低，治疗效果差，病程迁延，易早期出现肝硬化、肝癌，死亡率较高，因此HCV的检测对丙型肝炎病毒感染的早期诊断和指导临床治疗有重大的意义。
目前用于HCV感染诊断的常用主要指标有抗-HCV、HCV-cAg、HCV-RNA、丙肝基因型。
现多采用的第三代检测抗-HCVEIA试剂增加了HCV基因组Ns5区表达的蛋白作为抗原，进一步提高了试剂的敏感性，但还存在“窗口期”长、假阳性等问题。
HCV核心抗原出现早，检测敏感性好，特异性高，操作简便、快速，对处于HCV 感染“窗口期”的个体检测有很大价值。
HCV-RNA检测灵敏度高、特异性强，具有早期诊断的意义，是EILSA技术的有力补充，常常作为HCV感染的主要确诊手段。
尤其在慢性丙型肝炎治療中，HCV-RNA定量检测作为最重要的实验室检测指标。
丙型肝炎的基因分型在临床上主要是决定干扰素和利巴韦林的疗程和用量。
标签：丙型肝炎病毒；检测；临床检验；临床意义丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是丙型肝炎的病原体，曾被称为肠道外传播的非甲非乙型肝炎病毒。
1991年被分类为黄病毒科丙型肝炎病毒属。
据美国疾病预防与控制中心（CDC）调查发现，丙型肝炎的发病率约7.1/10万，目前全世界的丙型肝炎病毒（HCV）感染者超过1亿人，其中我国约有4 000万，我国HCV的感染率在0.9％～5.1％。
丙型肝炎自然转阴率低，治疗效果差，病程迁延，且与肝硬化、肝癌等的发生及发展显著相关。
掌握和了解目前临床常用的检测项目的方法和意义，对丙型肝炎的诊断和治疗具有指导性的重大作用。
1 丙肝抗体（抗-HCV）检测丙肝抗体（抗-HCV）检测，是目前临床上最常用的检测技术。
此种检测采用间接酶联免疫法，将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗体）与之结合，洗涤后，加入酶标抗抗体和底物进行测定，是间接检测病毒感染的一种方法。
丙肝抗体检测的原理是什么
丙肝抗体检测的原理是什么丙肝抗体检测的原理基于免疫学理论，主要通过检测体内是否存在对丙肝病毒(HCV)感染的特异性抗体来诊断丙肝感染。
以下将详细介绍丙肝抗体检测的原理。
丙肝病毒是一种RNA病毒，其感染会引起丙肝，成为重要的肝脏疾病。
丙肝抗体检测的目的是判断个体是否曾经感染过丙肝病毒，以及是否存在抗体保护效应。
丙肝抗体检测可分为两个步骤：筛查试验和确认试验。
筛查试验主要是用于初步筛查丙肝感染，确认试验则用于确认感染的结果。
筛查试验常用的方法是酶免疫法(ELISA)。
其原理是将特异性的抗原与被检测血清样本中的抗体反应，从而形成抗原-抗体复合物，然后用酶标记的二抗与此复合物结合，最终通过加底物使酶反应转化为可见的颜色。
在丙肝抗体筛查试验中，常用的抗原是丙肝病毒核心蛋白C和非结构蛋白3(NC3)。
它们与感染者的抗体相结合后形成复合物，通过酶标记的二抗结合检测出来。
在确认试验中，常用的方法是免疫荧光法(IF)或免疫印迹法(Western blot)。
这些方法主要用于确认初筛阳性结果和区分假阳性和假阴性结果。
在IF法中，病毒抗原标记有荧光染料，通过显微镜观察样本中荧光信号的存在与否来判断感染情况。
在Western blot中，将丙肝病毒蛋白经过电泳分离，然后用抗体与样本中的蛋白进行反应，最终通过荧光信号或放射性标记物来分析结果。
除了ELISA、IF和Western blot等传统方法，还有一些新兴的丙肝抗体检测技术。
例如利用PCR技术检测病毒核酸，通过扩增丙肝病毒RNA进行检测。
此外，还有蛋白芯片技术，可同时检测多种病毒抗体，提高检测的灵敏性和特异性。
需要注意的是，丙肝抗体检测结果不能作为诊断丙肝的唯一依据。
如初筛阳性结果需进一步进行确认试验，如Western blot等，来排除假阳性或假阴性结果。
此外，其他方法如核酸检测等也可用于丙肝的确诊。
总结来说，丙肝抗体检测的原理是通过检测体内是否存在特异性的抗体来诊断丙肝感染。
丙型肝炎中和抗体研究进展
图１中和抗体在ＨＣＶ生命周期中的潜在作用靶点性抗体却延迟至感染后几周才能出现。
ＨＣＶ感染中抗体介导的中和作用发生在体内，但是抗体对感染的控制作用却难以研究。
已知的是ＨＣＶ主要抗体缺陷的患者会发生疾病的迅速恶化，并且运用包含中和抗体ＨＣｖＲＮＡ阳性血浆的免疫球蛋白治疗ＨＣＶ感染患者的研究已经有所报道［７］。
但是，在大多数发病患者中，尽管针对多种表位ＨＣＶ包膜糖蛋白的体液免疫诱导的发生，ＨＣｖ感染还是最终难以避免［６’１４］。
直到最近，利用ＨＣＶ模型检测早期和慢性ＨＣＶ感染中和抗体反应的功能性研究揭示了大多数患者在早期感染中中和抗体缺乏的事实［６’１３Ｊ。
利用ＨＣｖｐｐ模型，最近的２项研究结果证实中和抗体在早期被诱导，后期病毒被清除或感染得到控制。
病毒清除与中和抗体早期的快速诱导紧密相关，同时中和抗体表现出针对早期感染的广谱、交叉的中和活性［１５１。
相比较，慢性ＨＣＶ感染的特点是早期中和抗体的缺失或低梯度。
早期感染中中和病毒能力的障碍直接导致了病毒对中和反应的逃逸和ＨＣＶ感染的持续存在。
这些结果表明，早期强大广谱的中和抗体反应能够控制ＨＣＶ感染并且协助・２１７・细胞免疫对病毒的清除。
这些结论在近期人免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）抗病毒反应中中和抗体控制ＨＩＶ感染的发现得到进一步证实［１６｜。
然而，部分没有清除ＨＣＶ的患者在感染慢性期体内出现了高滴度甚至交叉性抗体，令人费解的是，这些抗体却不能清除病毒［１７Ｉ。
这些在抗体介导的中和作用下发生的病毒逃逸可能与以下原因有关：（１）ＨＣＶ基因组准种的存在，准种（ｑｕａｓｉｓｐｅ—ｃｉｅｓ）是指病毒在同一个体中以一群紧密相关但又互不相同的序列形式存在，准种的存在可能源于依赖ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶的校对功能不完善及宿主免疫压力的存在，是产生宿主免疫逃逸及容易导致慢性感染的机制之一；（２）ＨＣｖ糖蛋白与高密度脂蛋白和ＳＲ．Ｂ１的相互作用阻断了中和抗体的保护作用；（３）如同其他病毒（如ＨＩＶ）一样，中和抗体存在下的病毒逃逸可能通过不同机制的结合发生，如点突变、插入突变或者病毒包膜糖基化类型的改变等，从而阻止中和抗体的结合。
丙型肝炎病毒抗体(胶体金法)标准操作规程
丙型肝炎病毒抗体(胶体金法)标准操作规程1.检验目的用于体外定性检测人血清或血浆样本中的丙型肝炎病毒(HCV)抗体。
2.检验程序的原理和方法采用胶体金免疫层析技术，应用间接法原理定性检测人血清(浆)HCV抗体。
在玻璃纤维素膜上预包被金标鼠抗人IgG抗体(anti-IgGAb),在硝酸纤维素膜上检测线和对照线处分别包被重组丙肝混合抗原(Core、NS3、NS4、NS5,源自大肠杆菌)和人IgG 抗体(丙种球蛋白)。
检测阳性样本时，血清样本中HCV-Ab与胶体金标记鼠抗人IgG 抗体结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过检测线时与预包被的抗原结合形成“Au-anti-IgGAb-HCVAb-HCVAg”夹心物而凝聚显色，游离金标鼠抗人IgG抗体则在对照线处与人IgG抗体结合而富集显色。
阴性标本则仅在对照线处显色，15分钟内观察结果即可。
3.性能特征3.1用国家参考品测定，产品性能应符合以下要求。
3.1.1阴性参考品符合率：对20份阴性参考品进行检测，要求在15分钟内全部显示阴性结果。
3.1.2阳性参考品符合率：对20份阳性参考品进行检测，要求在15分钟内全部显示阳性结果。
3.1.3最低检出量：灵敏度1号1:8进行检测，要求在15分钟内显示阳性结果。
灵敏度2号1:64进行检测，要求在15分钟内显示阳性结果。
3.1.4精密性：用精密性参考品平行检测10次，均在15分钟内显示出清晰可辨的检测线，且显色深度无显著差别。
3.1.5稳定性：试剂盒置37℃20天，阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出量和精密性均应符合要求。
3.2乙肝、人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲肝、庚肝、戊肝、类风湿因子(RF)、红斑狼疮等各种类型的标本不会对测试产生干扰。
3.3胆红素(342.0μmol/L)、胆固醇(20.7mmol/L)、血红蛋白(5.0g/L)、甘油三酯(28.2mmol/L)),不影响检测结果。
HCV—cAg与HCV—Ab联合检测的互补作用及HCV阳性者与ALT的关系
HCV—cAg与HCV—Ab联合检测的互补作用及HCV阳性者与ALT的关系目的探讨丙肝病毒核心抗原（HCV-cAg）与丙肝病毒抗体（HCV-Ab）联合检测对诊断丙肝病毒（HCV）感染的互补作用及HCV感染阳性者与丙氨酸氨基转移酶（ALT）的关系。
方法检测手术前检查组2061例患者和ALT>80 U/L 组242例患者的HCV-cAg、HCV-Ab和ALT等指标，然后将检测结果作出统计分析。
结果手术前检查组联合检测有 2.7%的阳性率，显著高于单独HCV-cAg 和单独HCV-Ab的1.6%（P＜0.05）；ALT>80 U/L组联合检测有14.5%的阳性率，显著高于单独HCV-cAg的7.0%（P＜0.01）；手术前检查组ALT均值和ALT>80U/L 例数是2项均阳性高于HCV-Ab阳性、HCV-Ab阳性高于HCV-cAg。
结论HCV-cAg和HCV-Ab 2项联合检测明显优于单项检测，这对HCV感染的诊断能起到很好的互补作用，加上ALT等肝功能指标的检测，有利于HCV感染的正确诊断。
标签：丙肝病毒核心抗原；丙肝病毒抗体；丙氨酸氨基转移酶；联合检测；互补作用丙型肝炎（丙肝）是一种主要经血液传播的传染病，而丙肝病毒（HCV）是其主要的致病因素，HCV感染的实验室检查是丙肝诊断的重要依据。
近些年来的HCV检测技术主要是丙肝病毒抗体（HCV-Ab）和丙肝病毒核酸（HCV-RNA）检测，二者均存在一定的局限性。
该院于2013年3月起正式开展了丙肝病毒核心抗原（HCV-cAg）检测，这与HCV-Ab联合检测能起到一定的互补作用，可望提高HCV感染的阳性检出率。
但2项联合检测到底能起到多少互补作用以及HCV阳性者与丙氨酸氨基转移酶（ALT）的关系如何还值得探讨，现报道如下。
1 对象与方法1.1 研究对象该研究的研究对象为2013年3月1日—5月31日这一时段来我院作疾病诊治的并来源于2个方面的患者，一是手术前（含输血前）作例行检查的患者，共2 061例；二是ALT>80 U/L的肝炎和疑似肝炎患者，共242例。
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第二军医大学学报 2010 年 11 月第 31 卷第 11 期 http： / / www． ajsmmu． cn
Academic Journal of Second Military Medical University，Nov． 2010，Vol． 31，No． 11
近年来建立的装配有功能性的 HCV 包膜蛋白， 核心为小鼠反转录或 HIV 衣壳蛋白及含报告基因的 基因 组 RNA 的 HCV 假 病 毒 （ pseudotype le， HCVpp） 以及由细胞培养产生的 HCV（ HCVcc） 为分 析包膜蛋白 抗 体 的 中 和 活 性 提 供 了 良 好 的 模 型，尤 其是 HCVpp，可用于对各基因型 / 亚型 HCV 中和抗 体的分析［5 － 8］。本研究用 4 个基因型 / 亚型的 5 株 HCVpp 以及属于 2a 亚型的 2 株 HCVcc 分析 HCV 患者血清的中和活性，结果表明，HCV 患者血清中存 在交叉中和抗体，中和活性与 E2 抗体水平正相关， 与 HCV RNA 水平负相关。
［基金项目］ 国家自然科学基金 （ 30901348 ） ，上海市基础研究重点项目 （ 08JC1405000 ） 和 上 海 市 重点 学 科 建设项目 （ B901 ） ． Supported by
National Natural Science Foundation of China （ 30771929 ） ，Shanghai Key Basic Research Project （ 08JC1405000 ） ，and Shanghai Leading Academic
第 11 期． 吉 瑾，等． 丙型肝炎患者血清中丙型肝炎病毒交叉中和抗体的检测
·1185·
丙型肝炎病毒（ HCV） 为黄病毒科成员，是引起 慢性肝病的主要病原体，其慢性感染率达 70% 以上， 目前还没有有效的疫苗可预防 HCV 感染。细胞免 疫应答在控制和清除 HCV 感染过程中的作用已被 大量 研 究 所 证 实 和 被 相 关 领 域 的 学 者 所 公 认，在 HCV 感染早期产生强、多特异性和持久的抗 HCV 细 胞免疫应 答 对 于 急 性 丙 型 肝 炎 的 自 然 恢 复 极 为 重 要［1 － 4］。然而，体液免疫应答对 HCV 清除的影响尚 存在争议，抗 体 是 否 具 有 保 护 作 用 及 其 作 用 程 度 尚 不明确。
［Abstract］ Objective To investigate the presence of neutralization antibodies in the sera of hepatitis C patients． Methods A eukaryotic expression plasmid encoding carboxyl terminal － truncated HCV envelope protein 2 （ E2） was transfected into human 293T cells． ELISA method was established to examine the anti － E2 antibodies in the sera of 32 hepatitis C patients． The full － length envelope protein expression plasmid was transfected into 293T cells and the reactivity of transfectant with anti － E2 IgG positive sera was analyzed by immunofluorescence． Five strains of HCV pseudotype particle （ HCVpp） ，including H77 （ 1a genotype） ，Con － 1 （ 1b genotype） ，J4 （ 1b genotype） ，J6 （ 2a genotype） ，and UNK3a （ 3a genotype） ，and two strains of cell cultured HCV （ HCVcc） were used to assay the neutralization activity of 12 anti － E2 positive serum samples． Results ELISA results showed that 26 of 32 serum samples were anti － E2 IgG positive，with the positive rate being 81． 3% ． The 12 serum samples positive for HCV RNA were all anti － E2 IgG，and the virus load was negatively correlated with the anti － E2 antibody level． The anti － E2 positive sera could neutralize the infections of five strains of HCVpp and two strains of HCVcc to various extents，and the neutralization activity was consistent with the anti － E2 antibody level． Conclusion It is suggested that HCV infection can induce protective humoral immune response，and cross － neutralization antibodies against HCV are present in sera of hepatitis C patients，which indicates a feasibility for developing vaccines that can induce broadly － reactive neutralizing antibodies．
·论 著·
丙型肝炎患者血清中丙型肝炎病毒交叉中和抗体的检测
吉 瑾1，2 ，罗 源2 ，陆 伟3 ，朱勇喆2 ，戚中田2 ，王 敦1* ，赵 平2*
1． 西北农林科技大学植物资源与利用教育部重点实验室，杨凌 712100 2． 第二军医大学基础部微生物学教研室，上海市医学生物防护重点实验室，上海 200433 3． 第二军医大学基础部流行病学教研室，上海 200433
［摘要］ 目的 分析 HCV 感染者血清中是否存在交叉反应性中和抗体。方法 以分泌表达 HCV 包膜 E2 蛋白真核表
达质粒转染的 293T 细胞培养上清液中的 HCV E2 蛋白作为检测抗原，建立检测 HCV E2 抗体的 ELISA 方法，检测 32 份 HCV
抗体阳性的慢性丙肝患者血清，然后用免疫荧光分析血清与 HCV 全长包膜蛋白表达质粒转染的 293T 细胞的结合反应，再用 5
［Key words］ hepatitis C virus； hepatitis C； neutralization antibodies ［Acad J Sec Mil Med Univ，2010，31（ 11） ： 1184 － 1188］
［收稿日期］ 2010 － 04 － 12
［接受日期］ 2010 － 09 － 27
Detection of hepatitis C virus cross － neutralization antibodies in sera of hepatitis C patients
JI Jin1，2 ，LUO Yuan2 ，LU Wei3 ，ZHU Yong － zhe2 ，QI Zhong － tian2 ，WANG Dun1* ，ZHAO Ping2* 1． Key Laboratory of Plant Protection Resources ＆ Pest Management of Ministry Education，Northwest A＆F University，Yangling 712100，Shaanxi，China 2． Department of Microbiology，Shanghai Key Laboratory of Medical Biodefense，College of Basic Medical Sciences，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China 3． Department of Epidemiology，College of Basic Medical Sciences，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China
Discipline Project（ B901） ．
［作者简介］ 吉 瑾，硕士生． E － mail： leatesjj@ yahoo． com． cn
* 通讯作者（ Corresponding authors） ． Tel： 029 － 87091511，E － mail： wanghandecn@ yahoo． com． cn； Tel： 021 － 81870990，E － mail： pnzhao@ 163． com
1 材料和方法
1． 1 主要材料 分泌表达 J4 株 HCV 包膜 E2 蛋白 的真核表达质粒 pcDNA3． 1 － 1b661 以及表达 H77 株（ 1a 亚型） 、Con － 1 株（ 1b 亚型） 、J6（ 2a 亚型） 、J4 株（ 1b 亚型） 、以及 UNK3a 株（ 3a 亚型） 全长包膜蛋 白的真核表达质粒由本实验室构建，均以 pcDNA3． 1 为载体。丙肝患者血清由第二军医大学长海医院感 染科 和 实 验 诊 断 科 提 供，均 为 HCV 抗 体 阳 性。 HCVpp 构建用质粒由法国里昂 ENS 大学 Cosset FL 教授 惠 赠。2a 型 嵌 合 HCV 全 长 cDNA 转 录 质 粒 pFL － J6 / JFH － 1 以及人肝癌细胞株 Huh7． 5 由美国 洛克 菲 勒 大 学 Charles Rice 教 授 惠 赠。JFH － 1 株 HCVcc 上清由中国科学院上海巴斯德研究所钟劲教 授惠赠。凝集素 GNA 购自 Sigma 公司。E2 多抗为 BioDesign 产 品。酶 标 二 抗 以 及 FITC 标 记 二 抗 为 Jackson 产品。T7 体外转录试剂盒为 Promega 产品。 ECL 化学发光试剂购自浦飞生物科技有限公司。 1． 2 丙肝患者血清 HCV E2 抗体的 ELISA 检测 用 Lipofectamine 2000 （ Invitrogen ） 将 质 粒 pcDNA3． 1 － 1b661转染 293T 细胞，48 h 后用 E2 多 抗为一抗，用 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 细 胞 裂 解 液 和 细 胞 培养上清中的 HCV E2 蛋白。以 GNA 包被酶标板， 4℃ 过夜（ 1 μg / 孔） ，次日 37℃ 封闭 2 h，洗板 1 次，每 孔加质粒 pcDNA3． 1 － 1b661 转染的 HEK 293T 细胞