免疫组化组织细胞的取材、固定、切片操作方法及要点
免疫组化组织细胞的取材、固定、切片操作方法及要点
免疫组化组织细胞的取材、固定、切⽚操作⽅法及要点从⼤体标本上切除适量的组织材料进⾏研究就是取材。
取材不仅在免疫组化⽽且在常规病理检查中也⼗分重要。
⽤于免疫组化的组织⼀般取材⼤⼩为1．OcmXl．OcmX0．2cra。
取材时应剔除脂肪和钙化，否则会影响切⽚，出现假阳性或假阴性结果。
组织标本包括动物标本、⼿术活检标本、⼫体解剖标本及细胞标本等，有关各种标本的取材⽅法分述如下。
⼀、动物的致死法及取材(⼀)致死法(1)空⽓栓塞法向动物静脉内注⼊⼀定量的空⽓，使动物很快死亡。
⼀般适⽤⼤动物，例如兔、⽝、猫等动物。
(2)⿇醉法可将浸有⼄醚或氯仿(三氯甲烷)的棉球连同动物⼀起放⼈密闭容器内进⾏⿇醉，也可⽤4％戊巴⽐妥作静脉注射，或⽤20％氨基甲酸⼄酯做腹腔注射。
适⽤于⿏等⼩动物。
(3)断头法⽤剪⼑剪去动物的头部，待⾎液流出后⽴即取材。
适⽤于⼩动物。
(4)去头法⽤重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。
(5)股动脉放⾎法动物⿇醉后，切开股动脉放⾎致死。
(⼆)取材注意事项(1)最好在动物⼼脏还在跳动时⽴即取材，并迅速投⼊环保组织固定液内。
脏器的上⽪组织易变质，争取在死后半⼩时内取材完毕，否则免疫组化染⾊时会产⽣背景染⾊。
(2)切取组织使⽤的⼑、剪要求锋利，避免来回挫动组织。
因动物组织质脆，因此夹取组织时切勿⽤⼒过重，以免挤压损伤组织。
⼆、⼫体解剖的取材⼫体解剖的取材应根据实际需要进⾏，⼀般取材部位和数量如下。
(1)⼼和⼤⾎管右⼼室⼀块，左⼼室⼀块，主动脉⼀块，取材部位可在距主动脉瓣5cm处。
(2)肺右下叶⼀块，切成正⽅形；左下叶⼀块，可切成长⽅形。
(3)肝右叶⼀块，切成正⽅形；左叶⼀块，切成长⽅形。
(3)脾⼀块。
(4)胰⼀块。
(6)肾两肾各⼀块，包括⽪质、髓质和肾盂。
右肾⼀块切成正⽅形，左肾⼀块切成长(7)膀胱⼀块。
(8)肾上腺左、右各取⼀块。
(9)消化道⾷管⼀块，胃窦部⼀块，⼩肠⼀块，淋巴结⼀块，直肠⼀块。
(10)⾻脊椎⾻⼀块。
免疫组化实验的详细步骤
免疫组化实验的详细步骤1. 制备组织切片- 将组织固定在适当的固定液中(如甲醛溶液)- 通过脱水、清理和浸蜡等步骤制备石蜡包埋块- 使用切片机将包埋块切成4-6微米厚的切片- 将切片贴附到载玻片上2. 脱蜡和水化- 将载玻片浸入二甲苯或者相似的溶液中,去除石蜡- 使用梯度浓度的乙醇溶液(100%,95%,70%)逐步水化切片3. 抗原修复- 抗原修复是一个关键步骤,可以暴露被固定过程掩盖的抗原表位 - 常用的方法包括加热诱导抗原修复和酶促抗原修复4. 内源性过氧化物酶或者生物素的封闭- 使用3%的过氧化氢溶液处理切片,以封闭内源性过氧化物酶活性 - 对于利用生物素-亲和素系统的实验,需要使用生物素封闭试剂进行封闭5. 加入封闭液- 使用含有蛋白质成分的封闭液(如牛血清白蛋白)处理切片- 这一步可以阻止抗体的非特异性结合6. 加入一抗- 将特异性的一抗(如小鼠抗人蛋白单克隆抗体)稀释至适当浓度- 滴加到切片上,在湿盒中于4℃过夜或37℃温育1-2小时7. 加入二抗- 洗去未结合的一抗- 加入与一抗种属相匹配的二抗(如生物素标记的羊抗小鼠抗体)8. 加入探针- 对于酶促反应型免疫组化,加入酶标记的亲和素(如过氧化物酶-亲和素复合物)- 对于荧光免疫组化,加入荧光标记的亲和素9. 显色- 酶促反应型:加入适当的染色底物(如),产生可见的棕黄色沉淀- 荧光免疫组化:不需要此步骤10. 染色和封片- 用苏木素对细胞核进行复染- 用封片剂和覆盖玻片封闭切片,制成永久装片11. 观察结果- 使用光学显微镜或荧光显微镜观察目的蛋白的分布和表达情况以上是免疫组化实验的一般步骤,具体操作细节可能因实验目的和具体方法而有所调整。
准确无误的实验步骤需要参考相关文献和说明。
免疫组化标准操作流程
免疫组化标准操作流程嘿，咱今儿就来唠唠免疫组化标准操作流程这档子事儿！这免疫组化啊，就好比是一场精细的手术，每一个步骤都得小心翼翼，容不得半点马虎。
先说说取材吧，这就像是挑选食材一样，得选那最精华的部分。
取的组织要新鲜，可不能是那“焉了吧唧”的。
然后把它切成合适的小块，就像切菜一样，得大小均匀，不然可就不好处理啦。
接下来就是固定啦，这就像是给食材上点调料，让它能保持住原本的模样。
固定液可不能随便乱用哦，得用对了才行。
就好像做菜放调料，盐不能当糖放呀！脱水呢，就像是把湿漉漉的东西弄干。
得一步一步来，不能着急，不然组织都变形啦。
就好比晒衣服，得慢慢晒，不能一下子扔到火里烤呀，那还不得烧没了。
透明也很关键呀，就像是给组织打开一扇窗，让后续的步骤能更好地进行。
这一步要是没做好，后面可就麻烦咯。
浸蜡就像是给组织穿上一层保护衣，要让它舒舒服服地裹在里面。
蜡的温度可得掌握好，太热了不行，太冷了也不行，就跟洗澡水一样，得刚刚好。
包埋呢，就是把组织好好地安置在一个小窝里，让它有个安稳的地方待着。
这可不能马马虎虎，得认真对待。
切片就像是切面条，得切得薄薄的、均匀的。
这可是个技术活，没点功夫可不行。
要是切厚了，那后面观察起来可就费劲啦。
然后就是烤片啦，把片子烤得稳稳当当的，别让它到处乱跑。
这就跟烤面包似的，火候得掌握好。
脱蜡到水化，就像是给组织洗个舒服的澡，把那些不需要的东西都洗掉。
抗原修复就像是给组织做个按摩，让它能更好地展示自己。
这一步可重要了，可不能随便应付。
接下来就是封闭啦，把那些不需要的地方都给挡住，只让我们想看的地方露出来。
一抗孵育就像是给组织找个好朋友，让它们好好相处。
抗体的选择可重要啦，得选对才行。
洗去多余的一抗，就像把脏东西洗掉一样，得洗得干干净净。
二抗孵育就像是给组织再找个小伙伴，让它们一起玩耍。
显色就像是变魔术一样，让我们能看到组织的真面目。
这时候可得瞪大眼睛看好啦，别错过了精彩的瞬间。
复染就像是给画面添上一抹色彩，让它更漂亮。
免疫组化相关步骤
免疫组化相关步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测、定位和定量特定蛋白质在组织或细胞中的表达。
以下是免疫组化的一般步骤：1.取材和预处理：首先，选择需要研究的物种的组织样本，可以是固定和包埋的组织切片，也可以是细胞培养物。
对于固定组织，常用的固定剂包括福尔马林、乙醛等。
然后进行脱水、透明化、包埋等预处理步骤。
2.标本切片：将处理好的组织或细胞样本切成较薄的切片，常见的切片厚度为4-6微米。
切片后，可以将其固定在载玻片上。
3.抗原恢复：对于一些已经固定的样本，抗体可能无法充分与蛋白质结合。
因此，进行抗原恢复是必要的。
常见的抗原恢复方法包括加热诱导抗原恢复（如高温加热或压力加热）和酶或蛋白酶诱导的抗原恢复。
这些方法有助于揭示抗原并提高抗体的结合。
4.阻断非特异性结合：在进行免疫组化反应之前，需要阻断非特异性结合位点，以减少假阳性结果。
常用的非特异性结合位点阻断方法包括使用血清蛋白、牛血清白蛋白、胶原蛋白等。
5.一抗反应：将特异性抗体（一抗）加入切片或细胞上，并进行孵育。
一抗可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
一般情况下，常用的抗体稀释倍数为1:100到1:1000。
此步骤的时间和温度也需要根据具体的抗体选择进行调整。
6.洗涤：完成一抗反应后，需要进行多次洗涤来去除未结合的抗体。
洗涤可以使用生理盐水、PBS等缓冲液，重复2-3次洗涤，每次洗涤时间持续5-10分钟。
7.二抗反应：8.洗涤：与一抗反应类似，完成二抗反应后需要进行多次洗涤来去除未结合的二抗。
洗涤可以使用生理盐水、PBS等缓冲液，重复2-3次洗涤，每次洗涤时间持续5-10分钟。
9.染色和显微镜观察：根据实验需要，可以选择合适的染色方法，如荧光染色或酶联染色。
染色后，可以使用荧光显微镜或光学显微镜进行观察和拍照记录。
10.分析和结果解读：根据染色的结果和显微镜观察，进行定性和定量分析。
可以使用图像处理软件来分析染色的强度和分布情况。
根据实验设计和相关的对照组，对实验结果进行解读。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤以下是免疫组化法的标准实验操作步骤：1.样本准备：a.获取待检样本，例如组织切片或细胞悬液。
b.将样本固定，常用的固定剂包括福尔马林、乙醇和乙酸等。
c.进行脱水和石蜡包埋，以便于后续切片。
2.制备切片：a.用切片机将固定的样本切成薄片，通常为4-6微米。
b.将切片平均分配在载玻片上。
3.制备蜡块：a.将切片放入烘箱中进行去蜡，以去除切片上的石蜡。
b.用乙醇对切片进行脱水然后重新水化。
c.将切片放入热稳定耐热塑料材料中，通常为硝酸纤维素薄膜等。
4.抗原恢复：a.使用高温高压（如压力锅或蒸汽炉）进行抗原恢复，以改善抗体与抗原的结合效率。
b.根据实验需要选择适当的抗原恢复缓冲液，如磷酸盐缓冲液（PBS）、EDTA缓冲液或三氯醋酸缓冲液等。
c.将切片放入抗原恢复缓冲液中进行恢复处理。
5.抗体处理：a. 选择适当的一抗（primary antibody），根据目标蛋白质的性质选择单克隆或多克隆抗体。
b.将一抗稀释至适当浓度，根据抗原的强度调整抗体浓度。
c.将一抗加入样本上共孵育，使抗体与目标蛋白质发生特异性结合。
d.对于一些抗体，可以使用辅助试剂如牛血清蛋白、牛血清、胶原蛋白等增强结合效果。
6.清洗：a.用PBS或其他合适的缓冲液冲洗切片，以去除未结合的一抗。
b.重复冲洗步骤多次，以充分去除未结合的抗体。
7.检测标记：a.选择适当的检测标记，如酶（如辣根过氧化物酶，HRP）、荧光染料或金标记等。
b.将标记物加入到一抗与抗原结合的位置上，以形成可视的标记。
8.染色：a.若使用酶标记物，则使用特定底物进行染色，产生颜色反应。
b.若使用荧光标记物，则观察荧光信号。
9.显微镜观察：a.使用适当的显微镜观察切片，记录和分析结果。
b.对于荧光标记，可以使用特定的荧光染色剂如DAPI进行细胞核染色。
10.结果分析：a.根据实验设计和目的，对结果进行定性或定量分析。
b.可以使用图像分析软件进行影像处理和数据分析。
免疫组化操作方法
免疫组化操作方法免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测和定位细胞或组织中特定蛋白质的表达。
它结合了免疫学和生化学的原则和技术，可以提供对细胞或组织中不同蛋白质的分子特征、活动状态和相互作用的信息。
本文将详细介绍免疫组化的操作方法，包括材料和试剂的准备、标本的制备和固定、抗原检测和可视化等步骤。
材料和试剂的准备1.活体或固定的细胞或组织标本。
2.组织培养基和适当的培养器具。
3.PBS(磷酸缓冲盐溶液)或其他细胞/组织冲洗缓冲溶液。
4.组织切片刀、显微刀片、显微镊子、镊子等操作工具。
5.细胞/组织固定剂，如乙醛、甲醛、乙酸乙酯等。
6.可溶性和固相抗原检测试剂，如抗体、蛋白质等。
7.染色试剂，如荧光染料、酶底物等。
8.实验室耗材和设备。
标本的制备和固定1.如果使用活体标本，如细胞培养物，应先将其转移到无菌培养器皿中，并在适当的培养条件下培养至合适的生长期。
2.对于组织标本，可以通过切片或切块的方式进行制备。
切片时要求切片薄而均匀，一般为5-10μm。
切块时要求尽量保持组织完整性。
3.制备好的细胞或组织标本需要尽快进行固定，以保持其形态和蛋白质的天然状态。
常用的细胞/组织固定剂有乙醛、甲醛和乙酸乙酯。
不同的固定剂选用方法有一定差异，具体应根据实验要求和文献建议进行选择。
抗原检测和可视化1.固定后的标本需要进行脱水和透明化处理，以便于抗原检测的进行。
可以使用乙醇或队列进行脱水处理，然后用透明化溶剂进行透明化处理。
2.抗原检测需要使用抗体识别目标蛋白质。
对于免疫组织化学，常用的抗体类型包括一抗和二抗。
一抗为直接与目标抗原反应的抗体，二抗为与一抗结合并由可视化标记物进行信号产生的抗体。
一抗和二抗的选择应根据目标抗原和实验要求进行合理选择。
3.免疫染色前，可进行一些前处理步骤以增强染色效果，如抗体预处理、抗原修复、背景消除等。
4.免疫染色操作中，需要逐层进行抗体处理、洗涤和可视化标记物处理。
一般步骤包括：一抗与标本结合、一次洗涤、二抗与一抗结合、二次洗涤、可视化标记物与二抗结合、最终洗涤。
免疫组化实验步骤完整版
免疫组化实验步骤完整版步骤1：标本采集和固定首先，需要从待检测样本中采集组织或细胞。
可以使用手术切片、活体组织、培养的细胞等作为标本。
然后，将采集的样本固定在载玻片或切片上，以保持其结构和形态的完整性。
步骤2：抗原暴露和体细胞抗原消除接下来，需要处理标本以使抗原裸露出来，并消除非特异性的抗体结合和细胞膜结合的抗原。
这一步骤常常涉及对组织或细胞的预处理，例如用石蜡脱脂、酶解抗体和孵化等。
步骤3：抗体特异性结合选择特异性的抗体用于检测待测蛋白质。
这些抗体可以是直接标记的一抗，或间接标记的二抗。
一抗是专门与目标抗原结合的抗体，而二抗则可以与一抗结合，以提高信号的灵敏度和特异性。
这一步骤中还需要选择适当的阴性对照，即未携带待检测抗原的样本。
步骤4：探针检测根据需要，可以使用不同的探针来检测目标分子。
常用的探针有标记的一抗、荧光探针、放射性标记物等。
标记的一抗可以直接结合抗原，然后使用染色剂进行可视化；荧光探针则通过荧光显微镜进行检测；放射性标记物可以通过放射自显影等方法进行检测。
步骤5：显色和对比计数将荧光、酶标记或放射性标记的物质显色，以便于检测和计数。
在染色的过程中，需要防止非特异性的染色，例如使用阻断剂、胶原等。
步骤6：结果分析根据观察到的染色强度、分布模式等结果，分析待测蛋白质在样本中的表达情况。
这可能需要与阴性对照和阳性对照进行比较，以确定实验结果的可靠性。
步骤7：图像捕获和分析使用显微镜或其他成像设备，将荧光、染色或放射性标记的图像捕获下来。
可以使用图像分析软件来计算和比较样本中的染色强度、面积等参数。
步骤8：数据统计和结果报告根据实验结果进行数据统计和分析，并将结果记录在报告中。
报告应包括样本信息、实验方法、结果和结论等内容，并根据需要进行解释和讨论。
总结：免疫组化实验是一种广泛应用于研究、诊断和治疗的方法。
它的步骤包括标本采集和固定、抗原暴露和体细胞抗原消除、抗体特异性结合、探针检测、显色和对比计数、结果分析、图像捕获和分析、数据统计和结果报告。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。
2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。
步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。
2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。
3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。
步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。
2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。
步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。
抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。
2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。
孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。
步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。
2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。
步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。
2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。
步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。
常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。
2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。
步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。
2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。
步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。
2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。
这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。
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从大体标本上切除适量的组织材料进行研究就是取材。
取材不仅在免疫组化而且在常规病理检查中也十分重要。
用于免疫组化的组织一般取材大小为1．OcmXl．OcmX0．2cra。
取材时应剔除脂肪和钙化，否则会影响切片，出现假阳性或假阴性结果。
组织标本包括动物标本、手术活检标本、尸体解剖标本及细胞标本等，有关各种标本的取材方法分述如下。
一、动物的致死法及取材(一)致死法(1)空气栓塞法向动物静脉内注入一定量的空气，使动物很快死亡。
一般适用大动物，例如兔、犬、猫等动物。
(2)麻醉法可将浸有乙醚或氯仿(三氯甲烷)的棉球连同动物一起放人密闭容器内进行麻醉，也可用4％戊巴比妥作静脉注射，或用20％氨基甲酸乙酯做腹腔注射。
适用于鼠等小动物。
(3)断头法用剪刀剪去动物的头部，待血液流出后立即取材。
适用于小动物。
(4)去头法用重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。
(5)股动脉放血法动物麻醉后，切开股动脉放血致死。
(二)取材注意事项易变质，争取在死后半小时内取材完毕，否则免疫组化染色时会产生背景染色。
(2)切取组织使用的刀、剪要求锋利，避免来回挫动组织。
因动物组织质脆，因此夹取组织时切勿用力过重，以免挤压损伤组织。
二、尸体解剖的取材尸体解剖的取材应根据实际需要进行，一般取材部位和数量如下。
(1)心和大血管右心室一块，左心室一块，主动脉一块，取材部位可在距主动脉瓣5cm处。
(2)肺右下叶一块，切成正方形；左下叶一块，可切成长方形。
(3)肝右叶一块，切成正方形；左叶一块，切成长方形。
(3)脾一块。
(4)胰一块。
(6)肾两肾各一块，包括皮质、髓质和肾盂。
右肾一块切成正方形，左肾一块切成长(7)膀胱一块。
(8)肾上腺左、右各取一块。
(9)消化道食管一块，胃窦部一块，小肠一块，淋巴结一块，直肠一块。
(10)骨脊椎骨一块。
(11)胸腺一块。
(12)子宫宫颈和宫体数块。
(13)睾丸或卵巢各一块。
(14)脑左侧运动区一块，左侧豆状核一块，小脑一块。
(15)脑下垂体一块，前叶或包括前后叶。
如有较严重或复杂病变时应适当增加取材数量，以便彻底检查而作出正确诊断。
三、活检标本的取材(一)常规活检标本的取材应注意病变的部位、形状、大小、颜色以及与周围组织的界限，有无完整的包膜。
取材时应取病变部位、病变的切缘、病变与正常组织交界处以及远离病灶的正常组织。
取材用的刀剪应锋利，避免挤压组织；组织的切面应平整，组织切忌过大、过厚，否则不仅浪费试剂，而且会造成固定、脱水不良而影响镜下观察。
(二)肾穿刺标本的取材进行穿刺取得组织后，立即用生理盐水或PBS冲洗数次去除血迹，并迅速判断所穿组织是否为肾组织(肾组织应为暗红色)。
当确定为肾组织后，立即将组织置于木板上，迅速测量其长度；用解剖显微镜或放大镜进行观察，以区别皮质和髓质，并观察标本是否有肾小球。
在解剖显微镜下，肾皮质较淡，皮质区可见一些分布不规则、朦胧的红色小点，此即为肾小球。
使用解剖显微镜可帮助区别组织，作出准确的判断，使肾活检可靠。
穿刺所取得的标本用手术刀片切开，并迅速固定，一半放人装有光镜固定液的青霉素小瓶内，另一半放人装有电镜固定液的小瓶内，均置于冰瓶内保存。
小标本常见为宫颈、宫内膜、鼻咽、口腔、喉以及各种内窥镜所取得的组织。
它们体积较小，面有出血坏死，活检时难于采取到深部组织。
因此，活检钳的刀口必须锋利，活检时必须采取主要病灶区，尽量避开坏死区。
免疫组化组织细胞的固定凡需进行病理研究的标本均需进行固定。
将组织置于某些化学试剂中，使细胞内的物质免疫组织化学实验技术及应用尽量接近于其生活状态时的形态结构和位置称为固定。
而用于免疫组化研究标本的固定不仅是使细胞内的蛋白质凝固，终止或减少外源性和内源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，更重要的是保存组织或细胞内的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。
不同的抗原，其抗原稳定性不同，依抗原耐受固定液的程度可分为：①不稳定性抗原，如T淋巴细胞表面抗原属此类抗原，一般以冰冻切片进行免疫组化染色；②半稳定性抗原，如B淋巴细胞的胞浆免疫球蛋白等；③较稳定抗原，例如HBsAg、HBcAg、AFP、CEA、S—100、Keratin和部分多肽类激素等，其抗原性受固定剂种类、固定时间、温度等影响不大。
固定剂的种类很多，性能不一，因此固定不同的组织应选择合适的固定剂，特别是标记半稳定抗原时，更要选择合适的固定剂和固定条件。
一、固定液的种类较好的固定液应具有强渗透力，能迅速渗入至组织内部；其次不会使组织发生过度收缩变形，并能使组织内易观察的成分得以凝固为不溶性物质；还要使组织达到一定硬度，有较好的折光率。
固定液分为简单固定液和混合固定液。
因目前大多数固定液都是有毒有机溶剂组成，欧美国家已不再使用，基本由环保组织固定液替代。
西奈山环保组织固定液由植物多糖、乙醇、醋组成，固定效果明显优于常规甲醛。
二、固定的方法1．浸泡法这是最常用的固定法，将取好的组织直接浸泡在固定液中，固定的时间一般在2～24h它适用于动物标本、尸检标本及临床活检标本等。
2．蒸气法比较小而薄的标本可用锇酸或甲醛蒸气固定。
主要用于血液、细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。
具体方法：在一有盖培养皿内滴人1％一2％锇酸水溶液3滴，将涂片放人其中，固定30s至lmin左右，立即水洗后进行染色。
3.注射、灌注固定法主要适用于动物实验标本的固定。
将固定液注入血管，以达到充分的固定。
经血管分支到达整个组织或全身(1)局部灌注固定固定肺组织可将固定液从气管或支气管注入，注入速度不要太快，用力均匀，注入量适当，以免胀破肺泡。
固定眼球组织可从眼后房注人固定液。
固定肝、肾组织则可从肝、肾动脉注入固定液，同时切断其静脉使得血液排出。
脑组织的固定，必须先麻醉动物，分离颈动脉，注射器的针尖向着头部的方向注入固定液。
(2)全身灌注固定较大的动物往往采取输液方法，将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入，将另一侧相应的静脉切开放血。
固定液的输入量因动物而异，兔、猫约500～1000ml，猴、狗约1000—2000ml。
4．微波固定法近几年来微波固定法一直可见报道。
经微波固定的组织具有收缩较小、核膜清晰、染色质均匀、分辨清晰等特点，但必须严格控制微波固定的时间和温度。
免疫组化组织细胞的脱水(一)概述组织经固定和水洗后，会有大量的水分留在组织中，而水又不能与苯融合，因此必须在透明前脱去组织中的水分。
用某些溶剂将组织中的水分置换出来的过程称为脱水。
对于不同的组织应分开脱水，特别是一些易脆的组织(如肝、脾等)应严格掌握脱水时间，防止在无水酒精中停留时间过长。
对于动物组织，应比人体标本相应缩短脱水时间。
脱水应按照从低浓度到高浓度的过程，否则标本直接进入高浓度溶液中极易引起组织的强烈收缩或使组织发生变形，从而影响切片，还会造成免疫组化实验过程中的脱片。
(1)乙醇最常用的脱水剂，脱水能力强，并能使组织硬化，与二甲苯能混合。
其缺点是在高浓度乙醇，特别是无水乙醇中停留时间长会引起组织收缩、变脆而影响后续的切片。
尤其是应用全自动脱水机，因是加压抽真空并加温脱水，在高浓度乙醇中停留时间更不能太长，应经试验摸索出适合自己单位脱水需要的时间，不能盲目从书本上套用脱水时间。
脱水时，应从低浓度向高浓度梯度进行。
一般是人体组织从?5％乙醇开始，对于小动物、胚胎及柔软的组织可从30％乙醇开始脱水。
只有脱水充分，才能在透明剂中透明。
若是人工脱水，必须在加盖的容器内进行，尤其是高浓度乙醇很易吸收空气中的水分，阴雨天更应注意。
在透明前最好将组织取出，用滤纸吸干后再透明。
(2)丙酮脱水作用比乙醇强，但对组织的收缩也大，毒性强，价格高，因此一般不用于常规组织的脱水，主要用于快速脱水及固定兼脱水。
此时应注意个人防护，最好在带有抽风功能的装置中进行，脱水时间1～3h左右。
丙酮还可作为染色后的脱水剂，用于甲基绿—派洛宁显示DNA及RNA。
(3)正丁醇为五色液体，微溶于水，在100ml水中只能溶解8．3g，故脱水能力较弱，但能与水、乙醇及石蜡混合，因此经正丁醇脱水的组织可直接浸蜡。
它的优点是很少引起组织的收缩及变脆。
一般用法为：组织经固定及冲洗后，依次人50％、70％、80％乙醇中脱水，然后人正丁醇，12～24h后浸蜡。
使用时也应注意防护。
(4)叔丁醇异丁醇的一种，可与水、乙醇、二甲苯混合，可以单用或与乙醇混合使用，是一种使用较广的脱水剂，它不会使组织收缩或变硬，不必经过透明而直接浸蜡。
电镜上为常用的中间脱水剂。
(5)环己酮沸点为140~C，冰点为一40~C，密度与水相似，无毒，可与苯、二甲苯、氯仿等有机溶剂混合，也是石蜡溶剂，可代替纯乙醇脱水后直接浸蜡，组织不会变硬，不需经二甲苯透明。
(6)松脂醇组织固定后按常规经各浓度乙醇至95％乙醇中，按下列顺序进行脱水和透明处理：①浸入等份95％乙醇和松脂醇的混合液中，待组织块下沉后转入下步处理；②95％乙醇1份加松脂醇2份的混合液中浸泡1h；③95％乙醇1份加松脂醇3份的混合液中浸泡1h；④松脂醇I、Ⅱ、Ⅲ中各浸泡1h；⑤松脂醇5份加石蜡1份的混合液中浸泡lh，然后浸蜡包埋。
多用于经乙醇或Carnoy液固定的组织。
经松脂醇处理的组织收缩较小，发生硬化也少。
中性缓冲福尔马林影响HE染色用中性缓冲福尔马林后，细胞核颜色的确不够鲜艳，可在染苏木素前用3%冰醋酸媒染10分钟，会有所改善。
免疫组化组织细胞的固定（续）三、固定的注意事项1．固定液的量固定组织时，必须有足够的固定液，一般为组织块体积的10～15倍。
固定用的容器必须足够大，组织材料不要太多，避免组织中的水分渗出而影响固定液的浓度。
2.固定的组织必须新鲜组织取材后应立即固定，否则，组织易收缩变形，并发生自溶现象。
3.组织块的体积组织块的体积宜小而薄，一般用于免疫组化的组织大小宜为1．OcmXl．OcmX0．2cm。
组织太大，内部得不到充分固定，导致组织结构破坏，给切片带来一定的困难，还增加非特异染色，同时浪费试剂。
4．组织固定后的冲洗组织固定后，因固定液渗到组织中，所以必须彻底冲洗，除去固定液，否则会影响下一步的脱水。
特别对于长时间固定的标本应用流水冲洗，尽可能减少色素沉着。
对于混合固定液固定的组织，更要及时冲洗，否则将影响免疫组化切片的质量。
四、影响固定的因素1．温度一般固定液固定效果随温度升高而加强，温度一般在-70～37℃之间，?以室温22℃常用。
某些酶的固定要求在37℃以下进行，而某些病毒的固定则要在低温下进行，如用丙酮在-20一-40℃之间固定30min最佳。
对于临床活检标本，固定时间要求短，实践发现用中性甲醛在40℃左右固定2～3h即可。
2．浓度10％中性甲醛、4％多聚甲醛最合适，乙醇最常用浓度为95延。
在37℃或室温固定，适合于许多蛋白质、抗原，并能保持其与抗体的反应能力。