油茶脂肪酸代谢途径中关键酶基因调控油脂合成的规律研究_曾艳玲

根据脂肪酸成分分析 （ 图 2 ） ，8 月至 10 月“华 硕”棕榈酸含量均处于逐渐递减状态，由 8 月 15 日 15． 16% 降至 10 月 24 日 5． 58% ，油酸含量则处于逐 渐递增状态，由 8 月 15 日 53． 53% 增至 10 月 24 日
图 2 油茶种仁不同发育时期棕榈酸、油酸和亚油酸的变化
FOSS SCINO ST310 油脂萃取系统： 诺斯高斯分 析仪器苏州有限公司； G6890A 气相色谱仪（ FID 检 测器） ： 美 国 安 捷 伦 科 技 公 司； 实 时 荧 光 PCＲ 仪 （ CFX96） 、核酸浓度测定仪： 伯乐生命医学产品（ 上
第 29 卷第 2 期
曾艳玲等 油茶脂肪酸代谢途径中关键酶基因调控油脂合成的规律研究
（ 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 中南林业科技大学林学院1 ，长沙 410004） （ 国家林业局桉树研究开发中心2 ，湛江 524022）
（ 中南林业科技大学食品科学与工程学院3 ，长沙 410004）
Байду номын сангаас
摘 要 以国审油茶“华硕”和普通油茶“望城 1 号”不同发育时期种仁为材料，分析种仁含油率、脂肪酸 成分和脂肪酸代谢关键酶基因表达规律。结果表明，油茶酰基载体蛋白基因（ CoACP） 、硬脂酰脱饱和酶基因 （ CoSAD） 和油酸脱氢酶基因（ CoFAD2） 表达规律与油茶种仁成熟程度有关而与品种关系不大； “华硕”较“望城 1 号”生殖发育期长，成熟期晚，脂肪酸各成分变化幅度大，采收期可比“望城 1 号”延迟 1 个月； 10 月底采收时 虽然“华硕”含油率低于“望城 1 号”，但不饱和脂肪酸含量却高些，若延迟采收“华硕”可保产量质量均优。
根据图 5 结果分析，5 月至 10 月期间，“华硕” CoFAD2 相对表达量呈现先上调后下调的趋势。7 月 至 8 月 CoFAD2 表 达 量 迅 猛 增 加 ，9 月 初 表 达 量 与8
图 5 油茶种仁不同发育时期 CoFAD2 相对表达量的变化
因的表达调控作用主导着茶油不饱和脂肪酸含量的 多少及品质 的 差 异，因 此 本 试 验 拟 通 过 研 究 油 茶 种 仁中 ACP、SAD 和 FAD2 基因的表达规律，结合相应
基金项目： 国家自然科学基金（ 31070603） ，湖南省科技厅一般项 目（ 2011FJ3219） ，湖南省林业厅一般项目（ 2011） ，中 南林业科技大学校重点青年基金（ QJ2011008A）
88． 07% ，亚油酸含量处于逐渐递减状态，由 8 月 15 日 28． 33% 减至 10 月 24 日 4． 01% ，说明油酸积累速 度快于油酸 转 化 亚 油 酸 的 速 度，所 以 在 油 酸 含 量 逐 月递增的情况下，亚油酸含量反而递减； 8 月至 10 月 “望城 1 号”棕榈酸含量也均处于逐渐递减状态，由 8 月 15 日 13． 88% 降至 10 月 24 日 7． 31% ，油酸含量 也处于逐渐递增状态，由 8 月 15 日 59． 14% 增至 10 月 24 日 86． 33% ，亚油酸含量处于逐渐递减状态，由 8 月 15 日 24． 09% 减至 10 月 24 日 4． 03% ，变化规律 与“华硕”基本相同，但是两者对比发现“望城 1 号” 各成分变化幅度均比“华硕’要小。
关键词 油茶 酰基载体蛋白基因 硬脂酰脱饱和酶基因 油酸脱饱和酶基因 规律 中图分类号： Q71 文献标识码： A 文章编号： 1003 － 0174（ 2014） 02 － 0026 － 05
油茶是 我 国 特 色 食 用 油 料 树 种，其 产 物 茶 油 不 仅不饱和脂肪酸质量分数高达 80% ，而且富含十六 烷酰胺和角 鲨 烯 等 具 保 健 功 能 的 生 物 活 性 物 质［1］， 长期食用 可 降 血 脂 血 压，预 防 心 脑 血 管 疾 病［2］。 茶 油之所以品 质 优 良，主 要 是 由 于 在 茶 油 形 成 过 程 中 油脂代谢途径各调控酶起着关键作用。酰基载体蛋 白（ ACP） 是脂肪酸合成中的关键蛋白质之一，位于 脂肪酸合成 酶 系 的 中 央，作 为 脂 酰 基 的 载 体 将 脂 酰 基从一 个 酶 反 应 转 移 到 另 一 个 酶 反 应［3 － 4］，因 此 ACP 基因是调控饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比例的 必要基因； 硬脂酰 － ACP 脱饱和酶（ SAD） 基因调控 硬脂酸脱氢形成油酸，因此，直接决定了不饱和脂肪
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海） 有限公司； 高速冷冻台式离心机： 美国贝克曼库 尔特有限公司； 空气加热器： 英国 TECHNE 公司。 1． 3 试验方法 1． 3． 1 油脂提取
参照国标 GB / T 14772—2008 索氏抽提法。 1． 3． 2 脂肪酸成分测定
脂肪酸成分测定釆用碱式甲酯化法测定［9］。气 相色谱分析 30 m × 0． 25 μm × 0． 25 mm FFAP 毛细管 柱； 色谱柱温度： 60 ℃ →180 ℃ （ 25 ℃ / min，停留 1 min） → 210 ℃ （ 3 ℃ / min，停 留 1 min ） → 212 ℃ （ 0． 3 ℃ / min，停留 1 min） →240 ℃ （ 8 ℃ / min，停留 2 min） ，进样口温度： 240 ℃ ，检测器温度： 240 ℃ ，分 流比为 1 ∶ 50，载气流流速： N2 1． 23 mL / min，压缩空 气 400 mL / min，H2 40 mL / min，进样量为 1 μL。 1． 3． 3 实时荧光定量 PCＲ 检测
酸的总含 量 以 及 饱 和 脂 肪 酸 与 不 饱 和 脂 肪 酸 的 比 例［5 － 6］； 油酸脱氢形成亚油酸和亚麻酸则由油酸脱氢 酶（ FAD） 基因家族调控，其中 FAD2 调控油酸的第 12 和 13 位碳原子之间形成双键，生成亚油酸，因此 FAD2 决定了油酸和亚油酸的比例［7 － 8］。这几个基
油茶种仁 ＲNA 提取： PureLinkTM ＲNA Mini Kit 说 明书； ＲNA 逆转录 cDNA： PrimeScript ＲT Ｒreagent Kit With gDNA Eraser 说明书。
实时荧光定量 PCＲ 引物分别为： qACPF： 5 ’－ ATTCAAGCAAAACCAGGCG － 3’/ qACPＲ： 5’－ CACACGAAATCCGAAAACG － 3 ’，qSADF： 5 ’ － GTTCAAGTAACGCACTCCAT － 3’/ qSADＲ： 5’－ TTGCCAACATTTCTCCACAG － 3’，q FAD2F： 5’－ CCCAGCAACCAAACATGAAC － 3’/ q FAD2Ｒ： 5’－ GAATGAGCGGAGGAGAGAAC － 3’； 反应体系为： 2 × QuantiFast SYBＲ Green PCＲ Master Mix 12． 5 μL，10 μmol / L引物对各 0． 5 μL，模板 cDNA 1 μL，无菌纯水 补足 25 μL； 循环条件为 95 ℃ 预变性 5 min； 95 ℃ 变 性 10 s，55 ℃ 退火 30 s，共 40 循环。
图 1 油茶种仁不同发育时期含油率的变化
2 结果与分析
2． 1 种仁含油率和脂肪酸成分变化规律 根据所测种仁含油率结果分析（ 图 1） ，“华硕”
和“望城 1 号”含油率均处于逐渐上升趋势，8 月中旬 含油率 仅 有 2% ～ 4% ，到 10 月 下 旬 含 油 率 上 升 至 50% ～ 60% 。比较“华硕”和“望城 1 号”两者差异， 在各个果实发育时期，“望城 1 号”种仁含油率均高 于“华硕”。采用软件 SPSS 17． 0 进行配对样本 T 检 验分析两者差异，结果显示为差异极显著。
根据图 3 结果分析，5 月至 10 月期间，“华硕” CoACP 相对表达量整体趋势为先上调后下调。7 月 至 8 月 CoACP 表达量迅猛增加，出现第一个表达高 峰期，9 月初有稍微回落，9 月中旬重新上调，至 9 月
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中国粮油学报
2014 年第 2 期
下旬达到最大值，10 月开始下调。这一结果与 8 月 中旬棕榈酸含量是 8 月至 9 月期间最高值 15． 16% 基本吻合（ 图 2） 。脂肪酸成分分析结果显示棕榈酸 含量一直稳步下降，荧光定量结果显示“望城 1 号” CoACP 相对表达量自 8 月后一直下调，这与棕榈酸 含量下降规律一致，但是“华硕”荧光定量结果却显 示 9 月初 CoACP 相对表达量有些许下调后 9 月中下 旬才重新上 调，这 可 能 是 因 为 脂 肪 酸 合 成 酶 是 一 个 多酶复合体，在油茶种仁不同发育时期，发挥主效作 用的单酶不同所致。
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中国粮油学报
Journal of the Chinese Cereals and Oils Association
Vol． 29，No． 2 Feb. 2014
油茶脂肪酸代谢途径中关键酶基因 调控油脂合成的规律研究
曾艳玲1 谭晓风1 张党权1 陈鸿鹏2 曾晓峰1 朱 勇3 许淑娴1 陈 力1
国审品种 “华硕”和普通油茶“望城 1 号”，取材时间 为 5 月 5 日、6 月 5 日、7 月 4 日、8 月 4 日、8 月 15 日、8 月 25 日、9 月 4 日、9 月 11 日、9 月 19 日、9 月 26 日、10 月 3 日、10 月 10 日、10 月 24 日。
石油醚（ 30 ～ 60 ℃ ） 、正庚烷（ 色谱纯） 、甲醇、氢 氧化钾、无水硫酸钠： 国药集团化学试剂有限公司； ＲNA 抽 提 试 剂 盒 （ PureLinkTM ＲNA Mini Kit） ： 美 国 Invitrogen 公 司； 荧 光 定 量 试 剂 盒 （ QuantiFast SYBＲ Green PCＲ Kit） ： 德国 QIAGEN 公司； 逆转录试剂盒 （ PrimeScript ＲT reagent Kit With gDNA Eraser） ： 日本 TaKaＲa 公司，所有 ＲNA 提取所用溶液均用灭菌的 DEPC 水配制。所用引物均由北京华大生物技术有 限公司合成。 1． 2 主要仪器与设备