实验一 质粒的提取和琼脂糖

6. 加入 加入500 µl去蛋白液 ，13,000rpm离 去蛋白液PE， 离 心30-60秒，弃滤液。 秒 弃滤液。
此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质， 此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用 去除痕量核酸酶等杂质 菌株为JM系列 系列、 菌株为 系列、HB101等，因为核酸酶含量 等 丰富，应加此步骤；如所用菌株为XL-1 Blue 丰富，应加此步骤；如所用菌株为 和DH5α等，核酸酶含量低，则可忽略此步骤。 等 核酸酶含量低，则可忽略此步骤。
二、实验原理 (百泰克
高纯质粒小量制备试剂盒方法) 高纯质粒小量制备试剂盒方法) 本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。
一、原理简介 本试剂盒采用改进 改进SDS-碱裂解法裂解细胞， 改进 离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值 状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA， 再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细 菌成分去除，最后低盐、高PH值的洗脱缓 冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
pMD18-T Vector
800bp的片段插入在 的片段插入在pMD-18T载体上， 载体上， 的片段插入在 载体上 酶切位点为BamHI和XolI 酶切位点为 和
4. LB液体培养基 液体培养基（1L）： 液体培养基
胰蛋白胨 10g , 酵母提取物 5 g , NaCl 10 g 。 加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解， 用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至 总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 1 20 5. LB固体培养基（1L）： 固体培养基（ ）： 固体培养基 在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉 (Agar)15g。
附I：碱法提取质粒的原理和方法
(一)试剂等 一 试剂等
1. SolutionⅠ Ⅰ 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.·Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 高压灭菌后，4℃保存备用。 2. SolutionⅡ(现用现配制) Ⅱ 0.2 mol/L NaOH 1% SDS
处理超过1.5毫升菌液可以离心去上清后， 处理超过 毫升菌液可以离心去上清后，在同 毫升菌液可以离心去上清后 一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤 ，直 管内加入更多的菌液， 一个 管内加入更多的菌液 重复步骤1， 到收集到足够的菌体。 到收集到足够的菌体。
2. 用250 µl溶液 重悬菌体沉淀，涡旋振 溶液P1重悬菌体沉淀 重悬菌体沉淀， 至彻底悬浮。 荡至彻底悬浮。
(二)实验步骤
1. 2. 3. 4. 5.
用灭菌的牙签挑取单菌落放入50ml LB液体培养 基（含Amp 0.1 mg/ml ）中，37℃振荡培养过夜。 将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，10,000 rpm离 心1min，去掉上清液，重复两次。 沉淀悬于200µL SolutionI 中, 涡旋使充分悬浮 充分悬浮。 充分悬浮 加入300µL SolutionII，混匀（注意动作轻 动作轻），冰 动作轻 箱3 ℃放置5 min。 加入300µL SolutionIII,混匀（注意动作轻 ，冰 动作轻） 动作轻 箱3 ℃放置5 min。
4. 加400µl溶液 ，立即温和的上下翻转 溶液P3，立即温和的上下翻转 溶液 6-10次，室温放置 分钟。室温 ， 放置5分钟 次 室温放置 分钟。室温13， 取上清。 000rpm离心 分钟，小心取上清。 离心10分钟 离心 分钟，小心取上清 5 . (将吸附柱安置于收集管上，加入 安置于收集管 将吸附柱安置于收集管上 加入500µl 溶液P4 室温13,000rpm离心 分钟， 离心1分钟 溶液 ，室温 离心 分钟， 弃滤液； 弃滤液；) 上一步所得上清液加入吸附柱 加入吸附柱AC中 将上一步所得上清液加入吸附柱 中 吸附柱放入收集管中）， （吸附柱放入收集管中）， 13,000rpm离心 分钟，弃滤液。 离心1分钟 离心 分钟，弃滤液。
在碱性条件（pH12.5）下，线性 线性染色体 线性 DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒 质粒DNA 质粒 的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕， 紧密结合在一起。 当加入乙酸钾 乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA 乙酸钾 分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性， 离心时染色体 染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀 染色体 出来，而质粒 质粒DNA则留在上清液中。 质粒 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯 的质粒DNA。
1.
2.
3.
试剂盒使用前，在5 mL溶液1中加入 300µl RNaseA（RNaseA终浓度为 0.6mg/mL）。溶液1使用完毕后，立即 于4 ℃保存。 浓缩漂洗液使用前按1：3的比例加入 无水乙醇，例如15 mL浓缩漂洗液中加 入45 mL无水乙醇，混匀后方可使用。 实验前检查溶液2及结合缓冲液是否有 高盐结晶。如有结晶，将盖拧松后加 热10-15秒，高盐结晶溶解后再使用。
(四) 实验操作步骤 四
（二） 材料和试剂
1. 含pMD18-T (或 KS，pRT101)质粒 质粒的 或 ， 质粒
大肠杆菌 DH 5α（HB101）。 2. 含外源基因的重组 重组pMD18-T(或KS， 重组 或 ， pRT101)质粒 质粒的大肠杆菌 DH 5α 质粒 （HB101） 。 3. 氨苄青霉素（Amp）：用无菌水配制 氨苄青霉素（ ） 成50-100 mg/ml 溶液，置-20℃冰箱保 存备用。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解， 如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解， 纯度偏低。 导致提取量和 纯度偏低。
的溶液P2，温和的上下翻转 上下翻转6-10 3. 加250 µl的溶液 ，温和的上下翻转 使菌体充分裂解 直到溶液变得清亮 充分裂解， 清亮。 次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮。
温和的混匀，不要剧烈震荡， 温和的混匀，不要剧烈震荡，以免基因组 不应超过5分钟 DNA剪切断裂！所用时不应超过 分钟！以免 剪切断裂！ 剪切断裂 所用时不应超过 分钟！ 质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠 清亮粘稠， 质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如 果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步。 果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步。
3. Solution Ⅲ（100 ml） 5mol/L KAc 60 ml 冰醋酸 水 11.5 ml 28.5 ml
配制成的溶液Ⅲ含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸 （pH 4.8）。 4. 胰RNA酶 酶 将胰RNA酶（RNA 酶 A）溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至 室温，分装成小份保存于-20℃。 5. 氯仿，乙醇 ，70%乙醇 氯仿， 乙醇。 乙醇
碱法) 实验原理 (碱法)
质粒是一种细菌染色体外 染色体外的、具有自主 染色体外 复制能力的、共价闭合环状 共价闭合环状超螺旋结构 共价闭合环状 的小型DNA分子。 碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。 碱裂解法 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来 分离它们。
质粒的提取和 实验一 质粒的提取和琼脂糖 凝胶电泳检测
(高纯质粒小量制备试剂盒方法,百泰克) 高纯质粒小量制备试剂盒方法,百泰克)
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实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论
一、实验目的
了解高纯质粒小量制备试剂盒和 高纯质粒小量制备试剂盒和 高纯质粒小量制备试剂盒 碱法提取质粒的原理 碱法 原理 掌握百泰克高纯质粒小量制备试 百泰克高纯质粒小量制备试 百泰克 剂盒方法提取质粒的方法 剂盒方法 方法
7.加入 加入500 µl漂洗液 漂洗液WB（请先检查是否已 加入 （ 加入无水乙醇！），13,000rpm离心 无水乙醇！）， 离心30加入无水乙醇！）， 离心 60秒，弃滤液。 秒 弃滤液。 8.重复步骤 一次，13,000rpm离心 重复步骤 一次， 离心30-60秒， 重复步骤7一次 离心 秒 弃滤液。空柱13,000rpm离心 分钟。室 离心2 弃滤液。空柱 离心 分钟。 放置3-5分钟 除去残留乙醇。 分钟， 温放置 分钟，除去残留乙醇。
9. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管 中，在吸附膜的中间部位加60-100 µl洗脱缓 冲液双蒸水 双蒸水或EB（洗脱缓冲液事先在65℃双蒸水 室温放置1分钟， 70℃水浴中加热效果更好）,室温 室温 13,000rpm离心1分钟洗脱质粒DNA，可立即 用于下游分子生物学实验或-20℃保存。
6.
10. 去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或
真空干燥沉淀。 11. 每管中加入25µL无菌水1µL RNase， 37℃ 37℃溶解质粒DNA。 DNA
(三)实验结果及讨论 实验结果及讨论
碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方 法之一，提取量较大，便于操作。
如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。
附II： B型质粒小样快速提取试剂盒 ： 型质粒小样快速提取试剂盒
北京博大泰克（ 北京博大泰克（BioDev）生物基因技术有限责任公司 ）
(一) 概述 一
采用碱裂解--中和法，应用常规台式高速 离心机，经反应条件最优化后，使含有质粒 DNA的上清通过设计独特的离心吸附柱式结 构时，被特殊硅基质材料高效、专一地吸附。 被吸附的质粒DNA随后可用洗脱缓冲液从离 心吸附柱上洗脱下来。
12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新 Eppendorf 管中，注意所取体积（约600 µL ） 。 7. 加入等体积氯仿 等体积氯仿（约600 µL ），混匀（注意动作 等体积氯仿 轻）。12,000rpm，4℃，离心10min，取上清液。 8. 上清液中加入预冷的等体积异丙醇 预冷的等体积异丙醇，-20℃沉淀 预冷的等体积异丙醇 20~30 min。 9. 12,000 rpm离心15 min。 10. 去上清，沉淀加入500µL 70%乙醇 乙醇洗涤2次 乙醇 次 （ 12,000 rpm离心3分钟）。