基因重组技术

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寡核苷酸片段组装基因的方式
基因的组装：按设计要求用许多寡核苷酸片段装 配成完整基因的过程。
第一种方法是先将寡核苷酸 激活，带上必要的5’-P基团， 然后再与相应的互补寡核苷 酸片段退火，形成带有粘性 末端的双链寡核苷酸片段。 把这些双链寡核苷酸片段混 合在一个试管中，加上T4 DNA连接酶，使它们彼此连 接组成一个完整的基因或者 是基因的一个片段。
基因重组技术
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3 基因重组技术 3.1 概述 3.1.1 定义
基因重组技术是一种在分子水平上按照人们设 计的蓝图对基因进行人工操作的技术，具体地说， 就是从一种细胞中把目的基因提取出来，在体外把 它和一种载体分子连接，然后用人工的方法将这种 杂种DNA分子引入到另一种细胞中去，让其大量复 制繁殖或产生大量基因表达产物。
3 基因重组技术 3.4 基因重组技术的载体 3.4.1 载体的定义和基本特性
• 载体(vector)的定义：
在基因重组中，可与外源DNA片段构成重组体， 并能将重组体DNA导入受体细胞，使外源DNA得以复 制或表达的DNA分子。
• 载体应具备的基本特性：
• 在宿主细胞中能独立复制；
• 具一段不影响其复制的非必需区域；
• 简称 限制性内切酶、限制酶、内切酶。
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• 种类 目前，已从近300种不同的微生物分 离出约500种限制性核酸内切酶。
• 类型（ 三种类型） 型酶、 型酶和 型酶。 若无说明，通常的限制性核酸内切
酶就是指 型酶。
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三种核酸限制性内切酶的主要特性比较
特性
酶分子的结构与功能 辅助因子 识别序列 切割位点 在DNA克隆中的用途
定义：能催化双链DNA分子中相邻的5’-P与3 ’-OH 之间形成磷酸二酯键的酶。
活性：封闭缺口(nick)，不能封闭裂口(gap)。
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两种DNA连接酶比较
DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
大肠杆菌
大肠杆菌T4噬菌体
辅助因子
NAD+
ATP
功能
缺口（nick） 缺口修补和平头末端连
修补
接
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T4 DNA连接酶在基因重组中的用途 • 补缺口 • 平头末端连接 • 粘性末端连接
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3 基因重组技术 3.4 基因重组技术的载体 3.4.2 载体的种类
根据受体细胞不同 • 大肠杆菌载体 • 酵母载体 • 动物基因工程载体 • 植物基因工程载体 等
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3 基因重组技术 3.4 基因重组技术的载体 3.4.3 质粒载体
质粒(plasmid)的定义 ： 质粒是染色体外能自我复制的小型DNA分子。广
② 载体
⑤ 筛选
⑥ 表达
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3 基因重组技术 3.2 基因重组技术的工具酶 3.2.1 限制性核酸内切酶(Restriction endonuclease)——分子剪刀
• 定义 是一类以环状或线性双链DNA为底物，能识别 DNA中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使 每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具3’-OH和 5’-P基团DNA片段的内脱氧核苷酸酶(endodeoxyribonuclease)。
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3 基因重组技术 3.4 基因重组技术的载体 3.4.4 酵母载体
按载体在酵母细胞中的复制形式分类
酵母整合载体（yeast integrating vector）
酵母人工染色体（yeast artificial chromosome） 质粒载体 酵母附加型质粒（yeast episomal
plasmid, YEp）
3’ 5’
Eco RI
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切割方式
已知大多数II型限制性核酸内切酶在其识别序列内部 切割双链DNA，水解磷酸二酯键中的3’位的酯键， 产生3’端为羟基、5’端为磷酸基团的片段。
切割后形成3种不同末端结构的DNA片段：
在识别序列的对称轴上同时切割，形成平头末端 （blunt end），如Hae III；
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寡核苷酸片段组装基因的方式
第二种方法是尽可能的 减少合成寡核苷酸片段 的用量。将两条具有互 补3’末端的长的寡核苷 酸片段彼此退火，所产 生的单链区域以3’-OH 为引物，用DNA聚合酶 处理，便会合成出相应 的互补链。
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3 基因重组技术 3.以重新结合起来， 形成双链，此过程称为DNA复性（renature），也 叫退火（annealing）。变性和复性在一定条件下是 完全可逆的。
DNA双链解离一半时的温度叫做解链温度（melting
temperature，Tm）。
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3 基因重组技术 3.3 目的基因的分离 3.3.3 PCR制备基因
启动子 PLac来源于大肠杆菌（乳糖操纵子）、
PTrp(色氨酸操纵子)
PTac（来源于Lac和Trp的杂合启动子）
强转录终止序列
核糖体结合位点（S-D序列）、起始密码子、终密 32 码止子
pGEX表达质粒载体
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3 基因重组技术 3.4 基因重组技术的载体 3.4.4 酵母载体
酵母是一类单细胞的真核生物，作为一种真核生物 表达系统，其优势在于： 基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单； 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统； 不含有特异性病毒，不产毒素，较为安全； 发酵工艺简单，成本低廉； 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。
3’ 粘性末端
5’ 粘性末端 平头末端
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限制性核酸内切酶在基因重组中的用途
1. 分割基因组DNA;
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限制性内切酶在基因工程中的用途
2. 获得分子重组所
必需的末端；
A
B
A
B
A+B
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3 基因重组技术 3.2 基因重组技术的工具酶 3.2.2 DNA连接酶（DNA ligase）——分子浆糊
概念：(Gene bank；Gene library) 将一个基因组的DNA用限制酶切割成适当大小 的片段，并进行克隆化，从而形成的含有重组 D组技术 3.3 目的基因的分离 3.3.3 PCR制备基因
几个相关概念
DNA双螺旋结构的生物功能主要在于复制和转录。 加热或变性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂，双 链解离，形成单链DNA，这称为DNA变性 （denature）。
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3 基因重组技术 3.4 基因重组技术的载体 3.4.3 质粒载体
克隆质粒载体
专用于基因或DNA片段无性繁殖的质粒载体。
复制必 需区
选择标 记基因
保证质粒拷贝 数
筛选重组子
克隆位 点
便于插入外源 DNA
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3 基因重组技术 3.4 基因重组技术的载体 3.4.3 质粒载体
表达质粒载体 专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载 体。除了具有克隆质粒载体的三个基本构件外，还需 要有能控制插入的外源基因进行有效转录的序列以及 适当的翻译调控序列。
酵母复制质粒（yeast replicating plasmid, YRp）
酵母着丝粒质粒（yeast centromere plasmid, YCp）
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3 基因重组技术 3.4 基因重组技术的载体 3.4.5 动物基因工程载体
主要由动物病毒构建的一类载体。 例如：SV40病毒载体、反转录病毒载体、杆状 病毒载体、痘苗病毒载体、腺病毒载体、乳头 状病毒载体、单纯疱疹病毒载体等。
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3 基因重组技术 3.1 概述 3.1.1 定义
别称： 基因工程（Gene engineering） DNA重组 (DNA recombination) 遗传工程 (Genetic engineering) 基因操作 (Gene manipulation) 基因克隆 (Gene cloning) 分子克隆 (Molecular cloning) ……
泛存在于细菌细胞中，也存在于霉菌、蓝藻、酵母和 少数动植物细胞中，甚至线粒体中都发现有质粒的存 在。
注意：酵母的杀伤质粒（killer plasmid）为RNA质 粒。
质粒载体是基因重组中最常用的载体，主要是以细 菌质粒的各种元件为基础组建而成的。它必须包含 有三种共同的组成部分：复制必须区、选择标记基 因和限制性核酸内切酶的酶切位点（克隆位点）。
3. 延伸，即在DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷酸、底物及
Mg2＋存在的条件下，DNA聚合酶依赖其5’→3’的聚合酶
活力，以引物为起始，互补的DNA链为模板，使引物序
列得以延伸，形成模板DNA的互补链。经过高温变性、
低温退火、中温延伸3个温度的循环，模板上介于两引物
之间的片断不断扩展。
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距识别序列下游 2426bp处切割
有用
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识别序列
• 定义
限制性核酸内切酶在双链DNA分子上能识别的 特定核苷酸序列。又称为识别位点、靶位点或切割 位点。
• 长度
4、5、6或7个核苷酸。
• 结构特点
具有双重旋转对称结构，即：回文结构 （palindromic sequence）。
5’ GAATTC’ 3’ CTTAAG
原理：
聚合酶链式反应（PCR）是一种特定区段的DNA复 制，必须有DNA模板（template）、DNA聚合酶 （DNA polymerase）、DNA引物（primer）、四种 dNTP和Mg2＋。
要扩增模板DNA中的A～B区间的DNA片段，首先要 设计两条寡核苷酸引物，而PCR扩增DNA的特异性 和长度就由人工合成的这两条引物决定。引物1和引 物2这段DNA的序列是已知的，这是PCR扩增的必要 条件。
I 型酶
三亚基多功能的酶 ATP、Mg2+、S-腺苷
甲硫氨酸（SAM） 特异性，非对称序列
距特异性位点至少 1000 bp处随机切割
无用