冷冻保存精子,把“根”留住
超低温冷冻技术应用于鱼精子保存的研究进展
超低温冷冻技术应用于鱼精子保存的研究进展鱼类是重要的水产资源之一，但其精子保存和利用面临着很多挑战。
传统的鱼精子保存技术主要是低温保存，但此方法存在精子损伤或死亡的问题。
近年来，超低温冷冻技术在鱼精子保存方面的应用成为了研究的热点，在提高精子储存质量方面取得了重要进展。
超低温冷冻技术是一种物理方法，采用低温存储方式将细胞或组织冷冻在极低温度下，从而达到保存和利用的目的。
该技术在人类和动物领域都有广泛应用，并逐渐在水产领域得到应用。
超低温冷冻技术可以减缓细胞代谢，防止细胞死亡，延长细胞储存寿命，同时保持细胞的完整性和功能。
超低温冷冻技术的成功应用离不开冷冻介质的选择和调控。
常用的冷冻介质有甘油、乳糖、蔗糖、酪蛋白和胆固醇等。
此外，添加不同的物质，如抗氧化剂、防抱死剂和增粘剂等，也可以改善鱼精子的冷冻质量。
超低温冷冻技术对鱼类精子保存的影响主要包括以下几个方面。
首先，超低温冷冻技术可以改善鱼精子的贮存稳定性。
通过优选冷冻介质和添加辅助物质，冷冻鱼精子可以达到长期储存的目的。
研究表明，用7.5%甘油作为冷冻介质可以明显提高鲤鱼、鳕鱼和金枪鱼等鱼类精子的存活率。
其次，超低温冷冻技术可以提高鱼精子的存活率。
研究表明，将鱼精子冷冻在极低温度下，保持其形态和活力，有望达到高存活率的目的。
以贤雄鱼为例，使用增粘剂和胆固醇为助剂，将鱼精子以极低温度（-196℃）保存5天，细胞存活率达到了80%以上。
第三，超低温冷冻技术可以保持鱼精子的生殖功能。
研究表明，细胞冷冻后，即使没有死亡，生殖功能也可能受到损害。
但通过超低温冷冻技术，可以在一定程度上恢复受损的生殖功能。
比如，经过良好保存的鳕鱼精子，在完成冷冻、解冻等程序后，仍可以在水中进行有效的受精作用。
总的来说，超低温冷冻技术在鱼精子保存方面的应用展现出了广泛的前景。
但是，仍需进一步探索该技术在不同鱼类的保存效果和规模化应用方面、冷冻介质和辅助物质的选择以及细胞死亡原因等方面的问题。
为什么精子和卵子冷冻多年而不失效？
为什么精子和卵子冷冻多年而不失效？我们知道，胎儿是从一枚男性的精子与一枚女性的卵子结合成受精卵后发育而来。
在现代医学中，卵子和精子实际上可以冷冻多年，并在需要时再使用它们。
那么，这要如何操作呢？由于精子和卵子从本质上来说是细胞，长时间冷冻会不会影响它们的“有效性”？如果没有，那么同样的原理和技术是否可以用来“保存”整个人体，即冷冻身体并多年后使他们复活？冷冻保存：冷冻精子和卵子无论人的身体以及生活方式多么健康，无论是男性还是女性，人的生育率都会随着年龄的增长而下降，特别是会在35-45岁的年龄时会急剧下降。
一些人可能很早就会出现这样的情况，其他人则可能晚一些。
卵子质量的下降使得染色体异常的婴儿增加，流产的风险也在增加。
这种情况的解决方法就是冷冻保存卵母细胞。
简而言之，冷冻保存是将组织冻结起来，在将来可以使用。
由于冷冻的精子细胞、卵子和胚胎不会老化，无论出现了医学问题还是其他问题，都可以维持个体的生育能力。
此外，这不是只能冷冻几年，卵子可以被长期冷冻。
这就是为什么一个女人可以冻结她的卵子，作为维持她以后生育能力的有效手段。
除此之外，当女性变老且不像她年轻时那样有活力时，冷冻多余的胚胎可以降低随后人工辅助受孕的成本。
为什么人们会选择冷冻她们的卵子？如前文所述，冷冻卵子的最大优势在于它有助于保持女性生育能力。
现在，这是优势。
但为什么人们首先选择冷冻卵子/精子？其中有这么几个原因。
第一，一些人可能因为医学原因而想推迟生育。
例如，如果一个人即将要开始化疗，他们可能想冻结他们的卵子/精子，那么将来就可以使用，因为癌症治疗可能会降低生育能力。
第二，许多人因为个人原因推迟生育。
有一个有趣的现象，在第一批“卵子冷冻”女性（从2005年到2011年）中，超过80%的人没有伴侣。
这背后也有一些原因，其中之一就是现代女性想要在生育孩子之前，更加关注于自己的事业。
卵子如何长期保持冷冻而不失其有效性？人们可能会想知道卵子/精子细胞如何能长时间冷冻而不失“有效性”。
冷冻精子：能把“根”留住么
有了冷冻精子孕育孩子现实的成功，网上盛传，可能会有一批人将从丁克一族走到冷冻一族。
因为，一些丁克，为防止年老后想要孩子时，精子质量不好，或根本就达不到授孕的精子数量了，年轻时想把自己的精子冷冻“存”起来，留条后路。
然而，采访中发现，无论是医学专家，还是伦理学家，都不赞成这种做法，因为，冷冻精子只是一种辅助生育手段，为不孕不育患者提供最后的帮助。
在精子健康时，把它们冷冻起来，以备不时之需，如同给生育买了份保险。
那这份保险靠谱吗？冷冻会不会伤害精子？带着这样的疑问，本报记者走访了北京大学人民医院相关专家。
/上海不孕不育专科医院冷冻精子不会变质？在一些人眼中，精子冷冻复苏就像自己家中冰箱中的冻肉化冻一样，而且会变质。
但事实上并非如此。
“目前精子冷冻技术已相当成熟，加入保护剂的精子一旦冷冻保存起来，它的生物活性就停止了，这意味着精子并不变质。
”北京大学人民医院生殖医学中心助理研究员梁蓉说。
临床上，将通过手淫射出的精液收集，取少量做抽样检查后，剩下的加入保护剂，超低温(零下100多℃)冷冻起来。
需要使用的时候，将储存精子的样品管于室温下浸在自来水或双蒸水中或仅仅暴露于空气之中(两者均在室温下22℃ 左右进行)进行解冻。
“加入保护剂，可防止精子细胞内水分结冰后，体积增大撑破细胞膜。
”梁蓉说，但在解冻过程中，有一半左右的精子细胞会死亡，原因很多，如精子细胞内冰晶融化时，胞内液体会和胞外保存液发生交换，如果进入细胞内的液体过多、过快，会破坏精子细胞。
“但是剩下的精子，如果活力良好，足够进行辅助生育技术。
”北京大学人民医院生殖中心主任医师沈浣说：“理论上，一个受精卵只需要一个精子，如果健康精子数量过少，可以选用显微注射法，将精子一个一个注入卵细胞中。
”理论上可无限期保存“精子冷冻后，生物活性停止，理论上可长期保存。
”梁蓉说。
伊恩·莫里斯的精子就是最典型的例子。
而且，他还不是时间最长的，2004年，英国曼彻斯特的圣玛丽医院宣布一条令医学界轰动的消息：一名32岁的母亲利用试管婴儿技术于2002年顺利生下一名男婴，而她所使用的精子，竟是已被冷冻21年——1979年当她的丈夫接受睾丸癌手术治疗前所冷藏的精子。
猪精液冷冻保存技术.
冷冻速率：30～50℃/min。解冻速率：1200～1800℃/min 冷冻 0.25mL微型细管：50℃/min、1.5％甘油浓度；
0.5mL小型细管：30℃/min、3％甘油浓度； 5mL大型细管：16℃/min 、3.3％甘油浓度。 解冻 0.25mL、0.5mL细管：50℃，12s或37℃，20s； 5mL细管：50℃，40s 5mL塑料袋：50℃，13s
初始温度为5℃，以3℃／min从5℃降到-5℃，再于-5℃条件下保持1min结晶，然后 以50℃／min从-5℃降到-140℃，然后投入液氮保存。
5)液氮熏蒸冷冻：
在广口液氮罐内，与液氮面距离5cm处，熏蒸20分钟，然后投入液氮保存。
影响猪精液冷冻效果的因素
个体的影响
个体对精液冻后效果影响极大。应用限制性片断长度多态(AFLP)分析控制 精子冷冻能力的基因，没有发现差异。差异的机制仍需要继续研究
猪精液冷冻技术操作流程
精液采集 质量检测 第一次稀释 降温、平衡
（15℃， 5℃ ）
第二次稀释 平衡 冷冻 保存
猪精液冷冻技术操作流程
颗粒法冻精的冷冻程序
1)新鲜精液在常温、等温条件下，用不含甘油的I液稀释，然后平衡0.5～2h; 2)缓慢降温至15℃维持4h，再从15℃经1h降至5℃; 3)用等温的含甘油的II液进行稀释。 4)稀释后用液氮熏蒸法制作冻精颗粒。
（用颗粒状冷冻精液给23头青年母猪输精, 48h后剖检11头,有5头受孕; 25-30d后剖检另外12头,有10头怀孕）
猪精液冷冻技术研究概况
我国从70年代初期开始对猪精液冷冻技术进行探索。 1975年西安市草滩农场试配了8头母猪 。 1977年成立了全国猪冻精协作组。 1986年冷冻精液累计配种母猪6万余头， 近几年： 甘肃农业大学 张兆旺教授 南京农业大学 芮荣教授 西北农林科技大学 李青旺教授 四川农业大学 马恒东教授 东北农业大学 刘娣教授 上海农科院 张德福研究员
实验十五精液的冷冻保存
实验十五精液的冷冻保存一.实验特点实验类型：综合型实验实验类别：专业基础课计划学时：2学时每组人数：3～4人二、实验目的要求精子具有受温度变化直接影响本身活动力和代谢能力力的生物学特性。
利用这一特性，将精液特殊处理后，保存在超低温下，精子代谢活动完全受到抑制，停止能量消耗，处于生命静止状态，长期保存下来。
一旦升温精子又能复苏并维持其原来的受精能力。
要求同学们了解精液冷冻保存的技术操作过程和精液冷冻保存原理，初步学会冷冻保存方法。
三．实验原理冰晶化是水在降温过程中的一定温度下，水分子重新按几何图形排列形成冰晶。
冰晶可造成精细胞（精子）内外的溶质浓度和渗透压增高，引起细胞内脱水、原生质变干、酸碱失去平衡、细胞膜和顶体以及整个组织和结构破坏等致死性伤害，最后导致精子发生不可逆的变化而死亡。
一般精液内含85%～95%的水分，精子内也含有及少量的水分，这些水分在降温过程中在-0.6～-60℃温度区内缓慢降温能形成冰晶。
降温速率越慢，所形成的冰晶越大，其中特别以-15～-25℃时冰晶形成最多。
在冷冻精液过程中只有避开这个有害温度区，才能得以长期保存。
快速升降温度的办法，难以达到完全玻璃化冻结条件。
为此，在制作冷冻精液的稀释液内，要加入一定量的甘油等抗冻害物质。
甘油具有极强的亲水性，可限制水分子形成冰晶而处于过冷状态，降低水形成冰晶的温度，即缩小精子的有害温度的上限。
此外甘油容易渗透精子内，可降低渗透压改变的不良影响及营养作用等，增强精子的抗冻害能力和无冻害生存环境。
精液在冷冻过程中不可避免地要形成冰晶，精子能否生存的关键在于冰晶的大小，冰晶越大对精液伤害越大，反之冰晶越小，伤害越小甚至无损伤。
因此，只要避免大冰晶形成，并使精子稳定在微晶的状态下，一旦升温精子又能复苏并维持其原来的受精能力。
四．实验材料和仪器精液、2.9%的柠檬酸钠溶液、50～100ml烧杯、滴管、10 ml试管、低温温度计、20～80目纱网、漏勺、灭菌纱布袋、液氮罐、液氮、载玻片、盖玻片、显微镜、保温箱。
对室温下储存野生动物精子的研究
对室温下储存野生动物精子的研究近年来，随着人类对于野生动物保护意识的不断提高，越来越多的科学家开始关注野生动物精子的储存技术，以期将这种宝贵的资源充分利用起来。
在与此相关的各种研究领域中，对室温下储存野生动物精子的研究也引起了广泛的关注。
野生动物种群的数量逐年减少，这是现代人类面临的一个严峻问题。
虽然采取一系列措施，如加强保护、减少猎杀等，依然难以遏止野生动物数量的下降。
因此，如何有效地保存野生动物的生殖系统是非常重要的。
传统储存方式在以前，储存野生动物精子的方法主要有两种：一种是低温冷冻，另一种是低温液氮保存。
低温冷冻是目前应用最广泛的一种保存方式。
将采集到的野生动物精子与用适当浓度的冻精液冻结在-196度的液氮中，可保存数十年甚至数百年。
其缺点是保存过程非常复杂，需要高科技的低温保存设备和昂贵的液氮。
低温液氮保存则是新一代储存方式。
采用低温液氮保存，能够更有效地保护野生动物精子的质量和数量。
虽然对设备要求更高，但应用前景更广泛。
室温储存方式然而，随着科技的发展，对室温储存野生动物精子的研究也越来越多。
很多人认为，野生动物精子的保存还可以通过室温储存等方法来完成，从而大大降低保存成本。
在室温储存野生动物精子的过程中，最主要的技术手段是防干燥。
只要能够保证防干燥，在适当的情况下，野生动物精子依然可以很好地保存。
比如，它可以被保存数个小时，或者是几天，整个过程保持在室温下。
但是，室温环境下精子的寿命通常只有数小时，即使有一些特殊例外。
室温储存技术的应用室温储存野生动物精子的技术应用存在几个局限性。
首先，它不能不用移植同时储存多个物种的野生动物精子，因为不同物种需要不同的室温或湿度要求。
其次，野生动物精子部分的储存时间很短，因此适用于一些突发事件的情况，如研究中心的紧急物资缺乏，或者是传染病爆发等。
室温保存野生动物精子也有一些优点。
比如，它能够更有效地保护野生动物精子的质量和数量。
同时，由于不需要动用冷冻或液氮设备，所以它的成本相对较低。
精子冷冻贮存
精子冷冻贮存6.1 引言精子冷冻保存是男科实验室工作中的一个重要组成部分，特别对不孕不育门诊的男科实验室来说。
从19世纪40年代末起，人类就开始研究精子低温生物学。
发现甘油能保护精子免受冷冻损伤，可以将人类精子冷藏在–79℃的干冰上(Polge et al., 1949; Bunge &herman, 1953; Bunge et al., 1954)。
随着液氮广泛应用，人类精子冷冻贮存技术取得快速发展，在许多国家建立起商业用途的精子库和国际间合作服务项目(Perloff et al., 1964; David et al., 1980; Clarke et al., 1997; Leibo et al., 2002)。
由于采用不同的冷冻保护剂和不同冷冻程序，出现许多冷冻贮存实验设计方案。
冻融后细胞存活率主要取决于细胞内冰晶形成量能降低至何种程度，通过选择恰当的冷冻保护剂和采用最适冷冻速率和复融速率来减少细胞内水形成冰晶提高细胞的存活率(Sherman, 1990; Keel & Webster, 1993; Watson, 1995)。
特别在复融过程中，当精子处于–130℃（玻璃化转化状态的关键温度）以上时间太长，细胞内有害的冰晶增多发生重结晶。
人类精子能够耐受一定范围内的冷冻和复融率。
它们对快速冷冻（冷体克）产生损伤不敏感，主要原因可能是精子细胞膜中脂质双分子层结构的不饱和脂肪酸增加细胞膜流动性。
而且因为细胞内水分含量少（约为50%），精子比其它细胞更能耐受低温导致损伤。
但是低温仍对精子功能仍产生不良影响，特别是对精子活力影响比较大。
一般而言，只有大约50%的活动精子能在冻存后复苏保持活力(Keel & Webster, 1993)。
优化精子冷冻保存方法减低对活动精子的损害从而提高妊娠率(Woodset al., 2004)。
影响供精人工授精的妊娠率的因素包括复融后精子质量、人工授精的时机，而最为关键的是受方因素如年龄，前次供精妊娠情况以及与排卵、子宫输卵管相关疾病(Le Lannou & Lansac, 1993)。
精液的冷冻保存word版本
Y为每ml原精液中呈直线前进运动总精子数 M为冷冻精液解冻后预测精子活力 Z为每头份冷冻精液要求最低应含有直线前进运动精子数 V为冷冻精液剂型容量
由于细管型冷冻精液的容量为0.25或0.5ml，因此稀释倍数较低。而颗粒型冷冻精液 前后需经两次稀释(冷冻稀释和解冻稀释)，每头份剂量为1.5～2.0ml，因此稀释倍数也 就较高。
精液的冷精液冷冻保存的方法，
要求学会： • 1、稀释液和解冻液的配制方法； • 2、精液的稀释、降温、平衡及制冻的技术； • 3、冷冻精液的解冻技术。
• 二、实验材料：公猪精液、公牛精液、新鲜牛奶、新
鲜鸡蛋、葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠（二水）、蒸馏 水、量筒、玻璃注射器、烧杯、三角烧瓶、滴管、冰壶、 保温杯或小液氮罐或泡沫盒、冰、液氮、0.25mL塑料吸管、 冷冻架、温度计、水盆、纱布、棉花，抹镜纸、75%精棉 球、镊子、捞筛、液氮罐、载玻片、小玻棒、石腊油、显 微镜、水浴锅、铝锅、电炉、标记笔等。
• 4、制冻
• （1）将保温杯或冰壶用小量液氮预冷2min，然后装入液 氮约7成满，并将制冻用的吊盆平稳地固定于离液氮面约 1～1.5cm处，加盖预冷2min。
• （2）揭开壶盖，用滴管吸取平衡过的稀释精液，迅速滴 在吊盆的凹槽内，每滴约lmL。滴完，加盖l～2min，然后 揭开壶盖，当精液完全冻结，并发出“喳喳”声时，即可 铲脱并倒入液氮内进行冷冻保存。
THANK YOU FOR YOUR
（2）解冻液的配制 用天秤分别称取葡萄糖1.5g、柠檬酸钠（二水）0.75g置于
干净的烧杯中，再加蒸馏水50mL，加盖隔水煮沸消毒10min， 取出冷却后，加入安那咖注射液1ml便成解冻液。
• 2、精液的稀释
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冷冻保存精子，把“根”留住
利用“精子银行”留“根”
“不等了，我们离婚吧!”在男科门诊常常能够听到这种无奈的话语。
结婚多年的夫妻，因为丈夫的精液质量问题(无精子、少精、弱精、畸形精子等)而最终导致劳燕分飞。
“精子荒”已经成为一个严峻的社会问题。
当代男人的精子和生育能力正在经受严峻的考验，许多男人不约而同地将自救措施瞄准了“精子银行”或“精子库”，希望将自己的生育种子寄存在那里，以备不时之需。
所谓“精子银行”或“精子库”，就是指超低温冷冻存放精子的地方和设备。
精液冷冻是保存生育能力的一个有效办法，在接受具有生殖毒性药物和仪器治疗前先保存精子，已成为一种选择。
目前认为，“精子银行”主要适合于下列几类人：
第一，对于那些还没有完成“传宗接代”任务，而又处在高危因素笼罩下的男人来说，“精子银行”可以起到储备生育能力的作用，防止因为某些损害因素，包括药物、手术、损伤等造成的生育能力的永久性丧失。
例如某些即将长期接触有害睾丸健康的特殊职业(辐射和放射线等)人群，因某些疾病(恶性肿瘤)不得不使用损害
睾丸的化疗药物，不得不手术切除睾丸(睾丸肿瘤)等的
人群，可以预先冷冻精液，起到“生殖储备”的作用。
这也是使用“精子银行”的主要人群。
第二，“精子银行”可作为用于治疗男性不育症的
手段，可以多次保存少精子症者的精液，起到积少成多
的作用，最后可以“集中优势兵力”，用于人工授精，
期望一举获得成功。
另外，“精子银行”也是计划生育
措施顺利实行的有力保证。
精子冷冻安全，并非人人需要
低温冷藏的精子具有较高的质量和安全性，在零下196摄氏度的低温下可以将精子良好保存达数十年之久，且这些精子仍然具有生育能力。
在低温保存过程中，还
可以淘汰许多发育异常的精子。
一些携带传染性病原体
的献精员，例如艾滋病病毒携带者，也可以在精子冷藏
保存过程被发现而淘汰其精液。
因此，采用“精子银行”的精子是比较安全且让人放心的，获得怀孕者自然流产
机会少，出生孩子畸形者少，后代素质高。
从理论上讲，所有男人的精子都可以保存在“精子
银行”里，从而使生育能力获得万无一失的保障。
以现
今的科学技术，保存精子已经是非常简单的常规手段，
费用(每年2000～3000元)也可以承受，但并不是所有的男人都需要“精子银行”的帮助。
“精子银行”保存精子，从理论上讲，可以安全地
保存几十年，甚至数百年，但也不是万无一失的，例如(尽管可能性很小)，一旦冷冻剂液氮没有及时得到补充，弱小的精子是难以逃生的;况且经过十几年或几十年而没使用的精子，势必也要接受环境中射线和辐射的影响，
难免会发生质的改变。
没有哪位专家敢担保精子保存过
程是完全没有问题的。
保存精子之前要做的事情
由于“精子银行”保存精子的主要目的是为男性生
殖能力作储备，故在保存精子之前，男人应该做到如下
几项：
1.检查身体是否健康。
患有疾病的男人可能更加担
心自己的生育能力，选择使用“精子银行”的机会更多，需要特别当心。
因为一些疾病(尤其是泌尿生殖系统的感染性疾病、精索静脉曲张、内分泌紊乱等)，在没有治愈之前可能会损害精子的生殖能力，应该在保存精子之前
加以治愈，或至少要得到有效控制。
2.验证精液是否达标，可进行精子的质量分析。
如
果精液质量很差，保存起来的精液仍然不能真正达到生
殖储备的作用(除了希望以后进行试管婴儿技术的男人)，那还有什么用呢。
3.培育良好的精子。
由于一代精子的发生周期是3
个月，因此在计划冻存精子时，应提前3个月作准备，
包括不酗酒，不吸烟，不接触农药、汽油、重金属等危
害睾丸的因素，避免睾丸外伤，避免睾丸接受热辐射(桑拿浴、穿紧身内裤和牛仔裤、热水坐浴、射频和微波等)，综合饮食(多食用肉类、海鲜、蔬菜和水果等)，避免偏食。
4.将最好的“根”留存下来。
在留取精液前应先禁
欲3～7天，避免身体过度疲劳，保持充沛的精力和良好的情绪，并在取精前彻底清洗外生殖器官。