临床免疫学检验-课件-第十一章 固相膜免疫分析技术4.23
• 避免冻存：导致胶体金聚集。 • 20天内标记：胶体金的不稳定性。
（三）免疫金的制备(P53)
1. 制备原理
• 原理：胶体金与抗原或抗体等大分子的结合。 • 实质：抗原或抗体吸附在胶体金表面。 • 吸附机制：不明确，可能是静电吸附作用。
胶体金表面带负电荷 蛋白质含正电荷的基团 静电吸附作用牢固结合 • 优点：物理吸附，不影响蛋白质的性质。
胶体金溶液pH的调整 确定胶体金与蛋白质的最适反
应比 磁力搅拌下，逐滴加入蛋白质
至胶体金溶液中 加入稳定剂如5%BSA
纯化、鉴定、保存
吸附取决于pH
• 接近蛋白质等电点 或偏碱条件下，胶 体金与蛋白质易形 成牢固结合物；
• 低于等电点，聚集 • 常用0.1mol/L K2CO3、
0.1mol/L HCl调节 • 标记IgG调 pH9.0
加入不同量的柠檬酸三钠即可得不同粒径的胶体金
3. 鉴定和保存
（1）鉴定：粒径大小、粒径均一性，有无凝集颗粒
肉眼观察：观察颜色和浊度，若清亮透明即
良好胶体金，若浑浊或液体表面有漂浮物提 粗
示有凝集颗粒。
略 估
计
分光光度计：测定最大吸收波长（见图）
透射电镜：精确测量胶体金平均粒径。测量
100个以上，计算平均直径和标准差。
基础金核（原子Au）和双离子层 内层：负离子层AuCl2外层：正离子层的H+
•金颗粒间因静电作用互相排斥，成稳定的胶体状 态，形成带负电的疏水胶溶液。
胶体金特性 胶体特性 呈色性和光吸收性 稳定性 聚沉现象
1. 胶体特性 1~100 nm，微小颗粒稳定、均匀、呈 单一分散状态，成胶体金溶液。 对电解质敏感：可破坏胶体金的外周 水化层→胶体金凝聚成大颗粒沉淀。 某些蛋白质分子可稳定胶体金。
金纳米微粒体系的吸收光谱 1. 12 nm; 2.19nm; 3. 24nm; 4. 33nm; 5. 41nm
50 nm
100 nm
金纳米球电镜照片图 A：20nm；C金纳米棒： 51×21nm
王康林.纳米金共振散射相关光谱及其应用,2008
优质
劣质
（2）保存：
• 洁净的玻璃容器；室温避光无灰尘环境中保 存3个月，4℃保存半年。
溶剂膜斥力：金颗粒间有一层厚的溶剂化膜， 反抗金颗粒接近。膜斥力越大，越稳定。
4. 聚沉现象
• 电解质：中和胶体金颗粒的电荷量，使溶剂 层变薄，胶粒间排斥力减少，合并趋势增强。
• 温度：越高，吸附能力减弱，溶剂化程度降 低，不稳定性增加。
• 浓度：越高，粒子间距减少，引力增加。
（二）胶体金的制备
溶液由淡黄色转为灰
快速加入1％柠檬酸三钠，2mL 色，黑色，酒红色 煮沸15min，移除热源，继续搅拌至室温 恢复至原体积。
d=16 nm
胶体金粒径与柠檬酸三钠加入量的关系
胶体金颗粒（nm） 1%柠檬酸三钠(mL)*
16 24.5 41 增大 71
2.00 1.50 1.00 降低 0.70
*100mL，0.01%氯金酸中加入的柠檬酸三钠
被检物：通过抗原抗体反应检测抗原或抗体 结果: 可见的显色结果 类型：侧向横流形式（免疫层析试验）；穿流形式
（免疫渗滤试验）
临床上常用的固相膜免疫技术
胶体金免疫渗滤试验 胶体金免疫层析试验 斑点酶免疫吸附试验 免疫印迹法
胶体金免疫技术
第一节 胶体金免疫技术
colloidal gold immunoassay
1. 制备原理（化学合成法）
氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大 小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。
常用还原剂：柠檬酸三钠、鞣酸、维生素 C、白磷、硼氢化钠等，根据还原剂的强 弱可制备直径为0.8~150 nm不等的胶体金。
2. 常用制备方法
配制0.01％ HAuC14溶液，100mL 搅拌，煮沸
蛋白质的最适标记量
AuNPs
倍比稀释蛋白质
对照
NaCl
混匀，静置数小时
纯化
鉴定
保存
• 除去未标记的蛋 白、未充分标记 的胶体金以及标 记过程中形成的 聚合物；
• 超速离心，凝胶 过滤法。
• 电镜测量颗粒平 均直径；
• 鉴定特异性和敏 感性。
• 含稳定剂缓冲液 配成工作液保存；
• 加50%甘油； • -18℃可保存一年
第十一章 固相膜免疫分析技术
（solid phase membrane-based immunoassy）
固相膜免疫分析技术
以微孔膜为固相载体
微孔膜具有多孔性，像滤纸,可被液体穿过（穿流,渗 滤）；或经毛细管虹吸作用在膜上泳动(侧向横流)
标记物：酶或各种有色离子（彩色乳胶、胶体金或 胶体硒）标记抗体或抗原
1.原理：
以硝酸纤维素膜为载体，以胶体金作为示踪标 记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种标记 免疫测定技术。 2.常用胶体金免疫诊断方法 胶体金免疫金渗滤试验和胶体金免疫层析试验
一、胶体金和免疫金的制备(p46)
（一）胶体金（colloidal gold）
•定义：金盐被还原为金原子后形成的金颗粒悬液 •结构：
2. 呈色性和光吸收性
随颗粒大小改变
颗粒大小不同，呈色不同： （小）2~5 nm 橙黄色；（中）10~20 nm 酒红色；
（较大）30~80 nm紫红色。 光吸收性也不同：
可见光内单一吸收峰，随颗粒大小而变化。 λmaxFra bibliotek10~550nm
肉眼观察胶体金颜色或测定其吸收峰波长的变 化粗略预估胶体金直径大小
不同直径金颗粒的呈色性和光吸收性
胶体金颗粒 （nm）
16 24.5 41 71
胶体金特性
呈色
λmax（nm）
酒红色
518
橙红色
522
红色
525
紫色
535
3. 稳定性
胶粒间的相互吸引力： 距离近，引力大导 致胶体颗粒合并变大。
胶粒与溶剂化层带电情况：各金胶带相同的 电荷，同性电荷相斥，双电层越厚，胶粒带 电量愈大，排斥力越大，越稳定。
以上。
二、胶体金免疫技术的方法学 种类与原理
（p125-p127）
（一）胶体金免疫层析法（GICA）
1. 原理
• 胶体金标记技术与蛋白质层析技术相结合的以硝酸
纤维素膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术; • 样品借助毛细作用在层析条上泳动; • 与固相抗原或抗体结合形成复合物被富集或截留; • 目测显色情况，判断结果。
（三）免疫金的制备(P53)
1. 制备原理
• 原理：胶体金与抗原或抗体等大分子的结合。 • 实质：抗原或抗体吸附在胶体金表面。 • 吸附机制：不明确，可能是静电吸附作用。
胶体金表面带负电荷 蛋白质含正电荷的基团 静电吸附作用牢固结合 • 优点：物理吸附，不影响蛋白质的性质。
胶体金溶液pH的调整 确定胶体金与蛋白质的最适反
应比 磁力搅拌下，逐滴加入蛋白质
至胶体金溶液中 加入稳定剂如5%BSA
纯化、鉴定、保存
吸附取决于pH
• 接近蛋白质等电点 或偏碱条件下，胶 体金与蛋白质易形 成牢固结合物；
• 低于等电点，聚集 • 常用0.1mol/L K2CO3、
0.1mol/L HCl调节 • 标记IgG调 pH9.0
加入不同量的柠檬酸三钠即可得不同粒径的胶体金
3. 鉴定和保存
（1）鉴定：粒径大小、粒径均一性，有无凝集颗粒
肉眼观察：观察颜色和浊度，若清亮透明即
良好胶体金，若浑浊或液体表面有漂浮物提 粗
示有凝集颗粒。
略 估
计
分光光度计：测定最大吸收波长（见图）
透射电镜：精确测量胶体金平均粒径。测量
100个以上，计算平均直径和标准差。
基础金核（原子Au）和双离子层 内层：负离子层AuCl2外层：正离子层的H+
•金颗粒间因静电作用互相排斥，成稳定的胶体状 态，形成带负电的疏水胶溶液。
胶体金特性 胶体特性 呈色性和光吸收性 稳定性 聚沉现象
1. 胶体特性 1~100 nm，微小颗粒稳定、均匀、呈 单一分散状态，成胶体金溶液。 对电解质敏感：可破坏胶体金的外周 水化层→胶体金凝聚成大颗粒沉淀。 某些蛋白质分子可稳定胶体金。
金纳米微粒体系的吸收光谱 1. 12 nm; 2.19nm; 3. 24nm; 4. 33nm; 5. 41nm
50 nm
100 nm
金纳米球电镜照片图 A：20nm；C金纳米棒： 51×21nm
王康林.纳米金共振散射相关光谱及其应用,2008
优质
劣质
（2）保存：
• 洁净的玻璃容器；室温避光无灰尘环境中保 存3个月，4℃保存半年。
溶剂膜斥力：金颗粒间有一层厚的溶剂化膜， 反抗金颗粒接近。膜斥力越大，越稳定。
4. 聚沉现象
• 电解质：中和胶体金颗粒的电荷量，使溶剂 层变薄，胶粒间排斥力减少，合并趋势增强。
• 温度：越高，吸附能力减弱，溶剂化程度降 低，不稳定性增加。
• 浓度：越高，粒子间距减少，引力增加。
（二）胶体金的制备
溶液由淡黄色转为灰
快速加入1％柠檬酸三钠，2mL 色，黑色，酒红色 煮沸15min，移除热源，继续搅拌至室温 恢复至原体积。
d=16 nm
胶体金粒径与柠檬酸三钠加入量的关系
胶体金颗粒（nm） 1%柠檬酸三钠(mL)*
16 24.5 41 增大 71
2.00 1.50 1.00 降低 0.70
*100mL，0.01%氯金酸中加入的柠檬酸三钠
被检物：通过抗原抗体反应检测抗原或抗体 结果: 可见的显色结果 类型：侧向横流形式（免疫层析试验）；穿流形式
（免疫渗滤试验）
临床上常用的固相膜免疫技术
胶体金免疫渗滤试验 胶体金免疫层析试验 斑点酶免疫吸附试验 免疫印迹法
胶体金免疫技术
第一节 胶体金免疫技术
colloidal gold immunoassay
1. 制备原理（化学合成法）
氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大 小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。
常用还原剂：柠檬酸三钠、鞣酸、维生素 C、白磷、硼氢化钠等，根据还原剂的强 弱可制备直径为0.8~150 nm不等的胶体金。
2. 常用制备方法
配制0.01％ HAuC14溶液，100mL 搅拌，煮沸
蛋白质的最适标记量
AuNPs
倍比稀释蛋白质
对照
NaCl
混匀，静置数小时
纯化
鉴定
保存
• 除去未标记的蛋 白、未充分标记 的胶体金以及标 记过程中形成的 聚合物；
• 超速离心，凝胶 过滤法。
• 电镜测量颗粒平 均直径；
• 鉴定特异性和敏 感性。
• 含稳定剂缓冲液 配成工作液保存；
• 加50%甘油； • -18℃可保存一年
第十一章 固相膜免疫分析技术
（solid phase membrane-based immunoassy）
固相膜免疫分析技术
以微孔膜为固相载体
微孔膜具有多孔性，像滤纸,可被液体穿过（穿流,渗 滤）；或经毛细管虹吸作用在膜上泳动(侧向横流)
标记物：酶或各种有色离子（彩色乳胶、胶体金或 胶体硒）标记抗体或抗原
1.原理：
以硝酸纤维素膜为载体，以胶体金作为示踪标 记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种标记 免疫测定技术。 2.常用胶体金免疫诊断方法 胶体金免疫金渗滤试验和胶体金免疫层析试验
一、胶体金和免疫金的制备(p46)
（一）胶体金（colloidal gold）
•定义：金盐被还原为金原子后形成的金颗粒悬液 •结构：
2. 呈色性和光吸收性
随颗粒大小改变
颗粒大小不同，呈色不同： （小）2~5 nm 橙黄色；（中）10~20 nm 酒红色；
（较大）30~80 nm紫红色。 光吸收性也不同：
可见光内单一吸收峰，随颗粒大小而变化。 λmaxFra bibliotek10~550nm
肉眼观察胶体金颜色或测定其吸收峰波长的变 化粗略预估胶体金直径大小
不同直径金颗粒的呈色性和光吸收性
胶体金颗粒 （nm）
16 24.5 41 71
胶体金特性
呈色
λmax（nm）
酒红色
518
橙红色
522
红色
525
紫色
535
3. 稳定性
胶粒间的相互吸引力： 距离近，引力大导 致胶体颗粒合并变大。
胶粒与溶剂化层带电情况：各金胶带相同的 电荷，同性电荷相斥，双电层越厚，胶粒带 电量愈大，排斥力越大，越稳定。
以上。
二、胶体金免疫技术的方法学 种类与原理
（p125-p127）
（一）胶体金免疫层析法（GICA）
1. 原理
• 胶体金标记技术与蛋白质层析技术相结合的以硝酸
纤维素膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术; • 样品借助毛细作用在层析条上泳动; • 与固相抗原或抗体结合形成复合物被富集或截留; • 目测显色情况，判断结果。
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临床免疫测定技术课件
Patient
1 2 3 4 5 6 7 8
临床免疫测定技术课件
Titer
64 8
512 <2 32 128 32
4
A（间接法—游离） 抗球蛋白抗 体试验-
commbs
（抗RBC不完 全抗体）
B（直接法—结合）：
临床免疫测定技术课件
(In fluid phase ) 絮状沉淀试验：
环 状 沉 Ag 淀 试 验
2排4孔洗2次 …………… 3排4孔洗3次 8排4孔洗8次 加底物，显色，比色～ 评判原则- 阳性/阴性值保持最大不变的次数
临床免疫测定技术课件
6、显色(Color is appeared)
• 添加酶特异性底物(HRP- TMB/OPD) • 保证底物溶液的有效性(无色、避光、显色) • 反应温度（37℃、室温） • 反应时间（25～30min） • 终止反应（酸溶液-2mol/L sulfate acid） • 及时比色
临床免疫测定技术课件
7、比色
(By the plate reader)
• 加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀 • 测定时，要注意酶标仪的波长是否已调至合适 • 比较好的酶标仪可选择单波长或双波长比色测定
所谓双波长比色，即在敏感波长（此时对所显色 具最大光吸收）如450 nm和非敏感波长（所测得 的光吸收为微孔板上的划痕、污迹以及指纹等所 致），最后从仪器得到的读数为在敏感波长测得 的吸光度与非敏感波长测得的吸光度之差。
例举：临床可能出现的问题及原因
现象：1、相同的标本两次测定的结果不一致 原因：加样/试剂量不准，板孔间有差异
加样过快，孔间发生污染 加错样本 加样/试剂时，落在非包被区 不同批号的试剂混用 温育、洗涤及反应时间不一致 孔内污染杂物 酶标仪滤光片不正确 血清分离不充分，纤维蛋白原或血细胞入孔
免疫分析技术PPT课件
❖ 1971年，Engvall和Perlman首次报道建立酶联免疫吸附试 验（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA）。
❖ 由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优 点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。
第19页，共41页。
（3）酶联免疫分析技术
❖ 基本原理：利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-
第7页，共41页。
第二节 四种常见免疫分析技术
第8页，共41页。
（1）荧光免疫分析技术
❖ 荧光免疫分析技术是标记免疫技术中发展最早的一种，是将
抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合 起来的一种方法。
➢ 1941年，Coons首次采用荧光素进行标记而获得成功。这 种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗 体技术。
❖直接法测定抗体
❖缺点：每检查一种抗体需制备相应的特异抗体。
第21页，共41页。
（3）酶联免疫分析技术
❖间接法测定抗体
❖优点：灵敏度高，在不同抗体的检测中只需应用一种 酶标抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。
第22页，共41页。
（3）酶联免疫分析技术
❖双抗体夹心测定抗原
第23页，共41页。
（3）酶联免疫分析技术
❖ 应用：作为免疫净化柱，适用于复杂样本中痕量农 兽药残留的分离分析。
❖ 步骤：加样→洗涤→洗脱 详见下图
第37页，共41页。
免疫亲和色谱柱示意图
第38页，共41页。
第六节 免疫印迹技术
免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹 (Western blotting)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的 有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基 础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
❖ 由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优 点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。
第19页，共41页。
（3）酶联免疫分析技术
❖ 基本原理：利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-
第7页，共41页。
第二节 四种常见免疫分析技术
第8页，共41页。
（1）荧光免疫分析技术
❖ 荧光免疫分析技术是标记免疫技术中发展最早的一种，是将
抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合 起来的一种方法。
➢ 1941年，Coons首次采用荧光素进行标记而获得成功。这 种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗 体技术。
❖直接法测定抗体
❖缺点：每检查一种抗体需制备相应的特异抗体。
第21页，共41页。
（3）酶联免疫分析技术
❖间接法测定抗体
❖优点：灵敏度高，在不同抗体的检测中只需应用一种 酶标抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。
第22页，共41页。
（3）酶联免疫分析技术
❖双抗体夹心测定抗原
第23页，共41页。
（3）酶联免疫分析技术
❖ 应用：作为免疫净化柱，适用于复杂样本中痕量农 兽药残留的分离分析。
❖ 步骤：加样→洗涤→洗脱 详见下图
第37页，共41页。
免疫亲和色谱柱示意图
第38页，共41页。
第六节 免疫印迹技术
免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹 (Western blotting)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的 有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基 础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
免疫学检测技术PPT课件
单核细胞（monocyte）。 Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细
胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。
41
细胞分离基本原理
不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同
42
不同细胞密度不同
人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量 免疫分析技术。
优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的 高灵敏度。
30
化学发光免疫测定 吖啶酯、鲁米诺 生物发光免疫测定 萤火虫、发光水母
化学发光酶免疫测定 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） 电化学发光免疫测定
37
第三节 免疫细胞功能的检测
38
39
免疫细胞的分离
外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T细胞和B细胞的分离 T细胞亚群的分离
40
(一)外周血单个核细胞分离
外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）包括淋巴细胞和
66
应用与方法学评价：
该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检 测抗体分泌量。 优点：
稳定、特异、抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量； 可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
67
ELISPOT技术简介
酶联免疫斑点试验( Enzyme linked immunospot assay) 80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，
非遗传控制的的意外的细胞 坏死（accidental cell death）
胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。
41
细胞分离基本原理
不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同
42
不同细胞密度不同
人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量 免疫分析技术。
优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的 高灵敏度。
30
化学发光免疫测定 吖啶酯、鲁米诺 生物发光免疫测定 萤火虫、发光水母
化学发光酶免疫测定 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） 电化学发光免疫测定
37
第三节 免疫细胞功能的检测
38
39
免疫细胞的分离
外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T细胞和B细胞的分离 T细胞亚群的分离
40
(一)外周血单个核细胞分离
外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）包括淋巴细胞和
66
应用与方法学评价：
该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检 测抗体分泌量。 优点：
稳定、特异、抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量； 可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
67
ELISPOT技术简介
酶联免疫斑点试验( Enzyme linked immunospot assay) 80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，
非遗传控制的的意外的细胞 坏死（accidental cell death）
固相膜免疫测定详解演示文稿
精密度较差，质控困难 稳定性较差（普通试剂） 不易制备定量、半定量试剂
第19页，共42页。
固相微孔膜测定种类
斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA) 免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA）
斑点ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA)
优质
劣质
第17页，共42页。
胶体金结合物（Conjugate）
第18页，共42页。
第三节 膜载体免疫测定的种类与原 理
膜固相免疫测定的特点
优点 简便，快速 单份测定 保存期长（优质试剂） 可测定物范围广（主要为定性试验）
感染性疾病的诊断 妊娠、排卵的诊断
肿瘤标志 心肌标志 滥用药物
不足之处 敏感度略低，价格略高（与ELISA比）
➢流速：以ml/cm2/min表示 ➢蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示 ➢均一性
第10页，共42页。
固相NC膜
第11页，共42页。
第12页，共42页。
第13页，共42页。
第二节 免疫金标记技术
免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用 了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在 显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处 大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性 或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的 沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）。
S
C
S：测定孔 C：定量质控
第19页，共42页。
固相微孔膜测定种类
斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA) 免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA）
斑点ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA)
优质
劣质
第17页，共42页。
胶体金结合物（Conjugate）
第18页，共42页。
第三节 膜载体免疫测定的种类与原 理
膜固相免疫测定的特点
优点 简便，快速 单份测定 保存期长（优质试剂） 可测定物范围广（主要为定性试验）
感染性疾病的诊断 妊娠、排卵的诊断
肿瘤标志 心肌标志 滥用药物
不足之处 敏感度略低，价格略高（与ELISA比）
➢流速：以ml/cm2/min表示 ➢蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示 ➢均一性
第10页，共42页。
固相NC膜
第11页，共42页。
第12页，共42页。
第13页，共42页。
第二节 免疫金标记技术
免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用 了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在 显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处 大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性 或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的 沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）。
S
C
S：测定孔 C：定量质控
第十二章-固相膜免疫测定PPT课件
30
2021
20
ICA 试剂条
样
结
吸
品
合
NC
水
垫
物
膜
垫
垫
2021
21
ICA——双抗体夹心法测抗原
2021
22
ICA——间接法测抗体
2021
23
ICA 结果观察
阳性 阴性 无效
2021
24
IFA与ICA的比较
试剂形式
试剂保存 操作步骤 观察时间 阳性反应颜色
浓度
IFA
渗滤装置及附 加试剂
4~8℃ 6个月
2021
10
一、胶体金制备
胶体金（colloidal gold）的制备一般采用 还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、
抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度 的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还
原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶
（gold solution）。
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胶体金的制备及特性
（++） 100～200 （+++2）021 >200 mg/L
参考值：30 μg/L 肝癌诊断值：>400 μg/L
结果判定： （-） <30
（+） 30~200 （++） 200~400
（+++） >400 μg/L
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三、斑点酶免疫吸附试验 ——Dot-ELISA
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四、酶联免疫斑点试验 —— ELISPOT
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ELISPOT 分析仪解胞产生的（此斑点具有进 一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没 有 T 细胞研究价值）