第二节 比色法和分光光度计分析法
分光光度法
第二节分光光度法(一)基础知识分类号：P2-O一、填空题1．分光光度法测定样品的基本原理是利用朗伯—比尔定律，根据不同浓度样品溶液对光信号具有不同的，对待测组分进行定量测定。
答案：吸光度(或吸光性，或吸收)2．应用分光光度法测定样品时，校正波长是为了检验波长刻度与实际波长的，并通过适当方法进行修正，以消除因波长刻度的误差引起的光度测定误差。
答案：符合程度3．分光光度法测定样品时，比色皿表面不清洁是造成测量误差的常见原因之一，每当测定有色溶液后，一定要充分洗涤。
可用涮洗，或用浸泡。
注意浸泡时间不宜过长，以防比色皿脱胶损坏。
答案：相应的溶剂(1+3)HNO3二、判断题1．分光光度计可根据使用的波长范围、光路的构造、单色器的结构、扫描的机构分为不同类型的光度计。
( )答案：正确2．应用分光光度法进行试样测定时，由于不同浓度下的测定误差不同，因此选择最适宜的测定浓度可减少测定误差。
一般来说，透光度在20％～65％或吸光值在0.2～0.7之间时，测定误差相对较小。
( )答案：正确3．分光光度法主要应用于测定样品中的常量组分含量。
( )答案：错误正确答案为：分光光度法主要应用于测定样品中的微量组分。
4．应用分光光度法进行样品测定时，同一组比色皿之间的差值应小于测定误差。
( ) 答案：错误正确答案为：测定同一溶液时，同组比色皿之间吸光度相差应小于0.005，否则需进行校正。
5．应用分光光度法进行样品测定时，摩尔吸光系数随比色皿厚度的变化而变化。
( ) 答案：错误正确答案为：摩尔吸光系数与比色皿厚度无关。
三、选择题1．利用分光光度法测定样品时，下列因素中不是产生偏离朗伯—比尔定律的主要原因。
( )A．所用试剂的纯度不够的影响B．非吸收光的影响C．非单色光的影响D．被测组分发生解离、缔合等化学因素答案：A2．分光光度计波长准确度是指单色光最大强度的波长值与波长指示值。
( )A．之和B．之差C．乘积答案：B3．分光光度计吸光度的准确性是反映仪器性能的重要指标，一般常用标准溶液进行吸光度校正。
比色计
第二章 光电比色计第一节 比色分析比色分析是基于溶液对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法，又称吸光光度法。
有色物质溶液的颜色与其浓度有关。
溶液的浓度越大，颜色越深。
利用光学比较溶液颜色的深度，可以测定溶液的浓度。
根据吸收光的波长范围不同以及所使用的仪器精密程度，可分为光电比色法和分光光度法等。
比色分析具有简单、快速、灵敏度高等特点，广泛应用于微量组分的测定。
通常测定含量在6-1～6-4mg/l 的痕量组分。
比色分析如同其他仪器分析一样，也具有相对误差较大（一般为1%～5%）的缺点。
但对于微量组分测定来说，由于绝对误差很小，测定结果也是令人满意的。
在现代仪器分析中，有60%左右采用或部分采用了这种分析方法。
在医学学科中，比色分析也被广泛应用于药物分析、卫生分析、生化分析等方面。
一、朗伯-比尔（Lambert-Beer ）定律溶液颜色的深浅与浓度之间的数量关系可以用朗伯-比耳定律来描述。
当一束平行单色光（只有一种波长的光）照射有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液（图2-1-1）。
设入射光的强度为I 0，溶液的浓度为c ，液层的厚度为b ，透射光强度为I ，则II 0lg =Kcb 式中II 0lg 表示光线透过溶液时被吸收的程度，一般称为吸光度（A ）或消光度（E ）。
因此，上式又可写为：A=Kcb上式为朗伯-比尔定律的数学表示式。
它表示一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。
式中，K 为吸光系数，当溶液浓度c 和液层厚度b 的数值均为1时，A=K ，即吸光系数在数值上等于c 和b 均为1时溶液的吸光度。
对于同一物质和一定波长的入射光而言，它是一个常数。
比色法中常把0I I 称为透光度，用T 表示，透光度和吸光度的关系如下： A ＝II 0lg ＝T 1lg ＝－lg T 当c 以mol·L -1为单位时，吸光系数称为摩尔吸光系数，用ε表示，其单位是L·mol -1·cm -1。
归纳比色分析法.ppt
∴ I0 = Ia＋It 透射光强度It与入射光强度IO之比，称为透光度或透光率，用T 表示。T It
Io
溶液的T愈大，表示溶液对光的吸收愈少；反之亦然。
A lg 1 lg T lg Io
T
It
2．朗伯-比尔定律：
..........
4
从水库取一瓶水，看其颜色与水库中的颜色有什么区别？ 结论：瓶中的颜色浅、水库中的颜色深。
其数学表达式变为： A=εbC
ε的意义：反映有色物质对光线的吸收能力大小，即测定该有 色物质的灵敏度。
三、偏离朗伯-比耳定律的因素：
1.单色光不纯引起的偏离；
2.有色溶液本身引起的偏
A
正误差
离。如其中的有色物质的溶 解性太少而呈现固体(介质不 均匀)，或者是有色物质易于 分解(化学反应)、存在形式发 生变化等。
2.当显色剂无色时，待测试液中存在其他有色离子→用不加 显色剂的试液；
3.如显色剂和试液均有色→试剂空白(不加试样)。
三、吸光度范围的选择：
✓ T=0.368、 A=0.434， 测量的相对误差最小
✓ T=15％～65％ A＝0.2～0.8 时测量的相对误差≤2% 控制方法：(1)计算并且控制试样的称出量，含量高→少取样或稀释
出△C，则被测物浓度C被测=C标+ △C。
四、双波长法：适用于多组分的同时测定
⑴ 若各组分的吸收曲线互不重叠，则可在各自最大吸收波长
处分别进行测定。这本质上与单.组.......分.. 测定没有区别。
15
⑵ 若各组分的吸收曲线互有重叠，则可根据吸光度的加合性求 解联立方程组得出各组分的含量。
Aλ1= εaλ1bCa＋εbλ1bCb Aλ2= εaλ2bCa＋εbλ2bCb
分光光度法
原子发射光谱法 (atomic emission photometry) 分子发光分析法
II. 可见-紫外分光光度法
一、概述
1、定义：
利用物质的分子或离子对某一波长范围 的光的吸收作用，对物质进行定性、定量 及结构分析的方法
3、所用仪器： 分光光度计(spectrophotometer)
（1）主要部件：
信
光 源
单
吸
检
色
收
测
器
池
器
号 显 示 系
统
（2）使用： 1．开电源开关，打开箱盖，预热10min
2．将空白管、对照管、测定管分别装入 比色皿(3/4vol),并用吸水纸擦干光面外壁
3．选定波长
4．打开箱盖(光路开关自动关闭)，用空 白管调T=0
5. 盖上箱盖(光路开关自动打开)，再用空 白管调T=100%(若调不到，则可调节灵敏 度开关)
6．将选择开关旋至A,此时显示数值应为0， 否则调节“消光零”旋钮调至0
7．逐步拉出试样架拉手，读取各管吸光度 值A
8．全部测定结束后，取出比色皿(洗净)， 关闭开关
4、比色法的定量方法：
①标准曲线法: 将一系列浓度不同的标准溶液按照一定
选择吸收
----组成物质的分子仅吸收与其内能变化 (基态与激发态能量差)相对应的波长或 频率的光，所得到的光谱称为吸收光谱
能量释放
----处于较高能态的分子(激发态分子)不稳 定，当其返回基态时，以热或发射光谱的 形式将能量释放出来。所发射出的相应光 谱，称分子发射光谱
激发态 发 射 光 谱
E1 吸 收 光 谱
第十章 分光光度法
注：溶液的透光率T反映了物质对光的吸收程度， T越大表示它对光的吸收越弱；反之，T越小，表 示对光的吸收越强。
T 取值为0.0 % ~ 100.0 %
T
全部吸收
T = 0.0 %
全部透射 T = 100.0 %
2.吸光度： 为透光率的负 A lg I0 lg 1 ＝ lgT
（四）吸光系数 1．定义（物理意义）
一定条件下，吸光物质在单位浓度及单位液层 厚度时的吸光度，叫这个物质的吸光系数。
2．两种表示方法
(1) 摩尔吸光系数( ε )：表示一定波长下，吸光物质的溶液
浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。
(2)百分吸光系数(
E1% 1cm
)：表示一定波长下，吸光物质的溶
黄 橙
红
/nm 颜色 400-450 紫
450-480 蓝 480-490 青蓝 490-500 青 500-560 绿 580-610 黄 610-650 橙 650-760 红
互补光 绿
黄 橙 红 紫 蓝 青蓝 青
物质的颜色与光的关系：
完全吸收
光谱示意 复合光
表观现象示意
完全透过
吸收黄色光
二.物质对光的选择性吸收
A. A~λ曲线
B. A~c曲线
C. A~V曲线
D. E~V曲线
4、紫外分光光度法中，为了使测定结果有较高 的灵敏度和准确度，入射光的波长应（ ）
A．最大吸收波长
B．最小吸收波长
检测器 作用：将光信号转换为电信号，并放大 光电管，光电倍增管
信号输出 表头、记录仪、屏幕、数字显示
第十章
1 光源
在紫外可见分光光度计中，常用的光源 有两类：热辐射光源和气体放电光源 热辐射光源适用350nm-800nm，用于可见 光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源适 用150nm-400nm，用于紫外光区，如氢灯 和氘灯。
分光光度法
光度法的优点
与目视比色法相比，光度法的优点： 1. 用光电仪器进行测量可消除轻度色盲、眼睛 疲劳等主观误差。 2. 有其他物质共存时，可选适当的入射光和参 比溶液来消除干扰，提高选择性。 3. 对于大批试样分析，校正曲线可简化手续， 提高分析速度。
2.3.2.测量条件的选择(1)
（1）选择合适的入射光 由于溶液对光的吸收是有选择性的，因此 必须选择溶液吸收最大的波长作为入射光的波 长。 （2）控制适当的吸光度范围 用光度计测量吸光度，都存在着误差。当 测量小于0.2和大于0.7吸光度时，误差会迅速 增加。为了使测量误差落在0.2～0.7之间，可 以控制试样的称取量。对于组分含量高的试样， 可减少称取量，或是稀释;对于含量低的溶液 可增加称样量或浓缩的方法来提高浓度。
图2－8 721分光光度计的光学系统
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（三）
图2－9 7530G紫外—可见光分光光度计
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（四）
图2－10 7530G紫外-可见分光光度计光学系统
检测器和读数装置 （2）
2. 光电管. 是一个二极真空管由一个阳极和一个光敏阴 极组成。 3. 光电倍增管。 是利用光敏阴极把光信号放大的装置。 4. 读数装置。 读数装置常用的是微安计或检流计。
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（一）
图2－7 721分光光度计
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（二）
2.分光光度法 2.分光光度法
光度可用光电比色计或分光光度计进 行测量。 测定时常用的是校正曲线法或比较法。
（1）校正曲线法
校正曲线法，又称工作曲线或标准曲线法。 当溶液厚度b固定时，吸光度A与溶液浓度c成 正比.取一系列不同浓度标准溶液（5－7图）， 分别测定其吸光度，以浓度c为横坐标，吸光 度为纵坐标，作校正曲线.试液用同样条件显 色，测定吸光度，从曲线上求得试液浓度。
执业药师《药物分析学》备考：分光光度法
执业药师《药物分析学》备考：分光光度法2017年执业药师《药物分析学》备考：分光光度法不放过每一个知识点，尤其对容易混淆的东西要下更大工夫搞清楚，基础要牢固，店铺为大家整理了2017年执业药师《药物分析学》备考：分光光度法，希望对你有所帮助!第一节可见—紫外分光光度法掌握可见--紫外分光光度法的基本原理和测定方法。
掌握可见—紫外分光光度法在药物鉴别、检查和含量测定中的应用。
熟悉仪器的校正和检定方法;紫外吸收光谱与物质结构的关系。
了解紫外分光光度计的基本结构。
一、基本原理波长200～400nm范围称为紫外光区，400～760nm称为可见光区。
物质吸收紫外和可见光区电磁波而产生的吸收光谱称为紫外-可见吸收光谱。
1.光源：紫外光区通常采用氢灯或氘灯，可见光区采用钨灯。
2.吸收池：玻璃池适用于370nm以上的可见光区，石英池适用于紫外、可见光区，通常仅在紫外光区使用。
三、紫外吸收光谱与物质结构的关系：紫外—可见吸收光谱属分子吸收光谱，是由分子的外层价电子跃迁产生的，也称电子光谱。
它与原子光谱的窄吸收带不同。
每种电子能级的跃迁会伴随若干振动和转动能级的跃迁，使分子光谱呈现比原子光谱复杂得多的宽带吸收。
当分子吸收紫外—可见区的辐射后，产生价电子跃迁。
这种跃迁有三种形式：(1)形成单键的σ电子跃迁。
(2)形成双键的π电子跃迁。
(3)未成键的n电子跃迁。
通常，未成键的孤对电子较易激发，成键电子中π电子较相应的σ电子具有较高的.能量，反键电子则相反。
故简单分子中n→π* 跃迁需能量最小，吸收带出现在长波方向;n→σ*及n→π* 跃迁的吸收带出现在较短波段;σ→σ*跃迁吸收带则出现在远紫外区。
例题：物质分子吸收紫外光后，电子跃迁的类型为：A. n→σ* B. n→π* C. π→π* D. σ→σ* E .σ→π* 答案ABCD四、吸收度的测定方法1.对溶剂的要求：能充分溶解样品，与样品无相互作用，挥发性小，在测定波长处的吸收要符合要求。
分光光度分析法(精)
c0 空白 Blank
标 准 曲 线
A
c1
c2
c3
c4
标准溶液
Standard Sample
0.8
cx
待测溶液 Sample
0.6 Ax
0.4
0.2
0
cx
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
c (mmol/L)
5、 紫外—可见分光光度计
a、目视比色法 用眼睛比较溶液颜色的深浅以确定物质浓度的方
法称为目视比色法。 特点：设备简单、操作简便；无需单色光；准确度不 高。 b、分光光度计
日光：紫 蓝 青 绿 黄 橙 红
复合光：由各种单色光组成的光。如白光(太阳光)
单色光：只具有一种波长的光。 要求：=2nm。
互补色光：如果把两种适当颜色的光按一定的强度比 例混合也可以得到白光，这两种光就叫互补色光。
物质的颜色是由于物质对不同波长的光具有选择性的 吸收作用而产生的。如：CuSO4呈兰色。 物质呈现的颜色和吸收的光颜色之间是互补关系。
c. 样品室
样品室放置各种类型的吸收池（ 比色皿）和相应的池架附件。 吸收池主要有石英池和玻璃池两 种。
d. 检测器
利用光电效应将透过吸收池的光信 号变成可测的电信号，常用的有光 电池、光电管或光电倍增管。
e. 结果显示记录系统
检流计、数字显示、微机进行仪 器自动控制和结果处理
6、 显色与测量条件的选择
500
550
600
650
波长（nm）
吸收曲线
吸收曲线清楚地描述了物质对光的吸收情况。
（1）不同物质吸收曲线的形状和吸收波长不同。
531
MnO4-
分光光度分析法
重庆大学化学化工学院
耐劳苦 尚俭朴 勤学业 爱国家
2015年1月30日
在可见光，KMnO4溶液对波 长525 nm附近绿色光的吸收 最强，而对紫色和红色的吸 收很弱。λmax=525 nm。 浓度不同时，光吸收曲线形 状相同，λmax不变，吸光度不 同。
重庆大学化学化工学院
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2015年1月30日
* 单色器 单色器的作用是将光源发出的连续光谱分解为单色光 的装臵。分为棱镜和光栅。 * 比色皿也称吸收池或样品池。用于盛放试液的容器。 它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、厚度相 等的玻璃或石英制成，按其厚度分为 0.5cm ， lcm ， 2cm，3cm和5cm。 使用比色皿时应注意保持清洁、透明，避免磨损透 光面。 紫外光只能用石英比色皿； 可见光可用石英或玻璃比色皿。
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2015年1月30日
12.3.2 标准曲线法 借助分光光度计来测量一系列标准溶液的吸光度，绘制 标准曲线，根据被测试液的吸光度，从标准曲线上求得被 测物质的浓度或含量。
A
标液 A
1 C1 A1
2 C2 A2
3 4 5 C3 C4 C5 A3 A4 A5
2015年1月30日
12.3 光度分析的方法和仪器 12.3.1 目视比色法 用眼睛观察、从管口垂直向下观察（比色管），比较待 测溶液和标准溶液颜色的深浅，以确定物质含量的方法。
优点是仪器简单，操作简便，适宜 于大批试样的分析。灵敏度高，因为 是在复合光-白光下进行测定，故某 些显色反应不符合朗伯-比尔定律时， 仍可用该法进行测定。 主要缺点是准确度不高，标准系列 不能久存，需要在测定时临时配制。
比色分析的基本原理
第一节比色分析的基本原理比色分析是基于溶液对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法，又称吸光光度法。
有色物质溶液的颜色与其浓度有关。
溶液的浓度越人，颜色越深。
利用光学比较溶液颜色的深度，可以测定溶液的浓度。
根据吸收光的波长范闱不同以及所使用的仪器精密程度，可分为光电比色法和分光光度法等。
比色分析具有简单、快速、灵敏度高等特点，广泛应用于微量组分的测定。
通常中测定含量在i（r〜lO-'mg/L的痕量组分。
比色分析如同其他仪器分析一样，也具有相对误差较人（一般为1%〜5%）的缺点。
但对于微量组分测定来说，由于绝对误差很小，测定结果也是令人满意的。
在现代仪器分析中，有60%左右采用或部分采用了这种分析方法。
在医学学科中，比色分析也被广泛应用于药物分析、卫生分析、生化分析等方面。
一、物质的颜色和光的关系光是一种电磁波。
自然是由不同波长（400〜700nm）的电磁波按一定比例组成的混合光，通过棱镜可分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种颜色相连续的可见光谱。
如把两种光以适当比例混合而产生白光感觉时，则这两种光的颜色互为补色。
例如绿与紫、黄与蓝互为补色。
当白光通过溶液时，如果溶液对各种波长的光都不吸收，溶液就没有颜色。
如果溶液吸收了其中一部分波长的光，则溶液就呈现透过溶液后剩余部分光的颜色。
例如，我们看到KMnO4溶液在白光卞呈紫红色, 就是因为白光透过溶液时，绿色光大部分被吸收，而其他各色都能透过。
在透过的光中除紫红色外都能两两互补成白色，所以KMnOl溶液呈现紫红色。
同理，CuS04溶液能吸收黄色光，所以溶液呈蓝色。
由此可见，有色溶液的颜色是被吸收光颜色的补色。
吸收越多，则补色的颜色越深。
比较溶液颜色的深度，实质上就是比较溶液对它所吸收光的吸收程度。
表1-1列出了溶液的颜色与吸收光颜色的关系。
表1-1溶液的颜色与吸收光颜色的关系溶液颜色绿黄橙红紫红紫蓝青蓝青吸颜色紫蓝青蓝青青绿绿黄橙红收光波长/ nin400〜450450〜480480〜490490〜500500〜560560〜580580〜600600〜650650〜760二、朗伯-比尔（Lambert"Beer）定律当一束平行单色光（只有一种波长的光）照射有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液（图1-1） °图1-1光吸收示意图设入射光的强度为I。