2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（一）筛选菌株
3、选择培养基
根据微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不
同，配制的允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他
种类微生物生长的培养基。
本课题使用的选择培养基
物理特性：固体培养基 功能特性：选择培养基
例：用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应 稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是
(D )
A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和261，取平均值238
C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平 均值163
【解析】稀释倍数为106，0.1 mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每 毫升样品中菌落数就为234/0.1×106=2.34×109。
（二）统计菌落数目
2.间接计数法→活菌计数法
（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一 个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
（2）常用Байду номын сангаас法：稀释涂布平板法。
葡萄糖
10.0g
不缺能乏分氮解源尿的素培，养缺基乏—氮—源分而离不固能氮生微长生物
尿素 琼脂
1.0g 15.0g
发在育无繁氧殖条，件而下受的到普抑通制培，养所基以—用—此分培离厌氧型将和上兼述性物质厌溶氧解型后微，用生蒸物馏水
养基就能够选择出分解尿素的微生物。
定容到1000mL。
例：下列能筛选出分解尿素的细菌的培养基是( A )
但A同学认为自己选用土壤样品不同导致结果不同，但是A同学没 有设计对照，拿不出让同学信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同 学排除上述两个可能影响因素吗？
方案1：其他同学用与A同学一样的土样进行实验。如果结果与A同 学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或 培养基的配制有问题。
缺点 ✓不能区分死菌与活菌； ✓不适于对运动细菌的计数； ✓个体小的细菌在显微镜下难以观察；
（二）统计菌落数目
2.间接计数法→活菌计数法 （1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一
个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
（2）常用方法：稀释涂布平板法。
（二）统计菌落数目 2.间接计数法→活菌计数法
计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较
大表明试验不精确，需要重新实验。
土壤取样 ↓
制备培养基 ↓
样品稀释、取样涂布 ↓
微生物的培养、观察、记录 ↓
目的菌的计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在 30~300的平板进行计数。在同一稀释 度下，至少对3个平板进行重复计数， 然后求出平均值，并根据平板所对应 的稀释度计算出样品中目的菌的数目。
充分摇匀，吸↓取上清液 1mL，转移制至备盛培有养基9mL水的 无释菌至试1样0管7品稀稀中释释，度↓ ↓、依，取次并样等涂按比布照稀由 10微7至生1物03的稀培释养度、的观顺察序、记分录 别吸取0.1mL进↓行平板涂
布操作。目按的照菌浓的计度数从低到
高的顺序涂布平板，不必
更换移液管。
注意：实验时要对培养皿作好标记。注明培
（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一 个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
（2）常用方法：稀释涂布平板法。
【例1】某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平 均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的
B 体积为0.1 mL）（ ） A.2.34×108 .2.34×109 C.234 D.23.4
鉴别培养基：酚红培养基
原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚 红变红→脲酶阳性
制备培养基 ↓
样品稀释、取样涂布 ↓
微生物的培养、观察、记录
1. 在菌落计数时，每隔24h统计一次 菌落数目。
2. 选取菌落数目稳定时的记录作为结 果，以防止因培养时间不足而导致 遗漏菌落的数目。
↓
目的注菌意的：计如数果得到了2个或2个以上菌落数目在30—300的
平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的
样品稀释、取样涂布 ↓
微生物的培养、观察、记录 ↓
目的菌的计数
土壤取样 ↓
制备培养基 ↓
样品稀释、取样涂布 ↓
微生物的培养、观察、记录 ↓
目的菌的计数
1. 从肥沃、湿润的土壤中取样(绝大多 数细菌分布在距表层土3—8cm土壤 层) ，故先铲去表层土，再取样。
2. 取土样的小铁铲和盛土样的信封在 使用前都要灭菌。
际数( × )
(3)统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进
行统计( × )
(4)利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数
( ×) (5)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量( × )
(6)培养分解尿素的细菌，培养基的pH值会增大( √ )
土壤取样 ↓
制备培养基 ↓
土壤取样 ↓
制备培养基 ↓
样品稀释、取样涂布 ↓
微生物的培养、观察、记录 ↓
目的菌的计数
土壤取样 ↓
制备培养基 ↓
样品稀释、取样涂布 ↓
微生物的培养、观察、记录 ↓
目的菌的计数
1. 细菌：30～37℃；1～2d 2. 霉菌：25～28℃；3～4d 3. 放线菌：25～28℃；5～7d
土壤取样
↓
②计数原则：一般选择菌落数在30—300（50个左右为最佳） 的平板上进行计数（取平均值）
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低（缺点）
例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学 从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学 在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学结果有 问题，可能是A同学培养基被杂菌污染，或者培养基混入其他含氮物质 ，导致其他杂菌生长。
1. 取样的稀释度越高，选择培养基上的菌落越少； 2. 空白对照的选择培养基上没有菌落； 3. 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落普遍更多。
思考：能在选择培养基上生长的肯定是所筛选的目的微生物吗？
原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上， 微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生 物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定 都是所需的微生物，还需要进一步的验证
方案2：将A同学配制的培养基在不加土样或是直接涂布无菌水情 况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
（三）设置对照
目的：排除实验组中非测试因素（无关变量）对实验结果的影 响，提高实验结果的可信度。
判一判
(1)筛选分解尿素的细菌的培养基以尿素为唯一氮源，且为固体培养基
(√ )
(2)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实
A．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水 B．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、水 C．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、水 D．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板），不具说服力 乙：A组结果误差过大，可能操作有误，需重新涂布培养计 数，计算平均值
（二）统计菌落数目
2.间接计数法→活菌计数法 （4）注意：
①设置重复组：在设计实验时，每个稀释液一定要涂布至少3个 平板，作为重复组，避免实验过程中偶然因素对实验结果的干 扰，增强实验的说服力与准确性。
4、课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
（一）筛选菌株
1.实例：PCR技术：一种在体外将少量DNA大量复制的技术。 此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
提出的问题——如何寻找耐高温的DNA聚合酶？
解决问题的思路——寻找耐高温环境。 原因：高温条件淘汰了绝大多数微生物。
在水中形成NH4+；土壤里的
2、细菌利用尿素的原因
微生物(如硝化细菌)把NH3
土壤中的细菌分解尿素是因
氧化为NO3-，然后以NO3-的 形式被植物吸收。
为它们能合成脲酶
CO(NH2)2 +H2O 脲酶 NH3 +CO2
3、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、
棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能 分解尿素。
养基类型、培养日期、稀释度等。
土壤取样 ↓
制备培养基 ↓
样品稀释、取样涂布 ↓
微生物的培养、观察、记录 ↓
目的菌的计数
1. 稀释原因：样品稀释程度直接影响平板 上生长的菌落数目。
2. 稀释标准：保证获得菌落数在30～300 之间、适于计数的平板
3. 稀释倍数的选取：测细菌数（104、105、 106稀释液）、测放线菌（103、104、 105稀释液）、测真菌数（一般用102、 103、104稀释液）
华师附中汕尾学校 杨宇涛
尿素是一种重要的农业氮肥，分子式为H2NCONH2（碳酰二胺、 脲），不能直接被农作物吸收。
1、尿素的利用
尿素是一种重要的农业氮肥NH。3不尿能素直接不吸能收直，接植被物吸
农作物吸收。土壤中的细菌将尿收素其中分的解N成是以氨N之H4后+和才NO3-形
能被植物利用。
式吸收的。NH3的水溶性高，
（二）统计菌落数目 1.直接计数法→显微计数法/红细胞计数法 利用血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物 的数量。
计算：每毫升原液所含细 菌数=每小格平均细菌数 ×400×10000×稀释倍数
专题2课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
➢实验目的 从土壤中分离分解尿素的细菌并计数
培养基中以尿素为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生
➢实验原理 物才能分解尿素，缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿
素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所 以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
➢实验材料 小铁铲、培养皿、试管、移液管、锥形瓶等
（二）制备培养基 实验组：制备选择培养基 （尿素为唯一氮源的培养基）
筛选出能够分解尿 素的细菌
对照组：制备完全培养基 （牛肉膏蛋白胨培养基）
与选择培养基做对照， 检测选择培养基是否具 有选择作用
➢实验步骤——【3】样品稀释与涂布
判断选择培养基是否 具有筛选作用
选择培养基 完全培养基
➢实验步骤——【3】样品稀释与涂布
（3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液
第一次做该实验时，可以将稀释的范围放宽一点，如可 以将103 ~ 107分别涂布到平板上培养。保证获得菌落数 在30～300之间、适于计数的平板
➢4】微生物的培养与观察
培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。
➢实验步骤 实验结果
实验流程：
土壤取样 制备培养基 样品稀释涂布平板 微生物的培养与观察
菌落计数
（一）土壤取样 从富含有机物、潮湿、酸碱度适中的土壤中取样。铲 去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的
信封中。 铁铲和信封都要灭菌
“微生物的天然培养基”
数量最大、种类最多
大约70%—90%是细菌 细菌适宜在富含有机质，酸碱度接近中性的潮湿土壤 中生长，绝大多数分布在约3~8cm的土壤层。
选1.2.2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
×400×10000×稀释倍数
(3)缺点：不能区分死菌与活菌；
不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；
2.统计菌落数目——间接计数法（活菌计数法）
例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品 中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得 到以下两种统计结果。
计数池
1 2 3 实物图
∆ 计数板是一种 专门用于计算
较大单细胞微
4 5 6 正面图
计数生室物的一种仪 器。
滴液•每处块计数板由H形凹槽分为2个同
样的计数池。 •每个计数池分为9个大方格。
∆ 计数时，常采
7 8 9 侧面图 1m用m样方法。
计数室（中间大方格）的长和宽各为1mm，深度为0.1mm，
其体积为______mm03 .，1合____________1m×L。10-4
选择性
（二）菌株计数
1、显微镜直接计数：
(1)方法 利用特定细菌计数板或 血球计数板,在显微镜 下计算一定容积的样品 中微生物的数量.
计数板是一块特制的载玻片,上面有一个特定的面积为 1 mm2和高为0.1 mm的计数室,在1 mm2的面积里又被划分 成25个(或16个)中格,每个中格进一步划分成16个(或25 个)小格,但计数室都是由400个小格组成的。
A.CO2和N2
B.葡萄糖和NH3
C.CO2和尿素
D.葡萄糖和尿素
3.下列说法不正确的是（ B ）
A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚 合酶。 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、 M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值。 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因 素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验方案
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验方案尿素是一种含氮有机化合物，广泛用作化肥和动物饲料。
土壤中的细菌可以通过分解尿素来获取氮元素，从而促进土壤微生物群落的生长和发展。
为了研究土壤中分解尿素的微生物群落，可以进行以下实验：
1.采集土壤样品，将其通过蒸馏水过滤器过滤，以去除大颗粒物和悬浮物。
2.将过滤后的土壤样品接种到含有尿素的培养基中，利用不同的培养条件(如温度、pH值、氧气含量等)筛选出适宜于生长的细菌。
3.将筛选出的细菌进行单一克隆培养，然后通过染色、显微镜观察和生化测试等方法对其进行鉴定和分类。
4.最后，可以利用计数板等设备对土壤中分解尿素的细菌进行计数。
实验步骤：
1.收集土壤样品，通过蒸馏水过滤器过滤。
2.制备含尿素的培养基，分别设置不同的培养条件，如温度、pH 值、氧气含量等。
3.将过滤后的土壤样品接种到培养基中，进行培养。
4.观察培养基中是否有细菌生长，记录细菌的数量和形态特征。
5.对生长的细菌进行单一克隆培养，然后进行鉴定和分类。
6.利用计数板等设备对土壤中分解尿素的细菌进行计数。
实验注意事项：
1.在实验过程中要注意卫生，避免污染。
2.制备培养基时要严格按照配方和操作步骤进行。
3.培养时要控制好温度、pH值、氧气含量等条件，以便筛选出适宜于生长的细菌。
4.鉴定和分类时要准确和细致，避免误判。
5.计数时要进行多次重复，以提高结果的精度和可靠性。
实验03土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
专题03土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、实验原理：（1）土壤中的细菌之所以能分解尿素是因为它们能合成尿酶。
（2）配置以尿素为唯一氮源的培养基，能够在这个培养基上生长的细菌就是能分解尿素的细菌。
二、操作步骤：(1)土壤取样①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。
②取样部位：距地表约3～8 cm的土壤层。
(2)样品的稀释测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验时可以将稀释的范围放宽一点。
(3)微生物的培养与观察①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。
细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。
②观察a．观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
b．记录菌落的特征：包括菌落的形状、大小和颜色等。
2、灭菌培养基：高压蒸汽灭菌法3、培养皿灭菌：干热灭菌法三、操作提示(1)无菌操作①取土样的用具在使用前都需要灭菌。
②实验操作均应在酒精灯火焰旁进行。
(2)做好标记：本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，最好在使用前做好标记。
例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数操作中需注意的问题(1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
(2)恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。
(3)为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组，目的是排除实验中偶然因素对实验结果的影响。
(4)分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
(5)为防止培养时间不足导致菌落遗漏，在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
土壤中分离尿素的细菌的分离和计数流程
土壤中分离尿素的细菌的分离和计数流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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专题2-课题2-土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
㈢.设置对照：控制变量
设置对照的主要目的是排除实验组 中非测试因素对实验结果的影响，提高 实验结果的可信度。
设置对照的方法：
空白对照：不给对照组任何处理因素。 条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是
所要研究的处理因素。 自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。 相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。
课题背景
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被 农作物吸收。
问：1 尿素如何被利用的呢？ 土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。
2 细菌为什么能分解尿素？ 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶
CO(NH2)2 +H2O 脲酶 CO2 + 2NH3
3、常见的分解尿素的微生物
芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、 棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌 也能分解尿素。
原因：⑴土样不同⑵培养基污染或操作失误 (或者是混入了其他的含氮物质)
方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验
结果预测： a.如果结果与A同学一致，则证明A无误； b.如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培 养基的配制有问题。 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情 况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是 否受到污染。
练习：判断正误：
1、根据培养皿中菌落数可以准确计算样品中含有
的活菌实际数目（× ） 2、只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素（√ ）
3、筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的
唯一氮源（√ ）
4、统计样品中的活菌一般用平板划线法（× ）
【巩固1】 分离土壤中分解尿素的细菌，对培养 基的要求是( C )。 ①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不 加硝酸盐 A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧ C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、理论基础1．筛选菌株(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时或其他微生物生长。
(2)选择培养基：在微生物学中，将允许种类的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
（3）配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。
例如，培养基中不加入有机物可以选择培养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养；的微生物.加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。
2．统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有和。
（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在的平板进行计数。
此外，测定微生物数量的常用方法还有直接计数。
3．设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中对实验结果的影响，提高实验结果的。
例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养的培养基作为空白对照。
二、实验设计关于土壤中某样品细菌的分离与计数实验操作步骤如下：1．取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。
应先 3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的中。
2．制备：准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基，将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
3．微生物的与观察将10g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中(体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液，转移至盛有的生理盐水的无菌大试管中，将土样以1、101、102…… 依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取进行平板涂布操作。
每个稀释度下需要3个选择培养基、1个牛肉膏蛋白胨培养基。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课件
①为了保证结果准确，每个稀释度，一般设置___3___个平板，选择菌落数在__3_0_—__3_0_0_的平板进
行计数，并取__平__均__值___。 ②统计的菌落数往往比活菌的实际数目____低_____。原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板
上观察到的只是___1___个菌落。因此，统计结果一般用___菌__落__数__而不是用__活__菌__数___来表示。
V：代表____涂__布__平__板__时__所__用______ 的稀释液体积
M：_____稀__释__倍_数________
（2）计算公式：
_1__g土中的菌株数 =（C÷V）× M
C：代表__某__一__稀__释__度__下__平__板__上__生__长的平均菌落数 V：代表__涂__布__平__板__时__所__用__的__稀__释__液体积 M：___稀__释__倍__数_________
4ⅹ104 4ⅹ103
4ⅹ105
1mL
1mL
1mL
1mL
4ⅹ107
4ⅹ107
102
103
104
105
106
101
9mL无菌水
10g土样 90mL
无菌水
38
40
42
样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图
（2）计算公式：
_1__g土中的菌株数 =（C÷V）× M
C：代表___某__一__稀__释__度__下__平__板__上___ 生长的平均菌落数
4ⅹ104 4ⅹ103
4ⅹ105
1mL
1mL
1mL
1mL
4ⅹ107
4ⅹ107
102
103
104