大鼠体内外细胞色素P450酶活性检测方法的建立及应用
cyp450 诱导 检测 原理
cyp450 诱导检测原理摘要：1.CYP450 简介2.CYP450 诱导的原理3.CYP450 诱导的检测方法4.CYP450 诱导在药物研发和个体化治疗中的应用正文：一、CYP450 简介CYP450，全称为细胞色素P450 酶系，是一组参与生物体内外源性物质代谢的酶。
它们主要存在于肝脏、肺、肠道等组织，对许多药物、致癌物质、激素等具有生物转化作用。
CYP450 酶系在药物代谢、解毒、生物活性物质生成等多个方面具有重要意义。
二、CYP450 诱导的原理CYP450 诱导是指通过某种物质的作用，使CYP450 酶系的活性增强，从而加速药物或其他外源性物质的代谢。
这种诱导作用可以通过两种途径实现：一是诱导CYP450 酶基因的表达，使酶的量增加；二是增强已存在的CYP450 酶的活性。
三、CYP450 诱导的检测方法CYP450 诱导的检测通常采用体外实验和体内实验两种方法。
1.体外实验：主要通过检测CYP450 酶活性的变化，常用的方法有对硝基苯-4-羟酸酯酶测定法、7-羟基-4-三氟甲基香豆素酶测定法等。
2.体内实验：主要通过检测药物在体内的代谢速率，常用的方法有血药浓度监测法、尿药排泄监测法等。
四、CYP450 诱导在药物研发和个体化治疗中的应用CYP450 诱导在药物研发和个体化治疗中具有重要作用。
通过研究药物对CYP450 酶系的诱导作用，可以优化药物的剂量、给药间隔等用药方案，以提高疗效、减少不良反应。
此外，对于患者来说，根据其CYP450 酶系的诱导情况，可以选择更适合的药物和治疗方案，实现个体化治疗。
总之，CYP450 诱导在药物代谢、药物研发和个体化治疗等方面具有重要意义。
细胞色素P450酶族的生理学作用
细胞色素P450酶族的生理学作用细胞色素P450酶（Cytochrome P450, CYP）是一类广泛存在于细胞中的酶，它们对药物、环境化学物质和内源性化合物等具有重要的代谢作用。
CYP家族可分类为CYP1、CYP2、CYP3等数个亚家族，每个亚家族又有多种不同的同工酶，它们的基因都分布在人类染色体上，但在不同亚家族和同工酶之间存在差异。
细胞色素P450酶作为代谢酶兼很重要的代谢途径，其生理学作用不可忽视。
细胞色素P450酶家族有着广泛的生理功能，其中最主要的作用是药物代谢。
药物在体内的大部分都是通过CYP家族代谢，从而发挥药效或被清除出体外。
人体内的CYP家族同工酶可代谢约70%的药物，药物代谢的主要途径是在肝脏内进行的。
CYP家族的活性对药物在体内的疗效和药物代谢的速率有很大的影响，CYP酶的活性水平受到基因、环境、药物相互作用等多种因素的影响。
因此，药物的影响和代谢速率会因个体差异而产生变化。
除药物代谢外，细胞色素P450酶还对内源性物质进行代谢、调节胆固醇代谢、酸碱平衡调节等具有非常重要的生理作用。
细胞色素P450酶参与调节胆固醇代谢的过程中，CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1等酶参与胆汁酸合成与代谢的过程，对身体进行调节。
CYP酶还可代谢内源性物质如玉米饲料、激素、脂肪酸、谷氨酰胺、维生素等，并参与酸碱平衡的调节。
细胞色素P450在生物体内的代谢过程中，常常与其他代谢途径如UGT、SULT、GST等进行配合，共同完成生理代谢的功能。
这种相互作用称为代谢通路。
一般情况下，药物的主要代谢通路都是CYP酶，其中酶的种类和活性的水平将决定药物在体内的代谢速度和代谢产物。
针对药物的代谢通路进行优化，可提高药物安全性和效果性。
CYP酶的活性水平与药物代谢和药物作用有很大的关系。
以CYP2E1酶代谢乙醇为例，过多的乙醇代谢会导致身体内ATP含量下降、自由基生成等副作用。
CYP2D6对药物代谢也有很大的影响，CYP2D6酶活性低下可导致药物代谢不完全、临床副作用等问题。
细胞色素P450酶的结构和催化机理研究
细胞色素P450酶的结构和催化机理研究细胞色素P450酶（Cytochrome P450）是一类存在于多种生物体中的酶，参与着对外部物质的代谢和内源性代谢产物的合成，它们对各种化学物的选择性催化能使生物体在不同的环境下快速地适应。
因此，了解细胞色素P450酶的结构和催化机理对于药物研发和环境保护具有极为重要的意义。
一、细胞色素P450酶的结构在蛋白质的结构上，细胞色素P450酶主要由两个结构域组成，即催化结构域和电子传递结构域。
催化结构域由大约500个氨基酸残基组成，有一个铁血红素分子埋没其中。
电子传递结构域则由另一个蛋白质组成，负责将电子传输到铁血红素上。
在酶进化中，细胞色素P450酶的结构和序列高度保守，不同物种的细胞色素P450酶之间的结构和序列也有一定程度的异同。
此外，与其他蛋白质一样，细胞色素P450酶的结构也容易受到物理、化学和生物学因素的影响，这也是研究催化机理的重要前提。
二、细胞色素P450酶的催化机理细胞色素P450酶的催化活性主要通过铁血红素分子的催化效应来实现。
具体来说，如果一个电子从电子传递结构域流过来，那么铁血红素就会从其氧化状态转变为还原状态，进而促使氧原子和铁离子形成一个暂时的氧化态。
在接下来的催化过程中，物质的接触和反应将会形成其他氧化态的中间体，并最终得到代谢产物。
值得注意的是，因为细胞色素P450酶催化过程极为复杂，一些因素（如外部介质和共同作用的小分子）可能会对细胞色素P450酶引起巨大的影响。
比如一些配体分子的结构会影响到建立的中间体，进而影响到细胞色素P450酶的催化活性，这对于药物的筛选以及研究酶与外部介质及其他小分子的相互作用具有重要的参考价值。
三、未来方向随着科学技术的进步，细胞色素P450酶的研究也将会越来越深入。
未来的方向可以从多个方面来考虑，例如建立结构模型、研究酶动力学、探究酶与介质之间的相互作用、药物筛选和酶的修饰等等。
这些研究的开展将会为人类以及整个生命系统的健康与可持续发展提供重要的科学支持和借鉴。
复方曲肽注射液对细胞色素P450酶活性的体内外影响
复方曲肽注射液对细胞色素P 450酶活性的体内外影响Δ刘凡琪 1＊，王婧媛 2，李楠 1，李自强 2 #，黄宇虹 2，王保和 3（1.天津中医药大学研究生院，天津 301617；2.天津中医药大学第二附属医院临床药理中心，天津 300250；3.天津中医药大学第一附属医院国医堂，天津 300193）中图分类号 R 969.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2023）16-1972-07DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2023.16.10摘要 目的 考察复方曲肽注射液对细胞色素P 450（CYP 450）酶活性的体内外影响。
方法 将人肝微粒体与复方曲肽注射液（体积分数0.05%～10%）和CYP 1A 2、CYP 2B 6、CYP 2C 8、CYP 2C 9、CYP 2C 19、CYP 2D 6、CYP 3A 4的特异性探针底物共孵育30 min ，采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS ）技术检测相应代谢产物的生成量，并计算半数抑制浓度（IC 50）；将人原代肝细胞与复方曲肽注射液（体积分数0.05%～10%）或CYP 1A 2、CYP 2B 6、CYP 3A 4阳性诱导剂共孵育48 h 后，采用实时荧光定量聚合酶链式反应法测定上述酶mRNA 的相对表达量（即诱导倍数）。
将雄性SD 大鼠随机分为对照组（生理盐水+CYP 1A 2、CYP 2B 6、CYP 2C 8、CYP 2C 9、CYP 2C 19、CYP 2D 6、CYP 3A 4探针底物8、2、1、1、10、10、8 mg/kg ）和实验组（复方曲肽注射液0.9 mL/kg+CYP 1A 2、CYP 2B 6、CYP 2C 8、CYP 2C 9、CYP 2C 19、CYP 2D 6、CYP 3A 4探针底物8、2、1、1、10、10、8 mg/kg ），每组6只，采用Cocktail 探针药物法，以UPLC-MS/MS 技术为手段，检测各探针底物的药动学参数。
灯盏生脉胶囊有效组分对大鼠细胞色素P450酶同工酶作用的体外研究
员摇 材料与方法
（ 栽韵蕴） 、 奥美拉唑 （ 韵酝耘 ） 、 硝苯地平 （ 晕陨云 ） 、 扑热息痛 （ 孕砸粤） 、 源 原 羟基甲苯磺丁脲 （ 韵匀栽韵蕴 ） 、 缘 原 羟基奥美 拉唑 （ 韵匀韵酝耘） 、 氧化硝苯地平 （ 阅晕陨云 ） ， 以上对照品均
员援 员摇 试 剂 与 仪 器 摇 非 那 西 丁 （ 孕匀耘 ） 、 甲苯磺丁脲
☆
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细胞色素P450酶系体外药物代谢研究方法进展
８ ｌ
・ 研 究进 展 ・
细胞色素 Ｐ ４ ５ ０酶 系体 外 药 物代 谢 研 究方 法 进展
于 敏 ，张双 庆 ， 闻 镍 ，李佐 刚 （ 中国食品药品检定研究院食品药品安全评价研究所，
北 京 １ ０ ０ １ ７ ６ ）
中图分 类号 ：Ｒ ９ ６ ５
Ｉ ｎ Ｖｉ ｔ ｒ ｏ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｐｒ ｏ ｇ ｒ ｅ ｓ ｓ ｏ ｎ Ｃｙｔ ｏ ｃ ｈｒ ｏ ｍｅ Ｐ４ ５ ０ ｆ ｏ ｒ Ｄｒ ｕ ｇ Ｍ ｅ ｔ ａｂ ｏ ｌ ｉ ｓ ｍ
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摘要：
目的 综述 细胞 色素 Ｐ ４ ５ ０（ Ｃ ＹＰ ４ ５ ０ ）酶 影 响 药物代 谢 的体 外研 究方 法 。方 法 参 考 国 内外 文献 ，
对 与 药物代谢 相 关的 Ｃ ＹＰ 酶 亚 型 、Ｃ ＹＰ酶 种 属 差 异 、 Ｃ Ｙ Ｐ 酶 体 外 反 应 体 系 、 药物 主 要 代 谢 酶 的 确 认 方 法
这是造成代谢种属差异的主要原因因此我们不能完全用动物p450酶来代替人的p450酶进行研究具体的cyp酶亚型见表1p450酶的性别差异在大鼠体内表现最为明显现已发现雌雄大鼠体内p450同工酶的组成有明显的质和量的差异某些药物在雌雄大鼠体内的主要代谢途径和代谢产物可能是不同的因而造成其在雌雄大鼠体内的毒性也存在明显的差异这值得引起临以两 种 方式被 清 除 ：一 种
要 的有 葡 萄 糖 醛 酸 转 移 酶 、谷 胱 甘 肽 一 Ｓ 一 转移 酶 、 磺 基 转 移 酶 和 乙 酰 基 转 移 酶 等 。在 上 述 的 代 谢 反应 中，由 Ｐ ４ ５ ０酶 所 催 化 的 Ｉ相 反 应 是 药 物 在
细胞色素P450酶在药代动力学中的应用
细胞色素P450酶在药代动力学中的应用细胞色素P450酶（cytochrome P450 enzymes，CYPs）是一类生物催化酶，参与体内外营养物代谢及毒物代谢转化等过程。
药物在体内的代谢是被这些酶所主导的。
因此，了解药物在体内的药代动力学及药效学，对于合理使用药物非常重要。
本文将重点介绍细胞色素P450酶在药代动力学中的应用。
一、细胞色素P450酶的分类细胞色素P450酶是一类可以催化氧化反应的酶，由一组铁蛋白组成。
目前已发现的细胞色素P450酶有57种，分别被编号为CYP1至CYP57，其中CYP3A4和CYP2D6是人体内代表性的细胞色素P450酶。
这些酶在人体内广泛分布于肝脏、肾脏、肠道等组织中。
细胞色素P450酶的功能多种多样，包括氧化药物、代谢内源性物质和外源性毒物等。
二、药物的代谢途径药物在体内的代谢分为两个主要途径：一是通过细胞色素P450酶催化药物的氧化、还原、脱氧等反应，将药物转化为代谢产物，然后由肝脏和肾脏等器官进行排泄代谢产物；二是通过肝脏等器官中的一些转移酶的作用，将药物或代谢产物结合成可溶于水的化合物，最终通过尿液和粪便等排泄出体外。
三、CYP450酶在药物代谢中的作用在药物的代谢过程中，细胞色素P450酶起到了至关重要的作用。
药物进入体内后，大部分被经过肝脏进行代谢。
肝脏中的CYP450酶通过氧化、还原等多种反应途径，将药物分解并转化成代谢产物，其中一部分代谢产物比药物更易于排泄，而另一部分则可能对人体产生毒性作用。
例如，硝酸甘油是一种被广泛使用的心脏病药物，通过扩张血管，减轻心脏负担。
然而，硝酸甘油的代谢产物亚硝酸甘油更容易产生氧化应激反应，从而损伤内皮细胞并促进动脉粥样硬化，引发心血管疾病。
这种情况提示我们在使用硝酸甘油时，需要谨慎使用，并注重维生素C等抗氧化剂的补充。
同时，药物在体内的代谢速度也对其药效产生影响。
例如，利多卡因和普卡因是两种常用的局麻药物，二者的药效主要差异在于利多卡因被CYP450酶的代谢速度更快，作用时间更短。
细胞色素p450荧光探针_解释说明以及概述
细胞色素p450荧光探针解释说明以及概述1. 引言1.1 概述细胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）是一类多样的酶系统，广泛存在于动植物、真菌和微生物等生物体中。
它们在机体内发挥重要的生化功能，参与许多代谢过程和药物转化反应。
由于其作用的广泛性和复杂性，研究细胞色素P450的功能及其相关的生物学过程变得至关重要。
荧光探针作为一种可以标记、追踪并检测特定分子或反应的工具，在细胞和分子生物学领域中得到了广泛应用。
通过设计和合成荧光探针，我们可以更好地理解细胞色素P450在不同环境下的表达、活性以及相互作用机制。
因此，细胞色素P450荧光探针对于深入研究细胞色素P450酶系统具有重要意义。
1.2 文章结构本文主要依次介绍了细胞色素P450荧光探针的解释说明以及概述，并包括以下几个章节：- 引言：对文章的主题和结构进行概述，阐明了细胞色素P450荧光探针的重要性。
- 细胞色素P450荧光探针的解释说明：详细介绍了细胞色素P450的作用、重要性，以及荧光探针的原理和设计思路。
同时探讨了该技术在生物医学领域中的应用前景和研究价值。
- 细胞色素P450荧光探针的具体概述：介绍了已有的细胞色素P450荧光探针，并阐明了设计新型荧光探针的方法与策略。
此外，还列举了细胞色素P450荧光探针在生物医学领域中的一些应用案例。
- 结论：总结当前对于细胞色素P450荧光探针研究的现状，并展望其未来发展方向和研究进展。
同时评述该研究对于细胞色素P450酶系统研究的意义和影响。
1.3 目的本文旨在系统地介绍细胞色素P450荧光探针技术，包括其原理、设计思路以及在生物医学领域中的应用案例。
通过深入了解该技术的解释和概述，读者能够更好地理解细胞色素P450的功能及其相关研究，并为今后的研究提供参考和启示。
2. 细胞色素p450荧光探针的解释说明:细胞色素P450 (CYP) 是一类广泛存在于动植物以及微生物中的酶家族，涉及许多重要的生化反应和代谢过程。
《基于液质联用技术的胡黄连苷Ⅱ体内外代谢初步研究》
《基于液质联用技术的胡黄连苷Ⅱ体内外代谢初步研究》一、引言胡黄连苷Ⅱ是一种具有重要药用价值的化合物，广泛存在于多种植物中。
随着现代医学技术的进步，对胡黄连苷Ⅱ的体内外代谢研究显得尤为重要。
本文旨在利用液质联用技术对胡黄连苷Ⅱ的体内外代谢进行初步研究，以期为胡黄连苷Ⅱ的药效学及药物代谢动力学提供理论依据。
二、材料与方法1. 材料（1）实验样品：胡黄连苷Ⅱ（2）实验动物：选用健康实验动物，如大鼠或小鼠。
（3）实验试剂与仪器：液质联用仪、色谱柱、溶剂等。
2. 方法（1）体外代谢实验：将胡黄连苷Ⅱ与动物肝脏微粒体混合，模拟体内环境进行代谢实验。
（2）体内代谢实验：将胡黄连苷Ⅱ给予实验动物，收集其代谢产物，进行液质联用分析。
（3）液质联用技术：利用液质联用仪对代谢产物进行分离、鉴定及定量分析。
三、实验结果1. 体外代谢实验结果通过体外代谢实验，我们发现胡黄连苷Ⅱ在动物肝脏微粒体中可发生多种代谢反应，生成多种代谢产物。
利用液质联用技术，我们成功鉴定了其中几种主要代谢产物的结构。
2. 体内代谢实验结果在体内代谢实验中，我们收集了实验动物服用胡黄连苷Ⅱ后的代谢产物。
通过液质联用技术，我们分析了代谢产物的种类及含量，并初步探讨了胡黄连苷Ⅱ在体内的代谢途径。
四、讨论根据实验结果，我们对胡黄连苷Ⅱ的体内外代谢进行了初步探讨。
首先，我们发现胡黄连苷Ⅱ在体外环境中可发生多种代谢反应，生成多种代谢产物。
其次，在体内环境中，胡黄连苷Ⅱ的代谢途径可能与体外环境相似，但具体代谢过程可能受到机体内部环境的影响。
此外，我们还发现不同个体之间可能存在代谢差异，这可能与个体的遗传、生理状态等因素有关。
五、结论本文利用液质联用技术对胡黄连苷Ⅱ的体内外代谢进行了初步研究。
通过实验，我们了解了胡黄连苷Ⅱ在体内外的代谢过程及主要代谢产物。
然而，由于实验条件及时间的限制，我们尚不能完全揭示胡黄连苷Ⅱ的详细代谢途径及机制。
未来可进一步开展相关研究，以期为胡黄连苷Ⅱ的药效学及药物代谢动力学提供更深入的理论依据。
灯盏生脉胶囊有效组分对大鼠细胞色素P450酶同工酶作用的体外研究
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大鼠体内外细胞色素P450酶活性检测方法的建立及应用作者：夏丽军陈伟东刘进来源：《中国现代医生》2021年第05期[摘要] 目的建立快速、简便、灵敏可以同时测定大鼠体内外“鸡尾酒”探针药物和代谢产物的LC-MS/MS方法，并用于大鼠肝微粒体外代谢和大鼠体内的药代动力学研究。
方法所有样品均加入乙腈进行沉淀处理，然后在UPLC CORTECS C18（2.1 mm×50 mm，1.6 μm）色谱柱分离，质谱方法采用多反应监测模式（MRM）。
液相方法采用梯度洗脱流动相乙腈-0.1%甲酸水。
结果 6种探针药和代谢产物的体内外样品方法学验证符合生物样品检测要求。
该方法成功应用于大鼠体内外“鸡尾酒”实验中。
结论本实验建立的“鸡尾酒”方法可用于体内外快速评价药物或中草药对相应的CYP450亚型酶活性的影响，可以用于潜在的药物相互作用的预测。
[关键词] 细胞色素P450;大鼠肝微粒体;探针药;UPLC-MS/MS[Abstract] Objective To establish a rapid， simple and sensitive LC-MS/MS method for simultaneous determination of "cocktail" probe drugs and metabolites in vivo and in vitro of rats，and to apply it to studies of in vitro metabolism of rats′ liver microsomes and in vivo pharmacokinetics of rats. Methods Both in vivo and in vitro samples were treated by acetonitrile precipitation method. Probe drugs and metabolites were detected by UPLC CORTECS C18 （2.1 mm×50 mm，1.6 μm） chromatographic column combined with UPLC-MS/MS method of multiple reaction monitoring mode（MRM）， in which acetonitrile-0.1% formic acid water was used as gradient elution method of mobile phase. Results Methodological verification of samples in vitro and in vivo of 6 probe drugs and metabolites met the requirements of biological sample detection. The method had been successfully applied to "cocktail" experiments in vivo and in vitro of rats.Conclusion The "cocktail" method established in this experiment could be used to rapidly evaluate the efficacies of drugs or Chinese herbal medicines on the activities of the corresponding CYP450 subtypes enzymes in vivo and in vitro and could be used to predict potential drug interactions.[Key words] Cytochrome P450; Rat liver microsomes; Probe drugs; UPLC-MS/MS细胞色素P450酶（Cytochrome P450 proteins，CYP）是体内I相代谢的主要代谢酶超家族，大约能代谢超过90%的药物和内源性物质[1-2]，其中，经CYP1A2、CYP2B6、CYP2D6、CYP2C9，CYP2E1和CYP3A4代谢的药物占所有经CYP代谢药物的80%以上[3-5]。
药物、食物和中草药等可通过抑制或诱导药物代谢酶来改变其他药物的代谢和药代动力学特性，从而导致药物之间相互作用。
其中，对CYP酶的抑制作用会增加药物不良反应的风险或降低所需的治疗效果。
研究者通常使用体外P450酶抑制试验来研究经P450代谢的药物相互作用（Drug-drug interaction，DDI）或中草药药物相互作用（Herb-drug interaction，HDI）的可能机制。
目前研究者已开发了几种混合使用P450探针底物的混合物进行肝微粒体温育的鸡尾酒方法，可以高通量地检测经P450酶代谢药物相互作用的预测，但是，目前大多數文献都是单一的体内或体外“鸡尾酒”方法[6-9]，本实验将体内和体外“鸡尾酒”方法相结合，采用UPLC-MS/MS检测方法，为预测药物相互作用提供较全面的数据，可以用于潜在的药物相互作用的预测。
1 材料与方法1.1 材料来源非那西汀（Ph，批号：ILTFG-PD）和安非他酮（Bu，批号：31677-93-7）购于Tokyo Chemical Industry公司，右美沙芬（Dex，批号：D299445）、甲苯磺丁脲（Tol，批号：64-77-7）和氯唑沙宗（Chl，批号：95-25-0）购于J&K Scientific，咪达唑仑（Mdz，批号：20180207）产自江苏恩华药业，羟基安非他酮（OH-Bu，批号：92264-81-8）购自加拿大TLC Pharmaceutical Standards Ltd.，羟基咪达唑仑（OH-Mdz，批号：59468-85-8）、右啡烷（Dep，批号：125-73-5）、羟基甲苯磺丁脲（OH-Tol，批号：5719-85-7）、羟基氯唑沙宗（OH-Chl，批号：475295-90-0）和对乙酰氨基酚（Ac，批号：103-90-2）购于Toronto Research Chemicals公司;色谱级甲醇、乙腈购自德国Merck公司。
色谱级甲酸购自阿拉丁生化试剂公司。
实验用水为娃哈哈纯净水。
大鼠肝微粒由本实验室制备。
1.2 仪器ACQUITY I-Class 超高效液相串联XEVO TQD三重四级杆质谱和Masslynx 4.1软件（美国Weters公司）;5430R低温高速离心机（美国Eppendorf公司）;TE4101-L电子天平（北京赛多利斯仪器公司）;电热恒温振荡水槽（上海森性实验仪器有限公司）。
1.3 对照品储备液配制精密称取10 mg各探针药，然后加入10 mL甲醇，配成1 mg/mL储备液;精密称取1 mg各代谢产物，然后加入10 mL甲醇，配成0.1 mg/mL储备液并避光后于4℃保存。
1.4 色谱条件色谱柱为ACQUITY UPLC CORTECS C18 column（2.1 mm×50 mm，1.6 μm）;流动相为A 相乙腈，B相0.1%甲酸-水，梯度洗脱流程为：0.0～0.6 min，10%～50%A;0.6～1.0 min，50%～80%A;1～2 min，80%～95%A;2.0～2.5 min，95%A;2.5～2.6 min，95%～10%A;2.6～3.0 min，10%A。
流速为0.4 mL/min，柱温保持在40℃，样品进样量为2 μL。
1.5 质谱条件离子源采用ESI源并采用多离子监测模式检测，同时采用正离子扫描模式和负离子扫描模式。
其中毛细管电压为2000 V，脱溶剂气温度和流量分别为500℃和1000 L/Hr，锥孔气流量50 L/Hr，离子源温度为150℃。
各探针药及其代谢产物的离子对相关质谱参数信息见表1。
1.6 样本处理1.6.1 血浆样本处理精密量取100 μL血浆样品置于1.5 mL EP管中，加入20 μL 内标地西泮（0.5 μg/mL）和200 μL乙腈沉淀蛋白，涡旋1 min后在13 000 r/s离心5 min，取上清进样。
1.6.2 孵育样品处理精密量取200 μL孵育液置于1.5 mL EP管中，加入200 μL冰乙腈和20 μL内标地西泮（0.5 μg/mL）沉淀蛋白，涡旋1 min后在13 000 rpm离心5 min，取上清进样。
1.7 方法学验证按照FDA[10]和EMA[11]标准，取空白基质、空白基质+对照品和检测样品进行专属性考察;各探针药及其代谢产物取合适濃度的多个点建立标准曲线;各探针药及其代谢产物各取低、中、高3个浓度质控样品（Quality control，QC），每个浓度5个样品，连续分析3 d考察精密度和准确度;取正常处理的QC，空白基质预处理的QC和甲醇稀释处理的QC考察回收率和基质效应;QC样本在室温24 h、4℃、反复冻融3次和-80℃等不同保存条件下考察稳定性。
2 结果2.1 分析方法专属性取空白基质、空白基质+对照品、大鼠口服探针药后0.5 h的血浆和孵育后的孵育液按“1.6样本处理”处理，见图1。
可知各探针药及其代谢产物峰型良好，无内源性物质干扰。
2.2 标准曲线的绘制精密吸取各对照品储备液并用甲醇稀释，将Ph、Tol和Chl稀释为0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00和20.00 μg/mL;将Mdz、Dex和Bu稀释为0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00和2.00 μg/mL;将OH-Chl、OH-Mdz和OH-Tol稀释为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μM;将Dep、OH-Bu和AC稀释为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 μM;用空白基质将上述梯度对照品稀释10倍，按“1.6样本处理”处理并进样，用Masslynx 4.1软件导出标准曲线。
见表2。
各标曲线性良好，R2均>0.990。
2.3 精密度和准确度取空白基质，按照“1.7方法学验证”项方法分别加入探针药和代谢产物配成最小定量下限浓度（Lower limit of quantification，LLOQ）和低、中、高3个浓度QC，Ph、Tol、Chl浓度为2、4、40、1600 ng/mL;Mdz、Bu、Dex浓度为1、3、30、150 ng/mL;OH-Chl、OH-Mdz、OH-Tol浓度为0.05、0.15、1.50、4.50 μM;Dep、OH-Bu、Ac浓度为0.01、0.03、0.30、0.90 μM;对同一浓度进行5个样本分析，连续检测3 d，计算日内、日间精密度和日内、日间准确度，结果表明，LLOQ的精密度和准确度均在20%以内，3个QC的精密度和准确度均在15%以内，符合样品分析要求。