粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金快速测试卡检测方法编制说明
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《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金
快速测试卡检测方法》
编制说明
《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金
快速测试卡检测方法》
标准起草组
2011年11月
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2
《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金
快速测试卡检测方法》
编制说明
1．任务来源及工作过程
国务院粮食管理流通条例和粮食卫生标准都明确规定粮食收购要对真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行检验控制，而我国标准体系中缺少呕吐毒素快速检测的方法及标准因此，该项研究迫在眉睫。
我国是农业大国，农产品种植区分布广泛，粮食收购多集中在县以下单位的粮食收储库点。时间短，收购量大，存在很多隐患。主要集中在以下方面：一方面粮食入库时间短，不宜长时间露天存放，因此对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测需要快速定性。另一方面收购企业技术力量和硬件设备不足，利用大型仪器检测收购粮真菌毒素无法普及。因此目前在粮食收购环节最需要解的问题就是建立高效、快速、低成本的定性检测方法。
传统上，真菌毒素的分析一般采用薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)。TLC虽然简便，但灵敏度差；HPLC虽然灵敏度高，但样品处理烦琐，操作复杂，仪器昂贵。这两种方法都不适合在收购原粮时进行快速定性检测。因此需要脱氧雪腐镰刀菌烯醇快速检测方法的研究，从源头解决储备粮真菌毒素污染问题。
为了确保公民的饮食安全，进一步保证产品质量、规范生产、为市场监督提供依据，需要制定《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金快速测试卡检测方法》标准，按照GB2760-2007的要求，对小麦粉及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量进行监督。
本行业标准的制定是根据国家粮食局标准质量中心下达的 年国家标准制修订任务，由北京市粮油食品检验所负责起草。项目编号： 百度文库 - 让每个人平等地提升自我
3 2. 编制过程
第一阶段工作
第一阶段为收集国内外脱氧雪腐镰刀菌烯醇测试分析标准及相关资料，了解掌握脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定方法的最新技术发展情况阶段。本阶段查阅了大量的文献资料，参考国内外脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定方法的国家标准和行业标准。标准编制小组成员经过研究和讨论一致认为，胶体金快速检测方法具有较好的可操作性和实用性，因此我们参考这些先进方法和产品，并根据国内粮食行业的实际生产和检测技术应用情况，着手制定《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金快速测试卡检测方法》的基本思路和主要工作方向。
第二阶段工作
第二阶段为组织起草并召开标准起草组工作会议。本标准起草组在经过收集、整理资料和调研工作的基础上，提出标准提纲，确定了标准的主要内容和要求。标准起草工作组成员单位进行讨论、论证，形成标准初步文本；标准起草组成员单位间通过多种形式不断交流、补充、完善标准文本，进行验证试验和比对试验，最终形成该标准征求意见稿。
本阶段重点组织了脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测方法的验证试验。先后开展了两轮比对试验，针对各家分析实际操作时标准文本中存在的问题及建议，对标准进行了修改，得到标准起草小组的一致认可，形成该标准征求意见稿。
3 编制原则
本标准按照GB/T 、GB/T 和GB/T 《标准编写规则 第4 部分 化学分析方法》的规定和要求编写，在标准框架、结构和内容等方面符合这些标准的要求。
强制性国家标准《粮食卫生标准》规定了粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的安全限量，且本标准所确定的检测方法能满足该标准的初步筛选测定。
4.国家标准主要内容的论据
本标准的主要内容
《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金快速测试卡检测方法》标准为推荐性标准，其主要内容包括：
（1） 封面 百度文库 - 让每个人平等地提升自我
4 （2） 前言
（3） 标准主体内容：范围、规范性引用文件、原理、试剂、仪器设备、样品制备、样品测定与结果判定。
主要试验（或验证）的分析
4.2.1标准方法原理
脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素胶体金快速测试卡检测技术原理是基于抗原抗体反应、免疫金标记技术及毛细管层析技术。以微孔膜为固相载体，将可特异性识别脱氧雪腐镰刀菌烯醇的抗体标记红色或紫红色的胶体金颗粒，检测卡的膜上两个色带分别固定脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗原，以及抗鼠源性抗体的二抗，根据色带的颜色变化进行结果评估。质控色带（control line）不会被样品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇影响，而在每次反应后都应出现，用于证明检测条是否正常。检测色带（test line）在样品中没有脱氧雪腐镰刀菌烯醇或样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量低于检测限时会显现；在样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量等于或高于检测限时不出现。
4.2.2验证方案
4.2.2.1验证对象及验证单位
参考粮食卫生标准，确定本次验证粮种为小麦和玉米，考虑到加标样品的毒素分布、均匀性等影响，本次验证全部采用天然阳性样品进行验证；验证毒素为脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）；验证用胶体金快速测试卡采用国内二家公司提供的DON三批次。验证单位为（北京）国家粮食质量监测中心、（湖北）国家粮食质量监测中心、（辽宁）国家粮食质量监测中心、（重庆）国家粮食质量监测中心、（四川）国家粮食质量监测中心和（广西）国家粮食质量监测中心。
4.2.2.2阳性样品的制备
北京中心将收集到的阳性样品粉碎，至少80%以上通过20目筛，筛上和筛下物混匀，采用免疫亲和柱高效液相色谱法对制备的阳性样品进行混合均匀度测定，混合均匀性达到要求后将阳性样品分发给六家国家检测中心。
4.2.2.3 阳性样品定值
六家国家检测中心收到阳性样品后，采用免疫亲和柱高效液相色谱法进行平行试验测定结果报送北京中心进行统计处理，取平均值作为理论值。 百度文库 - 让每个人平等地提升自我
5 4.2.2.4 测试卡验证
六家国家中心将分发并定值后的高浓度阳性样品与空白样品按照各测试卡样品量要求分别称取，配置所需浓度，然后按照测试卡说明书指定的方法进行测定。
4.2.3结果与分析
采用两种DON测试卡（测试卡A和测试卡B），各三个批次，按照各自规定的操作步骤和评定方法对小麦和玉米中DON进行了测定。
4.2.3.1 准确性
4.2.3.测试卡A
根据六家中心的检测结果，共进行39个浓度154次有效测试，共出现误判20次，判定准确率为%，其中，假阳误判出现14次，假阴误判出现6次。具体结果见下表1。
表1 测试卡A准确性验证结果
品种 测试次数 误判
次数 误判率% 假阴误判次数 假阴误判率% 假阳误判次数 假阳误判率%
玉米 68 5 0 0 5
小麦 86 15 6 9
合计 154 20 6 14
4.2.3.测试卡B
根据六家中心的检测结果，共进行40个浓度187次有效测试，共出现误判34次，判定准确率为%，其中，假阳误判出现23次，假阴误判出现11次。具体结果见下表2。
表2测试卡B准确性验证结果
品种 测试次数 误判
次数 误判率% 假阴误判次数 假阴误判率% 假阳误判次数 假阳误判率%
玉米 92 15 5 10
小麦 95 19 6 13
合计 187 34 11 24
4.2.3.2重复性 百度文库 - 让每个人平等地提升自我
6 测试卡A：按照验证方案，六家中心共进行408次测试，其中有效结果为330次，共出现误判34次，判定准确率为%，其中假阴性误判次数为13次，出现比例为%。
测试卡B：按照验证方案，六家中心共进行414次测试，其中有效结果为316次，共出现误判61次，判定准确率为%，其中假阴性误判次数为48次，出现比例为%。
4.2.3.3稳定性
4.2.3. 测试卡A
根据有效结果，按照含量为限量标准时应判定为阳性的规则，各不同产品批次测定结果见表3。
表3 测试卡A批间稳定性
批次 测试次数 误判 判定准确率%
24 3
20 0 100
82 4
批间相对偏差%
4.2.3.测试卡B
根据有效结果，按照含量为限量标准时应判定为阳性的规则，各不同产品批次测定结果见表4。
表4 测试卡B批间稳定性
批次 测试次数 误判 判定准确率%
G3 30 12
G3 30 13
G2 40
12
批间相对偏差%
4.2.3.4 约定误差范围试验
测试卡A：在700-1250ppb浓度范围内，共获得14个浓度的有效测定结果108次；玉米样本无假阴性误判；小麦样本假阴性出现6次，浓度在1120-1250ppb百度文库 - 让每个人平等地提升自我
7 之间出现5次, 其中：假阴性判定出现在1000ppb浓度1次。假阳性判定出现在800ppb浓度2次、900ppb浓度8次、950ppb浓度4次。出现误判的浓度范围为800-1250ppb。
测试卡B：在500-1500ppb浓度范围内，共获得18个浓度的有效测定结果151次;玉米样本假阴性出现5次，浓度分别为1000ppb2次和1145ppb3次;小麦样本假阴性出现4次，浓度分别为1000ppb2次和1100ppb2次。出现误判的浓度范围为500-1500ppb.
4.2.4结论
4.2.4.1现有国家标准方法中规定的DON测定方法精密度（见表5）。
表5 呕吐毒素检测相关标准
标准号 GB/T
GB/T
23503-2009 SN/T 1571-2005
标准名称 食品中DON的测定 配合饲料中DON测定 进出口粮谷中呕吐毒素检验方法
采用方法 薄层色谱 ELISA 免疫亲和层析HPLC 薄层色谱法 液相色谱法
重复性% / 15 10 / /
再现性% / / / / /
检出限 kg kg mg/kg 1 mg/kg
回收率% 80-100 / 70-100 /
4.2.4测试卡A性能：
准确性判定正确率：%
重复性判定正确率：%
稳定性判定正确率：%
约定误差范围（800 mg/kg~1200 mg/kg）内判断正确率：
玉米 %
小麦 %
综合判定正确率：80%
4.2.4.3 呕吐毒素测试卡指标设定
胶体金快速测试卡检测粮食中真菌毒素的应用
第３７卷第１期 ２０１２年２月 粮食错妓占任清 ＧＲＡＩＮＳＣＩＥＮＣＥＡＮＤＩＴＥＣＨＮＯｔ－Ｃ￣ＹＡＮＤＥＣＯＮＯＩ￣￣ ＶＯＩ．３７，Ｎｏ １ Ｆｅｂ．２０１ ２
胶体金快速测试卡检测粮食中真菌毒素的应用
郭健 ，尚艳娥 ，张燕 ，刘征 ，朱旭东２刘利３邹勇 ，彭健 ，杨军
（１．北京国家粮食质量监测中心，北京１００１６２；２．辽宁国家粮食质量监测中心，辽宁沈阳 １１００３２；
３．湖北国家粮食质量监测中心，湖北武汉４３００６１；４．重庆国家粮食质量监测中心，重庆４０００３７；
５．广西国家粮食质量监测中心，广西南宁５３００３１；６．Ｉ￣ｔ）ｌｌ国家粮食质量监测中心，Ｉ￣ｔＪｌｌ成都６１００１２）
［摘要］采用国家标准方法对脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮２种真菌毒素的胶体金快速测试卡进行了验证，从验证
的准确性、重复性、稳定性方面看，真菌毒素胶体金快速测试卡能够满足快速筛选的技术要求，方法简便快捷，适合粮食收
购环节现场快速筛选检测工作。
［关键词］真菌毒素；胶体金；快速测试卡；粮食
真菌毒素是由产毒真菌产生的代谢物，广泛存在于
粮油食品和饲料中 ］。针对粮食质量安全问题．《粮食管 理流通条例》和粮食卫生标准都明确规定粮食收购要对
真菌毒素进行检验，但中国粮油种植区分布广泛，粮食
收购多集中在县以下单位的收储库点，时间短，收购量
大。无法及时利用现行国家标准规定的方法检测粮食中
真菌毒素含量Ｅ２ ３。现有真菌毒素的分析一般采用薄层色
谱法（ＴＬＣ）、酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）和高效液相色谱法 （ＨＰＬＣ）。３种方法均须在实验室条件下严格控制条件，进
行复杂的样品前处理操作，才能出具结果，且都无法适应
现场收购快速检验的需要。因此，建立简便、高效、低成本
的现场快速筛选检测方法迫在眉睫 ］。近几年，随着生物
技术应用的不断突破．一种基于酶联免疫反应原理的快
速检测方法——胶体金检测技术应运而生．这项技术产
粮食真菌毒素快速检测方法评价规程 编制说明
《粮食真菌毒素快速检测方法评价规程》
行业标准编制说明
前言
近年来食品安全事件频发，基于大型仪器的检测方法通常由于设备庞大、操
作复杂、检测速度较慢，成本较高等弊端无法满足及时、快速、现场的检测需求。
为了满足日益增长的食品安全现场快速监管需求，快速检测（快检）方法受到越
来越多的重视。快检方法有别于大型仪器方法，是一种包括样品前处理，短时间
内能对相关质量安全指标得出检测结果的技术[1]。国际标准化组织（InternationalOrganizationforStandardization，ISO）将其描述为具有能够满足用户适当需求的
性能，具有减少分析时间、易于操作或者可以自动操作、小型化、降低检测成本
等优势的替代方法（alternativemethod）[1-2]。基于快检方法的快检产品是指诸如
检测试剂盒、试纸条[3-6]这类对快检技术的主要或关键组成进行了商品化包装，
并可供销售的检测体系，用以确定一种或多种基质中目标分析物的存在或含量[7]。
新修订的《中华人民共和国食品安全法》[8]第一百一十二条中明确规定了“县
级以上人民政府食品药品监督管理部门在食品安全监督管理工作中可以采用国
家规定的快速检测方法对食品进行抽查检测”。《中华人民共和国农产品质量安全
法》[9]第三十六条中也规定了在农产品质量安全监督抽查中可“采用国务院农业
行政主管部门会同有关部门认定的快速检测方法进行农产品质量安全监督抽查
检测”。CAC/RCP51-2003《预防与降低谷物中真菌毒素污染操作规范》[10]中明确
提出需要发展“快速、经济、准确”的检测包。但是目前市场上的快检产品还存
在诸多问题：生产厂家研发水平、产品质量参差不齐，影响着快检产品的检测可
靠性；开发和应用脱节，快检产品难以满足市场监管和用户的实际需求。如何科
学合理地使用快检产品和选择满足自身使用需求的快检产品同样是一个难题。因
此，建立科学规范的快检产品评价方法，保障快检产品质量，规范并指导用户使
玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的测定能力验证
玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的测定能力验证
作者：王蓓蓓 朱联旭 李崇勇 刘欣
来源：《安徽农业科学》2022年第01期
摘要 [目的]通過实验室能力验证活动分析了影响玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）检测结果的主要因素。[方法]依据GB 5009.111—2016第二法：免疫亲和层析净化HPLC法检验并优化前处理条件。[结果]采用5倍稀释浓度提取1 h和3 mL/min的净化速度，能力验证样品中DON含量为571 μg/kg，RSD为0.25%。[结论]通过了中国食品药品检定研究院组织实施的NIFDC-PT-228《玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定》能力验证，与中国食品药品检定研究院统计Z比分值为0.70，能力验证结果为满意，细化完善了国标测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇的操作，为广大检验检测人员提供参考。
关键词 脱氧雪腐镰刀菌烯醇;能力验证;玉米粉;高效液相色谱法
中图分类号 TS 201.6 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2022）01-0177-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.047 Proficiency Testing for Determination of Deoxynivalenol in Corn Flour
WANG Bei-bei1，2， ZHU Lian-xu3， LI Chong-yong1 et al
（1. Hanzhong Testing and Inspection Center for Food and Drug Control， Hanzhong，
Shaanxi 723000;2. College of Biological Science and Engineering， Shaanxi University of
食品中呕吐毒素的快速检测胶体金免疫层析法
食品中呕吐毒素的快速检测胶体金免疫层析法
1 范围
本方法规定了胶体金免疫层析法测定食品中呕吐毒素的快速检测方法。
本方法的适用范围为谷物加工品及谷物碾磨加工品中呕吐毒素的快速检测。
2 原理
试样中呕吐毒素与胶体金标记的特异性抗体发生结合后，抑制了层析过程中抗体与硝酸纤维素膜检测线上呕吐毒素-BSA偶联物的免疫反应，使检测线颜色发生变化，根据检测线颜色变化进行结果判定。
3试剂及耗材
除非另有规定，所用试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682中三级水。
3.1 试剂
3.1.1 提取液：水或胶体金免疫层析检测装置专用提取液。
3.1.2 甲醇：分析纯
3.2 参考物质
呕吐毒素参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥99%。
表1 呕吐毒素参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量
中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子量
脱氧雪服镰刀菌烯醇 Deoxynivalenol 51481-10-8 C15H20O6 296.32
注：或等同可溯源物质。
3.3 标准溶液配制
准确称取适量的呕吐毒素参考物质（精确至0.0001g），用甲醇溶解，配成0.1mg/mL 的标准储备液，-20 ℃保存，有效期3个月。
3.4 材料
3.4.1 呕吐毒素胶体金免疫层析检测装置。
3.4.2 中速定性滤纸。
3.4.3 离心管。
3.4.4 滤膜：0.45 µm 水相滤膜。
4 仪器及设备
4.1 天平：感量0.01～0.0001 g。
4.2 粉碎机。
4.3 样品筛：0.9 mm。
4.4 漩涡混合器： 1500 rpm/min。
4.5 移液器：100 μL，200 μL，1.0 mL。
4.6 恒温装置：（37.0±2.0）℃。
4.7 设备或方法使用环境条件：温度15 ℃～30 ℃，湿度≤80%。
5 分析步骤
5.1 扦样和分样，按GB 5491 执行。
检测小麦脱氧雪腐镰刀菌烯醇的注意事项
圆园19年第1期
检测小麦脱氧雪腐镰刀菌烯醇的注意事项
谈军1马玉侠2
1.安徽粮食批发市场有限公司现代粮食物流中心库安徽六安2313232.中央储备粮宿州直属库有限公司安徽宿州234000
中图分类号：TS207.4文献标识码：C文章编号：1674-5280（2019）01-0023-02
收稿日期：2018-08-16作者简介：谈军渊1980要冤袁男袁粮油质量高级检验师袁主要从事粮油质量检验工作
遥脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）又称呕吐毒素，具有很强的细胞毒性。人畜食用污染严重的粮谷类食品和饲料后，健康将受到严重危害，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳和反应迟钝等急性中毒症状。“GB2761—2011食品安全国家标准食品中真菌毒素限量”中规定了脱氧雪腐镰刀菌烯醇限量指标，谷物及其制品：玉米、玉米面（渣、片）、大麦、小麦、麦片、小麦粉限量为1000滋g/kg。“LS/T6113—2015粮油检验粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定胶体金快速定量法”适用于小麦、玉米等粮食及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的快速定量检测。方法检出限为120滋g/kg。DON是一种单端孢霉烯族毒素，主要由某些镰
刀菌产生，包括：禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌和雪腐镰刀菌等。许多粮谷类都可以受到污染，如小麦、大麦、燕麦和玉米等。这种真菌大多在低温、潮湿和收割季节，在谷物庄稼中慢慢生长，一般在大麦、小麦、玉米、燕麦中含有较高的浓度。DON污染粮谷的情况非常普遍，世界各地均有
报道。2014年至今安徽长江以南地区出现大规模小麦赤霉病现象。2018年小麦的政策性收购和托市收购比往年
提高了标准，质量等级必须达到三等，且呕吐毒素是必检项目。安徽粮食批发交易市场有限公司现代粮食物流中心库是安徽省单体容量第一的粮库，地处安徽省六安市，今年轮换省储小麦3万吨。夏季收购中，该库严格按照国家收购政策的质量要求，对呕吐毒素进行每车检验。为了快速定量检测，检验按照国家粮食局发布的标准“LS/T6113—2015粮油检验粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定胶体金快速定量法”进行，本人通过对收购过程2000多份样品检测分析，总结出减少呕吐毒素检测误差的操作注意事项，供同行参考。1检测原理
呕吐毒素定量卡法在小麦面粉等农副产品中应用
呕吐毒素定量卡法在小麦及面粉等农副产品中的应用
---济南痕量生物科技有限公司
一、呕吐毒素介绍：
呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇,是单端孢菌素烯烃中的一种。作为一种常见的真菌毒素，呕吐毒素在自然界中广泛存在于小麦等粮谷类农作物中，在世界范围内存在着较高的污染率。小麦一旦被呕吐毒素产毒霉菌株污染，在适宜生长环境中，产毒菌株会迅速生长，产生呕吐毒素，而小麦中的呕吐毒素又会随小麦粉的生产过程带入到面粉中，严重威胁人体健康。
由于DON的严重影响引起了各国的普遍重视。美国食品药物管理局规定食品中呕吐毒素安全标准是1000ug/kg,而欧盟制定的限量标准相对较严，谷粉及玉米粉中允许限量750ug/kg 。我国2013年国家风险监测计划已将小麦和面粉中呕吐毒素含量的检测列为重点。
二、小麦和面粉中呕吐毒素国家残留限量标准
大麦、小麦、麦片、小麦粉≤1000ug/kg
三、呕吐毒素定量卡的行业标准：
LS/T6113-2015《粮油检测 粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定 胶体金快速定量法》
四、济南痕量生物呕吐毒素定量卡法检测方案
近年来，在真菌毒素定性检测条的基础上，国际上推出了真菌毒素快速定量检测条，配合专用的读数仪，可以在十几分钟内完成真菌毒素的快速定量检测，其检测结果与国标仪器方法具有较高的吻合度。
美国Charm公司推出的呕吐毒素定量检测条可在十几分钟内快速定量的检测出大麦、小麦、面粉中呕吐毒素的残留量，样品前处理简单，检测操作简便，结果准确、可靠，准确性符合HPLC法的检测结果，适用于各类小麦收储、面粉加工企业及检测机构。
1、呕吐毒素定量检测试纸条的性能
检测灵敏度：0-1.5ppm（稀释的提取物）
1-6ppm（二次稀释的提取物）
检测限： ≤100ppb
2、检测所配备的仪器和耗材
编号 名称 数量
酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法检测粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的比较分析
第３６卷 ２０１ １年１２月 娘食钟妓占任涛 ＧＲ＾ＨＳＣＩＥＮＣＥｇＮＯ！ＴＥａ ．０ＬｏＧＹ＾ＮＤＥｃｄ Ｄ＾ ＶｏＩ．３６ ＤＯＧ．２０１ １ 酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法 检测粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的比较分析 张志茹，赵艳芳 （河北省粮油质量检测中心，河北石家庄０５００２１） ［摘要］采用酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法分别对粮食样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（ＤＯＮ）进行测定，对其检测条件 和结果进行差异性比较，２种检测方法操作过程简单、快速，结果比较准确，适合批量样品的快速筛选，而胶体金免疫层析 法更适合单一样品的现场快速定性检测。 ［关键词］酶联免疫吸附法；胶体金免疫层析法；脱氧雪腐镰刀茵烯醇；比较 脱氧雪腐镰刀菌烯醇（ＤＯＮ）又名呕吐毒素，在自然 界广泛存在，主要污染玉米、小麦、大麦、燕麦等粮食作物 及其制品，通过食物链进行传递，严重危害人体健康。国 家标准规定ＤＯＮ在粮食中的限量值为１ ０００ ｇ／ｋｇ。目前 国家标准中对ＤＯＮ的检测方法主要有薄层色谱法（ＴＬＣ）、 免疫亲和层析净化高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）和酶联免疫 吸附法（ＥＬＩＳＡ）。ＴＬＣ法操作繁琐，ＨＰＬＣ法准确度高，重 复性好，但检测成本高，检测时间长，而ＥＬＩＳＡ法和最新 发展起来的胶体金免疫层析法均属于免疫学检测范围． 可快速检测样品中的ＤＯＮ含量。本实验利用酶联免疫吸 附法和胶体金免疫层析法分别对粮食样品ＤＯＮ含量进行 了测定，对其检测条件和结果进行了差异性比较。 １材料与方法 １．１仪器和试剂 Ｍｏｄｅｌ ６８０型酶标仪：美国伯乐公司：粮食样品磨：成 都施特威科技有限公司：恒温振荡器：常州国华仪器公 司；电热恒温培养箱：天津泰斯特仪器有限公司：电子天 平：上海民桥科学仪器有限公司；微量移液器：上海求精 生化试剂仪器公司；脱氧雪腐镰刀菌烯醇酶联免疫试剂 盒：德国拜发公司；脱氧雪腐镰刀菌烯醇胶体金试剂盒： 南昌博恒生物制品有限公司。 １．２试验方法 １．２．１酶联免疫吸附检测法实验操作方法 （１）样品前处理。取有代表性的样品粉碎，准确称取 ５．０ｇ样品于带塞三角瓶内，准确加入１００ｍＬ超纯水。将加 入水的样品放入振荡器内，中速振荡３ ｍｉｎ后，用Ｗｈａｔｍａｎ ｌ号滤纸过滤，收集滤液，此滤液为样品待检液。 （２）点样分析。①在ＤＯＮ标准孔和样品孔相应地加 入标准品和样品待检液，向每个微孔中再加入酶连接物 溶液和呕吐毒素抗体溶液，充分混合。在室温（２０ ２５℃） 条件下暗处孵育５ｍｉｎ，倒出孑Ｌ中液体，洗板。②加入底物／ 发色剂，在室温（２Ｏ一２５℃）条件下暗处孵育５ ｍｉｎ。③加入 反应终止液，用酶标仪于４５０ｎｍ波长处测定吸光度值。 （３）结果判定。用ＲＡＤＥＷＩＮ专用ＥＬＩＳＡ分析软件对 数据进行分析得出结果。 １．２．２胶体金免疫层析法实验操作方法 （１）样品前处理。取有代表性的样品粉碎，准确称取 １．０ｇ样品加入到１５ｍＬ离心管中．向离心管中加入１０ｍＬ 蒸馏水，振荡提取２ ｍｉｎ，静置１ ｍｉｎ，用塑料吸管吸取１ ｍＬ 上清液于样品瓶中．然后向样品瓶滴人４滴缓冲液，充分 混匀，此为样品待检液。 （２）点样分析。将检测卡平放，滴人３滴样品待检液 于速测卡检测区域内，１０ ｍｉｎ根据卡上出现的情况判读 检测结果。 （３）结果判定。阴性：Ｃ线显色，Ｔ线显色，判为阴性； 阳性：Ｃ线显色，Ｔ线不显色，判为阳性；无效：Ｃ线不显 色，无论Ｔ线是否显色，均判为无效。（注：阴性表明样品 ＤＯＮ含量小于１ ０００￣ｇ／ｋｇ；阳性表明样品ＤＯＮ含量大于 或等于１ ０００￣ｇ／ｋｇ。） ２结果 检验用样品来源于某批次检验中不同浓度梯度的玉 米样品８个。将８个样品用酶联免疫吸附法测定其ＤＯＮ 含量，每个玉米样品均做３次试验取其平均值；用胶体金 免疫层析速测卡进行定性分析。每个玉米样品均测定２ 次。检测结果见表１和表２。 表１ 酶联免疫吸附法检测结果
《饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 时间分辨荧光免疫层析定量法》
2022
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饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定
时间分辨荧光免疫层析定量法
1 范围
本文件规定了饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定的原理、试剂和材料、仪器和设备、样品制备、样
品前处理、标准曲线制定、检测过程、结果计算和方法性能。
本文件适用于饲料原料、浓缩饲料、配合饲料、精料补充料等试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适
用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1 饲料 采样
GB/T 20195 动物饲料 试样的制备
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
时间分辨荧光微球 time resolved fluorescent microsphere
形状为球形，直径在几纳米至几十微米之间，微球表面或内部负载有荧光物质，在受到一定的能
量激发时能够发出荧光的微粒，比普通荧光半衰期长。微球表面修饰有合适密度的羧基或其它功能基
团，用于与蛋白或抗体的共价偶联；微球所包理的镧系稀土元素经过了鳌合，无需解离增强步骤。
3.2
时间分辨荧光免疫层析定量法 time resolved fluorescence immunochromatography
quantitative method
4 原理
试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇与时间分辨荧光微球标记的特异性抗体结合后，抑制了层析过程中标
记抗体与试纸条T线脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗原的免疫反应，使T线时间分辨荧光强度降低，质控线C
线结合的荧光标记物浓度与样品中玉米赤霉烯酮的浓度无关。层析结束后，通过仪器检测计算试纸条
T线和C线的时间分辨荧光强度比值和设定的标准曲线进行准确定量分析。 2022
2 5 试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
小麦中呕吐毒素含量检测
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FOOD INDUSTRY分析 检测小麦中呕吐毒素含量检测 武建锋 刘洋 南阳市粮油质量检测中心呕吐毒素是一种常见的污染毒素，会引起人或动物出现呕吐等中毒症状，因此被称为呕吐毒素。小麦是人们喜爱的主食之一，同时也是呕吐毒素分布量最大的农作物之一。在小麦种植与仓储管理中都有可能形成呕吐毒素，严重影响消费者的身体健康。因此，对小麦呕吐毒素含量进行检测对于保证食品安全有着重要的意义。呕吐毒素及其危害呕吐毒素（Ｖｏｍｉｔｏｘｉｎ），是一种常见的真菌毒素，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ，缩写ＤＯＮ）其拥有高稳定性的化学性质，受热也不易分解，在自然环境中适应性很强，广泛存在于不同种类的粮食作物中。呕吐毒素主要源自于单端孢霉烯族化合物，例如尖孢镰刀菌、粉红镰刀菌等等。经过试验研究发现，该类单端孢霉烯族毒素的数量众多，约有１５０种左右，该类毒素繁殖生长速度快，难以有效控制，所以对粮食作物产生了巨大的破坏。该类速度的理化性质也十分有限，通常为纯白色结晶，在紫外线照射下午荧光，但处于水中的溶解度较高，遇热也不易分解，因此呕吐毒素的测定与降解需要选择合适的技术进行。呕吐毒素对人体毒性很强，对人体危害极大，能够严重损害真核细胞、原核细胞、肿瘤细胞。呕吐毒素能够渗入磷脂双层，作用于亚细胞水平；并且通过细胞膜产生作用，利用自由基介导的脂质过氧化作用等方式对原核细胞进行作用，进而严重危害细胞的正常功能。小麦中呕吐毒素含量检测胶体金三线定量法。胶体金真菌毒素检测条是定量检测小麦中呕吐毒素最为简易的方式，检测过程对下小麦样品的处理简易，８ｍｉｎ－１０ｍｉｎ就可以得出检测结果。试样提取液中的霉菌毒素与检测条中的胶体金微粒发生反应，霉菌毒素与胶体金微粒的结合物以及胶体金微粒在侧流作用下移动，当到达检测线时，包被的抗原与胶体金微粒结合发生呈色反应，其颜色深浅与试样中霉菌毒素的含量相关。用读数仪测定检测条上检测线和质控线颜色深浅，根据颜色深浅和读数仪内置的标准曲线计算出试样中霉菌毒素含量。胶体金三线定量法简单、快捷、准确、成本低，适合企业在初检时使用。ELISA检测方法。取出处于冷藏状态的小麦呕吐毒素检测的ＥＬＩＳＡ测试盒，将其于室温环境下放置到正常室温状态。按照说明书的测试要求准备洗涤液与呕吐毒素单克隆抗体工作液。同时，将酶标板微孔放置在反应架支板上，详细标注类别，再对其进行拍干处理。在两种不同类别中的标准品孔中添加５０μｌ的呕吐毒素溶液，样品孔中计入５０μｌ样品提取液，没空都分别加入５０μｌ的抗ＤＯＮ单克隆抗体工作液，将其摇匀，处于３７摄氏度环境下培育６０ｍｉｎ。然后进行甩干处理，使用洗涤液洗板３次后拍干。每孔分别加入１００μｌ美标记的羊抗鼠抗体结合物工作液，处于３７摄氏度下培育３０ｍｉｎ。然后进行处理，洗涤液洗板后拍干处理。并在其中每孔分别加入５０μｌ与底物液、显色液，在３７摄氏度环境下放置１５ｍｉｎ后取出，并分别添加５０μｌ的终止液，同时在４５０ｎｍ波长下对各个孔进行吸光度值Ａ进行测定。ＥＬＩＳＡ检测能够半定量检测小麦样品中呕吐毒素的含量。液相色谱检测方法。液相色谱方法是根据《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定、免疫亲和层析净化高效液相色谱法》中的方法进行检测。主要过程是使用提取液提取样品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇，经过免疫亲和柱净化后，运用高效液相色谱紫外线检测仪进行检测。这一技术灵敏度较高，测定范围较广，能够十分有效的将呕吐毒素与其他真菌毒素分离开来，具有较高的分离效率与回收效率，可靠性强，检测成本相对较高，设备仪器使用维护成本高，通常作为检测机构的最终判定方法。小麦中的呕吐毒素是由真菌毒素所导致的，要降低小麦中的呕吐毒素必须要强化小麦种植中的田间管理与小麦储存期间的仓储管理，全方位的抑制真菌生长。同时，国家食品检测机构要建立健全的食品安全检测体系，运用高效而准确的检测方式，对小麦中呕吐毒素进行检测，尽可能的降低呕吐毒素对动物与人体的危害，保证小麦与小麦制品的安全。作者简介：武建锋（1989-）男，汉族，河南西峡人，南阳市粮油质量检测中心，本科，工程师，研究方向：粮油检测。刘洋（1991-）男，汉族，河南淅川人，南阳市粮油质量检测中心，本科，工程师，研究方向：粮油质量检测。Copyright©博看网 . All Rights Reserved.
酶联免疫吸附法快速检测谷物中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇2011-01—18
第５期（总第２４４期） ２０１１年５月 农产品加工・学刊 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌ ｏｆ Ｆａｒｍ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｎｏ．５ Ｍａｙ 文章编号：１６７１—９６４６ ｆ ２０１ １ １ ０５—００９５—０２ 酶联免疫吸附法快速检测谷物中的 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 罗瑞峰 （农业部食品质量监督检验测试中心（石河子），新疆石河子８３２０００） 摘要：应用ＥＬＩＳＡ法快速检测麦类、谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（ＤＯＮ），最低检出限为１０ Ｉ￣ｇ／Ｌ，检测范 围为１０—１ ０００＃．ｇ／Ｌ。用１０％甲醇水溶液提取含ＤＯＮ的小麦及玉米样品，回收率为８６～９３％，变异系数为４．１％～ １７．４％。 关键词：脱氧雪腐镰刀菌烯醇；ＥＬＩＳＡ；检测 中图分类号：￥５１５ 文献标志码：Ａ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊｉｓｓｎ．１６７１～９６４６（Ｘ）．２０１１．０５．０２８ Ｅｓｔａｂｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ｆｏｒ Ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ（ＤＯＮ）ｉｎ Ｃｏｒｎ Ｌｕｏ Ｒｕｉｆｅｎｇ （Ｆｏｏｄ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ（ＳｈｉＨｅＺｉ），Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆＡｇｒｉｃｕｈｕｍ Ｐ．Ｒ．ＣＨＩＮＡ，Ｓｈｉｈｅｚｉ ＸｉｎｇＪｉｎｇ ８３２０００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｓｔａｂｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ｆｏｒ Ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ（ＤＯＮ）ｉｎ ｃｏｌｎ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔｓ ｉｓ １０ ｕｇ／Ｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｉｓ １０￣１ ０００ ｇ／Ｌ．Ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ａｎｄ ＣＯＩＴＩ ｍｉｘｅｄ ｗｉｔｈ ＤＯＮ，ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ １０％Ｍｅｔｈａｎｏｌ－Ｈ２０，ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ｏｆ ＤＯＮ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ８６％ｔｏ ９３％， ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｓ ｆｒｏｍ ４．１％ｔ０ １７．４％． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｉ ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ；ＥＬＩＳＡ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ 酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）快速检测谷物及其制 品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法具有特异性强、灵 敏度高、实验操作较简单等优点，已广泛应用于真 菌毒素检测中。 １材料与方法 １．１仪器与设备 酶标仪，上海纤检仪器有限公司提供；恒温培 养箱（０～６０℃）、微量移液器、分析天平、微量振 荡器。 １．２试剂 脱氧雪腐镰刀菌烯醇ＥＬＩＳＡ试剂盒，无锡市艾 赛生物技术有限公司提供；甲醇（分析纯）、ＰＢＳ缓 冲溶液（ｐＨ值７．４）。 １．３ ＤＯＮ标准溶液的制备 １．４样品处理 准确称取５．０ ｇ粉碎均匀的样品于三角瓶中，加入 ２５ ｍＬ体积分数为１Ｏ％甲醇水提取液，振荡１５ ｍｉｎ， 以定量滤纸快速过滤，收集滤液。 １．５ ＥＬＩＳＡ方法分析步骤 １．５．１试剂的准备 从冰箱中取出脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫试剂盒， 平衡至室温，用２．０ ｍＬ抗体稀释缓冲液，将１支抗 ＤＯＮ单克隆抗体溶解；用４．０ ｍＬ抗体稀释缓冲液将 １支酶标二抗浓缩液溶解，充分摇匀；取３．０ ｍＬ浓 缩洗涤液加５７ ｍＬ蒸馏水稀释，备用。 １．５．２抗原抗体反应 选择适量酶标板微孔，标记标准品孔和样品孔， 每孔加入５０ Ｌ ＤＯＮ系列标准溶液或处理好的待测 样品提取液到相应的微孔中，每孔都加入５０ Ｌ抗 ＤＯＮ单克隆抗体工作液，在３７℃恒温孵育６０ ｍｉｎ。 １．５．３酶标二抗示踪 将温育后的板条取出，甩干，每孔用２５０ ｔｘＬ的 洗涤液洗涤３次，没有连接的ＤＯＮ抗体在洗涤步骤 中被除去，拍干，每孔都加入１００ ｔｘＬ的酶标二抗工 作液，３７ ｃＣ恒温反应３０ ｍｉｎ。 收稿日期：２０１１－Ｏ１—１８ 作者简介：罗瑞峰（１９７５一），男，江苏人，实验师，研究方向：食品分析。Ｅ—ｍａｉｌ：ｋｚｈ９９＠ｓｏｈｕ．ｅｏｍ。