寡糖衍生化及基质辅助激光解吸电离
DOI：10.3724/SP.J.1096.2010.00307
寡糖衍生化及基质辅助激光解吸电离
飞行时间质谱分析方法研究
韩欢欢马岩王璐张万军卫军营张养军钱小红*
（军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京蛋白质组研究中心，蛋白质组学国家重点实验室，北京102206）
摘要为提高中性寡糖在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）中的检测灵敏度，建立了以1-（4-氰基苯基）-4-哌啶碳酰肼（CPH）为衍生化试剂对寡糖的标记方法。寡糖的还原端与CPH的酰肼基团反应生成腙，使得寡糖被CPH标记，衍生物以MALDI-TOF质谱进行分析。结果表明：在反应温度95℃，醋酸浓度为0.125%（V/V），CPH过量100倍的条件下，衍生产率可达最大，并且CPH衍生可使中性寡糖在MALDI-TOF质谱中的检测灵敏度提高10倍。本方法简便快速，灵敏度高，适合微量寡糖链的质谱分析。
关键词基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；1-（4-氰基苯基）-4-哌啶碳酰肼；中性寡糖
2009-07-15收稿；2009-11-11接受本文系国家重点基础研究规划项目（Nos.2006CB910801，2006CB910803，2007CB914104）、国家高技术研究发展计划项目（No.2006AA02A308）、国家自然科学基金项目（Nos.30621063，20635010，20735005，20875101）和国家重点实验室自主课题（No.2008ZX10207）资助项目。*E-mail：qianxh1@yahoo.com.cn1引言
糖基化作为一种普遍的蛋白质翻译后修饰反应，在生命过程中起着重要作用。糖蛋白上的寡糖链
能够影响蛋白的稳定性及蛋白的构象，参与胞外胞内的信号转导，并能引发与其它分子之间特异的相互
作用［1，2］。基质辅助激光解吸电离飞行时间（MADLI-TOF）质谱以其简单、快速和较高的灵敏度已经成
为糖结构分析中的重要手段［3，4］。但是，由于寡糖的亲水性强，缺乏易于结合质子的碱性基团，离子化
效率较低，使得MALDI-TOF质谱对寡糖链结构的分析远远落后于对蛋白/肽段的结构分析。为提高寡
聚糖在质谱中的检测灵敏度，研究者进行了各种尝试，主要通对寡糖的化学修饰来提高寡糖的质谱检测
灵敏度。如在寡聚糖的还原端通过衍生化加上各种结构中含有质子的基团（如季铵碱［5，6］和吡啶［7］），
或加上易得质子的基团（如胍基［7］）；通过增强寡聚糖的疏水性来提高其检测灵敏度，因为疏水性强的
分析物更容易与基质形成均匀的混晶从而产生更强的信号［8］，如将苯肼［9，10］、苾酪［11］基团标记在寡聚
糖的还原端从而提高寡聚糖在质谱中的检测灵敏度。
1-（4-氰基苯基）-4-哌啶碳酰肼（CPH）包含哌啶基团，该基团在含氮杂环化合物中具有较强的碱性（pKa=11.2），推测其可能会使寡聚糖易于质子化，并且其结构中的苯环能够增强寡聚糖的疏水性。目
前尚未见采用含哌啶基团的试剂对寡糖进行衍生化以提高其质谱检测灵敏度的报道。本研究以麦芽七
糖为样品，通过优化反应条件，建立了CPH的寡糖衍生化方法，衍生化后的麦芽七糖的质谱检测灵敏度
提高了10倍。此方法应用于葡聚糖和去唾液酸化胎球蛋白的N-糖链质谱分析，获得了满意的结果。
2实验部分
2.1仪器与试剂4800ProteomicsAnalyzer基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪（美国ABI公司），仪器控制
软件为4700SeriesExplorerSoftware，数据处理软件为DateExplorerSoftware4.5；石墨化碳黑萃取柱（美
国Alltech公司）；离心机（美国Sigma公司）；冷冻干燥离心机（美国Thermo公司）。
1-（4-氰基苯基）-4-哌啶碳酰肼（美国Maybridge公司）；碘乙酰胺（IAA）与乙腈（比利时Acros公
司）；麦芽七糖（DP7），去唾液酸化的胎球蛋白（Asialofetuin），肽-N-糖苷酶F（PNGaseF），2，5-二羟基苯
甲酸（DHB），5-甲氧基水杨酸（美国Sigma公司）；葡聚糖（包含聚合度1～20的葡萄糖聚合物，美国第38卷
2010年3月分析化学（FENXIHUAXUE）研究报告
ChineseJournalofAnalyticalChemistry第3期
307～312Beckman公司）；RapiGestTM（美国Waters公司）；三（2-甲酰乙基）膦盐酸盐（TCEP，美国Pierce公司）；三
氟乙酸（TFA，美国Fluka公司）；水为Milli-Q纯水；其余试剂均为国产分析纯。
2.2实验方法2.2.1溶液的配制用乙腈配制1×10－8mol/LCPH溶液；用水配制1×10－9mol/L麦芽七糖及葡聚糖
溶液；冰醋酸溶液：用无水乙醇将乙酸稀释成不同浓度；SDHB溶液：10g/L2，5-二羟基苯甲酸溶液（70%乙腈，0.1%三氟乙酸）与10g/L5-甲氧基水杨酸溶液（50%乙腈）以9∶1（V/V）混匀。
2.2.2衍生化反应取10μL麦芽七糖溶液或寡糖水溶液，置于1.5mLEppendorf管中，加入40μL
CPH溶液，然后加入10μL一定浓度的冰醋酸的乙醇溶液，在一定温度的水浴中敞口反应至溶液完全
挥干。冷却后加入100μL50%乙腈完全溶解，点靶进行MALDI-TOF质谱分析。
2.2.3MALDI-TOF质谱分析将1μL样品点在不锈钢靶上自然干燥，然后点0.8μLSDHB溶液真
空干燥，待基质完全干燥后，在每个点加0.2μL乙腈，使结晶更加均匀。一级质谱数据采集使用MS-1kV反射模式，加速电压20kV，激光能量6500，每张谱图累加1500次。马心肌红蛋白胰酶酶切
肽段作为标准物对仪器进行外标校正，校准至相对误差≤1.0×10－5。用DateExplorerSoftware4.5计
算每个离子的单同位素峰的面积，定义相对强度为同一张质谱图中发生衍生化后［M+Na］+与［M+
K］+峰面积之和与未发生衍生化的［M+Na］+与［M+K］+峰面积之和的比值。
2.2.4去唾液酸化胎球蛋白N-糖的制备称取去唾液酸化胎球蛋白1mg，溶解于2mL50mmol/L
NH4HCO3中，取10μL加入Rapigest终浓度为0.1%，TCEP终浓度5mmol/L，60℃水浴加热30min。
冷却至室温，加入IAA终浓度25mmol/L，避光反应1h。加入PNGaseF1μL，37℃反应过夜。加入TFA终浓度0.5%，37℃反应30min，13000r/min离心10min，取上清液。用石墨化炭黑萃取小柱纯化N-糖链［12］：先用1.5mL80%乙腈和1.5mL水冲洗平衡柱子，再将离心后的上清液上样于小柱，用1.5mL水将盐洗脱，最后用25%乙腈将N-糖链洗脱，冷冻干燥离心机冻干。
3结果与讨论
3.1CPH衍生化反应机理
采用CPH按照上述的衍生化方法首先对麦芽七糖进行衍生化，反应机理如下：
此反应利用衍生化试剂的酰肼基团与寡糖的还原端生成腙。寡糖分析中常用的还原胺化反应需要
过量的衍生化试剂和硼氢化钠，因此需要在质谱分析前将过量的试剂除去，操作步骤多，将增加对样品
的损耗。而成腙的反应效率高，反应只需加热和过量的带酰肼基团的试剂即可完成［13］，并且在质谱分
析之前不需要纯化过程，更加适合对微量寡糖进行分析。将CPH衍生化后的麦芽七糖直接进行MALDI-TOF质谱分析，图1a是MALDI-TOF质谱检测反应体系中不含冰醋酸的衍生化产物的结果，衍
生前后的麦芽七糖均以加钠峰和加钾峰的形式出现，图1中b～e表示了各峰的同位素分布情况，衍生
化前后各峰的同位素分布情况一致。按照实验方法中的叙述，用各同位素峰的峰面积计算相对强度，即（A1401+A1417）/（A1175+A1191），以相对强度评价各反应条件对反应完全程度的影响。
3.2基质的影响2，5-DHB是糖分析中最常用的基质，但是由于DHB形成的结晶呈长针状，且聚集在边沿处如图2a，需要用较长的时间选择最佳的激光采集位置。本研究采用DHB与5-甲氧基水杨酸的混合基质SDHB（图2b），并采用二次结晶法，即在干燥的结晶点上滴加少量乙腈，乙腈挥发后可得到均匀、晶粒较
小的晶体表面（图2c）。两种方法并用极大改善了样品结晶结构和均匀程度，提高了重现性和灵敏度。
3.3衍生化反应条件的优化3.3.1反应温度的影响首先选定反应体系中冰醋酸的含量为1%，CPH试剂过量40倍，考察各反应803分析化学第38卷
图1麦芽七糖发生衍生化前后MALDI-TOF质谱图及同位素分布Fig.1MALDI-TOFMSspectraofmaltoheptaose（DP7）derivatizedby1-（4-cyanophenyl）-4-piperidineacrbohydrazide（CPH）andisotopicdistributionsa.点靶量（Amountloadedonthetargetplate）10pmol，*：杂质峰（Impurity）；b，c.衍生化前的［DP7+Na］+（m/z1175）和［DP7+K］+（m/z1191）的同位素分布（IsotopicdistributionsofDP7（m/z1175［M+Na］+，1191［M+K］+））；d，e.衍生化后的［DP7+Na］+（m/z1401）和［DP7+K］+（m/z1417）的同位素分布（IsotopicdistributionsofCPHderivatizedDP7（m/z1401［M+Na］+，1417［M+K］+））。
图2点有不同基质的样品点的显微图Fig.2Microscopicviewofsamplespotswithdifferentmatrixa.2，5-Dihydroxybenzoicacid（DHB）；b.SuperDHB（SDHB）；c.SDHB，乙腈重溶（SDHBwithacetonitrilerecrystallisation）。
温度对反应完全程度的影响。结果如图3所示，在0℃冰浴8h后用N2吹干，或者置各温度水浴中至
溶剂完全挥干，随着反应温度的升高，衍生化的完全程度有小幅度升高。由于寡聚糖的还原端与酰肼基
团之间是脱水反应。温度对此反应完全程度的影响并不大，该反应的关键是将反应体系中水分的及时
除去［14］。本实验采取水浴挥干方式除去反应体系中的水，在95℃水浴条件下，该反应5min即可完成。
3.3.2乙酸含量的影响CPH与糖类物质还原端间的反应是由酰肼基团通过亲核攻击质子化的糖半
缩醛碳原子进行的。通常认为在酸性环境下有利于该反应的进行，但文献［15］报道该反应并不需要酸
的催化。在CPH试剂40倍过量，95℃水浴的条件下考察醋酸浓度对衍生化完全程度的影响，结果见图4a。当醋酸的浓度为0.125%时，反应的完全程度达到最大。本研究采用20mmol/LNH4HCO3的乙醇903第3期韩欢欢等：寡糖衍生化及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法研究
糖蛋白分析方法
糖蛋白是蛋白质中的氨基酸侧链被糖基化修饰后的蛋白质，广泛存在于生物体中，具有特殊的生物学功能。研究糖蛋白的传统方法一般是将糖链切掉并分离纯化后再分别进行研究。采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）——这一软电离生物质谱技术，可直接测定糖蛋白的平均分子量及糖含量，应用蛋白酶切及内切糖苷酶酶切相结合的方法，可确定糖基化位点及糖苷键类型。
一、糖蛋白平均分子量及糖含量的测定：
在糖蛋白MALDI-TOF-MS质谱图上表现为一簇峰，各峰之间约相差一个或几个糖基，同时还出现多电荷峰，有些样品中还含少量不带糖链的蛋白峰。糖蛋白的分子量为这些多重峰的平均值。
从不含糖链的蛋白的分子量可以直接得到糖含量，但因其丰度太小难以准确测定。采用内切糖苷酶F将糖链切除，得到含一个GlcNAc的肽链，肽链与糖蛋白平均分子量之间的差值即为糖链的分子量，糖链的分子量与糖蛋白平均分子量的比值即为糖含量。
二、糖苷键类型及糖基化位点的测定：
糖基化位点的确定，则必须依赖一系列酶切反应的实现来加以证实。一般步骤是：①先将糖蛋白还原烷基化、脱盐，加Glu-c酶切，产物再用内切糖苷酶酶切，含糖肽段峰将出现位移。采用差位酶切法对其进行验证：内切糖苷酶F（Endoglycosidase-F）切断N-糖链中五糖核心区中,两个N-已酰氨基葡萄糖间的内糖苷键，而糖N肽酶F（PNGase-F）切断糖链与天冬酰氨间的糖肽键，两者相差一个N-已酰氨基葡萄糖（194Da）；②凝集素对糖肽的提取：凝集素是一类糖结合蛋白，能专一地识别某一特定结构的单糖或寡糖中特定的糖基序列并与之结合。核糖核酸酶B中的糖链为高甘露糖型，我们选用其特异性吸附凝集素----伴刀豆球蛋白（ConA）对含糖肽段进行提取，并直接进行MALDI-TOF-MS检测，为今后糖肽序列分析及糖链结构分析奠定了基础。
寡糖分离和结构分析进展
cyclecheckpointpathways.Science,1996,271(5247):357～3597 LydallD,WeinertT.YeastcheckpointgenesinDNAdam2ageprocessing:implicationsforrepairandarrest.Science,1995,270(5241):314～3158 CarrAM.Checkpointstakethenextstep.Science,1996,271(5247):314～3159 WalworthNC,BernardsR.Rad2dependentresponseofthechk12encodedproteinkinaseattheDNAdamagecheckpoint.Science,1996,271(5247):353～35610KambA,GruisNA,FeldhawsJWetal.Acellcycleregu2latorpotentaillyinvolvedingenesisofmanytumortypes.Science,1994,264(5157):436～43911NoboriT,MiluraK,WuDJetal.Deletionsofthecyclin2dependentkinase24inhibitorgeneinmultiplehumancancers.Nature,1994,368(6473):753～75612SkapekSX,RheeJ,SpicerDBetal.Inhibitionofmyo2genicdifferentiationinproliferatingmyoblastsbycyclinD2dependentkinase.Science,1995,267(5200):1022～102313HaleyO,NovitchBG,SpicerDBetal.Correlationofter2minalcellcyclearrestofskeletalmusclewithinductionofp21byMyoD.Science,1995,267(5200):1018～102014ParkerSB,EicheleG,ZhangPetal.p532indenpendentexpressionofp21cipiinmuscleandotherterminallydifferenti2atingcells.Science,1995,267(5200):1024～1027ProgressintheStudiesofCheckpointControlPathwaysofCellCycle.ZHANGPing2bo,HONGXi2jun,LIUYan(DepartmentofLifescience,SouthwestNormalUniversity,Chongqing400715,China).Abstract Manycheckpointgenesandproteinshavebeenscreenedfromdifferentspeciesandcellsuntilnow,suchasATM,RAD53,CHK1etc.Therearealotofreportsabouttheirfunc2tionincheckpointcontrolpathwaysaswellasthecorrespondanceswithcancers.Keywords cellcycle,checkpoincontrolpathway,cellcarcinogenesis
几种测定生物大分子分子量方法的比较
几种测定生物大分子分子量方法的比较
摘要：生物大分子是指核酸(多核苷酸)、蛋白质(多肽)、碳水化合物(葡聚糖或多糖)和脂类等。因为分子量小于500的单体可以通过聚合作用形成的大分子。测定生物大分子分子量方法是生物研究的核心之一，分子量是多肽、蛋白质、核酸、酶、多糖以及脂类等鉴定中的首要参数。当前医学，药学及生物科学学科之间交叉渗透为测定生物大分子分子量提供了更多的契机，本文对测定生物大分子分子量的方法：生物质谱法，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶渗透色谱法等技术的原理及优缺点进行综述。
关键字：生物大分子 分子量测定 蛋白质 多肽
21世纪是生命科学的世纪，随着人类基因组，水稻基因组等的测序基本完成，蛋白质和结构基因组研究也迅速发展。负责生命活动的是生物大分子，生物大分子之间的相互作用构成了生命活动的基础，因此，测定生物大分子的分子量，深入了解生物大分子的结构功能是掌握生命活动的关键。生物大分子是细胞的基本结构和功能单位,也是研究生命现象中的物质基础.生物体内的分子组成如何?哪些分子才算生物大分子?这些大分子有没有分子量的下限?怎么去测定生物大分子分子量？要想知道这些答案，需要多方位，运用多种方法进行研究。
1. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳方法可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋白质的分子量，常用的方法为SDS—PAGE不连续系统。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理：聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺和N，N-亚甲基双丙烯酰胺经共聚合而成，此聚合过程是由四甲基乙二胺和过硫酸胺激发的，被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙烯酰胺，使得多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。
在一定条件下，蛋白质，多肽在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸在聚丙烯酰胺凝胶电泳及琼脂糖凝胶电泳中，其分子量与电泳迁移率符合的关系。在精确测定与计算相对迁移率时，要求分别测定样品区带中心及指标剂染料区带中心(通常插入铜丝作为标记)与凝胶顶端(聚丙烯酰胺凝胶电泳)或点样孔(琼脂糖凝胶电泳)间的距离。SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
寡糖分离和结构分析进展 2
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. cyclecheckpointpathways.Science,1996,271(5247):357～3597 LydallD,WeinertT.YeastcheckpointgenesinDNAdam2ageprocessing:implicationsforrepairandarrest.Science,1995,270(5241):314～3158 CarrAM.Checkpointstakethenextstep.Science,1996,271(5247):314～3159 WalworthNC,BernardsR.Rad2dependentresponseofthechk12encodedproteinkinaseattheDNAdamagecheckpoint.Science,1996,271(5247):353～35610KambA,GruisNA,FeldhawsJWetal.Acellcycleregu2latorpotentaillyinvolvedingenesisofmanytumortypes.Science,1994,264(5157):436～43911NoboriT,MiluraK,WuDJetal.Deletionsofthecyclin2dependentkinase24inhibitorgeneinmultiplehumancancers.Nature,1994,368(6473):753～75612SkapekSX,RheeJ,SpicerDBetal.Inhibitionofmyo2genicdifferentiationinproliferatingmyoblastsbycyclinD2dependentkinase.Science,1995,267(5200):1022～102313HaleyO,NovitchBG,SpicerDBetal.Correlationofter2minalcellcyclearrestofskeletalmusclewithinductionofp21byMyoD.Science,1995,267(5200):1018～102014ParkerSB,EicheleG,ZhangPetal.p532indenpendentexpressionofp21cipiinmuscleandotherterminallydifferenti2atingcells.Science,1995,267(5200):1024～1027ProgressintheStudiesofCheckpointControlPathwaysofCellCycle.ZHANGPing2bo,HONGXi2jun,LIUYan(DepartmentofLifescience,SouthwestNormalUniversity,Chongqing400715,China).Abstract Manycheckpointgenesandproteinshavebeenscreenedfromdifferentspeciesandcellsuntilnow,suchasATM,RAD53,CHK1etc.Therearealotofreportsabouttheirfunc2tionincheckpointcontrolpathwaysaswellasthecorrespondanceswithcancers.Keywords cellcycle,checkpoincontrolpathway,cellcarcinogenesis
酶解棕榈粕制备甘露寡糖及其组分的结构确定
希望对大家有所帮助，多谢您的浏览！
1 / 5 酶解棕榈粕制备甘露寡糖及其组分的结构确定
摘 要:以棕榈粕为底物,用中性B-甘露聚糖酶降解得到甘露寡糖粗品,并对其采用纸层析法分离纯化其中的各组分,最终得到甘露二糖、甘露三糖和甘露四糖三种寡糖组分。通过气相色谱(GC)检测可知,这三种寡糖中只含有甘露糖和葡萄糖,且甘露糖和葡萄糖的比例依次为119B1、318B1和318B1。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定分离得到的三种寡糖的结构。
关键词:棕榈粕,甘露寡糖,制备,结构
Study on manna-oligosaccharides prepared from
paml mealby enzyme and the determ ination of their structures
Abstrac:tThe sample ofmanno-oligosaccharides(MOS)was prepared from paml mealby
neutralB-mannanase1
The components ofmanno-oligosaccharides were separated and purified by paper
chromatography, and three
different degree of polymerization (DP ) of oligosaccharides were obtained:
mannobiose, mannotriose and
mannotetraose1The structures of them were determ ined by matrix-assisted laser
desorption/ionization-tmi e-of-
flightmass spectrometry(MALD I-TOF MS) and gas chromatography(GC)1The results ofGC
激光解吸电离质谱新型液相基质研究
Ｖｏ１．２３
２ ０ ０ ２年１０月 高等学校化学学报
ＣＨＥＭＩＣＡＩ ＪＯＵＲＮＡＩ ＯＦ ＣＨＩＮＥＳＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩ Ｉ‘ＩＥＳ Ｎｏ．１Ｏ
１８６８～１ ８７２
激光解吸电离质谱新型液相基质研究
熊少祥，陈文章，蒲 丹，辛 斌，王光辉
（中国科学院化学研究所分子科学中心北京质谱中心．北京１０００８０）
摘要选用包括纳米粒子在内的多种基质化合物．构成了多种不同组成的液相基质．以多肽、蛋白、大环寡
糖和有机小分子等数种类型化合物为样品．系统地考察了不刷液相基质在基质辅助激光解吸电离１５Ｉ行时间
质ｉ￣（ＭＡＩ ＤＩ—ＴＯＦ）分析中的应用情况．探讨了与固体制样方法的异ｌ司点．实验结果表明．有些液相基质对
多类化合物具有较好的通用性．而有些液相基质对某些特定类型化合物的分析特别有效．
关键词基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；液相基质；样品制备
中图分类号０６５７．６ 文献标识码Ａ 文章编号０２５ｌ一０７９０（２００２）ｌ０一ｌ８６８—０５
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ）是近年发展起来的一种“软电离”质谱技术，
具有样品不易裂解、分子离子峰强、灵敏度高等特点，已被广泛应用于生物、医学和化学等领域¨１］．样
品的制备是ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ中非常关键的技术，目前通用的固体制样方法，因其本身原理所限，不可避
免地存在着样品分布不均匀、信号重复性差和信号寿命短等缺陷．甚至溶剂、结品速度 、结晶颗粒
的大小［３］对结果都有较大的影响．因此，开发和研究新的制样技术，克服现有的固相制样方法的缺陷，
已成为ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ的一个重要研究内容．将基质溶解于甘油等溶剂中，形成液相基质制备样品，则
可以较好地解决上述问题 ］，Ｂｅｒｋｅｎｋａｍｐ等吲则直接以甘油为基质，使用红外激光，测定了分子量
高达数ｔ万的ＤＮＡ样品．
木文选用了包括纳米粒子在内的多种化合物作为基质或辅助物，以甘油、硝基苄醇和液体石蜡等
基质辅助激光解吸电离_飞行时间质谱在糖类化合物研究中的应用_陈海霞
收稿日期:2004-11-28;修回日期:2004-12-23作者简介:陈海霞(1974～),女(汉族),山东利津人,副教授,工学博士,从事天然产物化学研究。E-mail:chennhxx@第26卷第2期2005年5月质谱学报
JournalofChineseMassSpectrometrySocietyVol.26 No.2May2005
基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱在糖类化合物研究中的应用
陈海霞,高文远
(天津大学药物科学与技术学院,天津 300072)
[作者简介]:陈海霞,2002年7月获华中农业大学食品科技学院工学博士学位,研究方向为天然产物化学;2002年7月—2004年7月在中国海洋大学药物与食品研究所从事博士后研究工作,研究方向为糖生物学和糖化学。参与国家基础研究重大项目(973)及国家自然科学基金项目等多项研究工作,在国内外发表论文18余篇,其中以第一作者发表SCI论文3篇。摘要:综述了基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的发展、在糖类化合物结构研究时常选用的基质,以及在不同类型糖化合物分析中的应用。MALDI-TOF-MS在糖类分析中通常采用的是N2激光源,基质多为有机小分子如2,5-二羟基苯甲酸、2,4,5-三羟基苯乙酮、1-羟基异喹啉或2-羟基-5-甲氧基苯甲酸、-氰基-4-羟基-苯丙烯酸等,基质类型的选择则要取决于糖类的存在形式。糖类化合物如中性糖、酸性糖、硫酸化糖、糖蛋白、蛋白聚糖及糖脂等均可利用适合的基质而进行MALDI-TOF-MS分析。关键词:基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱;基质;糖类化合物中图分类号:O657.63;O629.1 文献标识码:A 文章编号:1004-2997(2005)02-108-07
ApplicationofMatrix-assistedLaserDesorption-Ionization
糖基转移酶反应的基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法监测
第３２卷第４期 ２０１１年７月 质谱学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ ＶｏＬ ３２ ＮＯ．４ Ｊｕｌ｜２Ｏｌ１
糖基转移酶反应的基质辅助激光解吸电离一飞行时间质谱法监测
周大炜 ，刘 斌 ，吴俊丽 ，胡 波 ，齐 源远
（１．南开大学泰达生物技术学院，天津３００４５７；２．天津市微生物功能基因组学重点实验室，天津３００４５７ ３．南开大学分子微生物学与技术教育部重点实验室，天津３００４５７）
摘要：以ｗａｂＤ（大肠杆菌０７７中（）抗原基因簇内）编码的口一１，３甘露糖转移酶、ｗ．ｆｇＤ（大肠杆菌Ｏ１５２中０ 抗原基因簇内）编码的ｐ－１，３－葡萄糖转移酶和ｗｆｅＤ（志贺氏菌鲍氏Ｏ１４中Ｏ抗原基因簇内）编码的 １，４ 半乳糖基转移酶酶促反应产物为研究对象，尝试应用碰撞诱导解离（ＣＩＤ）负离子模式基质辅助激光解吸电 离～飞行时间质谱（ＭＡＩ ＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）技术建立简单 高效的糖基转移酶监测方法。该方法首先直接用质谱 分析０．３ Ｌ未经色谱分离、除盐处理的反应？昆合物，随后应用ＣＩＤ串联质谱技术对酶活反应产物进行结构 表征，实现酶活反应的快速检测。研究结果表明，ＣＩＤ ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ ＭＳ平台适用于新建克隆的糖基转移酶 酶活反应的监测，与现有的高通量方法相比，在速度、灵敏度、重现性、自动化和溶剂消耗方面具有绝对 优势。 关键词：脂寡糖；糖基转移酶；基质辅助激光解吸离子化一飞行时间质谱（ＭＡＩ ＤＩ—ＴＯＦ ＭＳ） 中图分类号：Ｏ ６５７．６３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４－２９９７（２Ｏ１１）０４—０ｌ９３一Ｏ７
Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ
ｂｙ ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
ＺＨＯＵ Ｄａ—ｗｅｉ ’。～，ＬＩＵ Ｂｉｎ ’。～，
ＷＵ Ｊｕｎ—ｌｉ ’ ～，ＨＵ Ｂｏ ，ＱＩ Ｙｕａｎ—ｙｕａｎ （１．ＴＥＤＡ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｂ ０ ｃ ０Ｚ０ｇ ，Ｎａｎｋａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４５７，Ｃｈｉｎａ； ２．ｎＰ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４５７，Ｃｈｉｎａ； ３．Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏＪ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４５７，Ｃｈｉｎａ）
公共营养知识：寡糖分离分析技术
寡糖由于单糖分⼦、寡糖素
结合位置和结合类型的不同，使得种类繁多，功能各异，寡糖的结构与组成直接决定了其⽣物学功能，鉴于糖缀合物上寡
糖链在⽣命过程中的重要作⽤，展开寡糖链的结构分析是⾮常重要的。
糖类的分析⽅法常规的有苯酚硫酸法、⼆硝基⽔杨酸法等化学⽅法，但是这些⽅法只能测定总还原糖，不能测定各种糖的
含量，且⽐⾊定量不准确。混合糖的分离鉴定及其组成的分析⽅法⼀般采⽤纸⾊谱法、薄层⾊谱法及柱⾊谱法，能够在糖类分
离的基础上对样品中的各种糖类逐⼀定量分析，但这些⽅法存在分离效⼒有限和⾮专⼀性响应的问题，随着现在分析技术的进
步，⼏种先进的物理学⽅法⼰经应⽤到寡糖的分析上来，如⽓相⾊谱法（GC）、⾼效液相⾊谱法（HPLC）和⽑细管电泳法
（CE）这些⽅法分离能⼒⾼，⽅法灵敏快速。此外红外(IR)、核磁共振(1H-NMR,13C-NMR,COSY等)、质谱(MS)等⽅法也运
⽤到了糖类结构分析中，使糖的分析⽅法有了质的飞跃。以下简要介绍⼀下这⼏种⽅法：
1、⽓相⾊谱法（GC）
⽓相⾊谱法测定糖类始于1958年，主要⽤于分析多糖和寡糖的单糖组成。⽓相⾊谱法要求供试样品有良好的挥发性和热
稳定性，⽽糖由于含有⼤量的羟基不能在⾼温下直接挥发，需要将其衍⽣为易挥发、对热较稳定的物质。多糖、寡糖可直接制
备成衍⽣物进⾏GC测定，多糖需先降解成单糖或寡糖后制成衍⽣物再进⾏GC测定。在分析复杂样品时，由于糖的异构化⽽造
成多峰现象，所以应选择适宜的衍⽣物制备⽅法，常⽤于糖的衍⽣试剂有三甲基硅烷、三氯醋酸酐等。
⽤于糖类分析的固定相从⾮极性、中等极性到极性都有应⽤。硅烷化衍⽣物常⽤中等极性的⾊谱柱，酞基衍⽣物可采⽤基
性较强的⾊谱柱来分离。对于复杂的多糖，由于其降解产物含有多个峰，且某些峰的保留时间⾮常接近，⼈们⼰越来越多的采
⽤⽑细管柱代替填充柱来进⾏分析。
寡糖减肥
2、⾼效液相⾊谱法
⾼效液相⾊谱(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)法是⼀种⾼效率、⾼分辨率的分离纯化⼿段。已经成为常
寡糖研究新进展
寡糖研究新进展
寡糖(oligosaccharides) ,亦称低聚糖,由2～9个单糖单元经苷键结合而成。根据结合的单糖个数,可分为双糖、三糖、四糖直至九糖,分子式为(C6H10O5 ) n , n = 2～9。许多寡糖及其糖缀合物因独特的结构而成为重要的生命物质,如乳果糖、大豆低聚糖、异麦芽糖等不仅以其缀合物起作用,而且其本身具有重要的生理功能,可作为促双歧杆菌生长因子,有拮抗机体过氧化损伤及降脂作用。目前,我国功能性寡糖的研发尚处于起始阶段,对一些功能显著、市场前景好、附加值高的寡糖产品的研发相对滞后。人们对寡糖在食品、医药及农业方面的开发寄予厚望。
1 寡糖的分类
寡糖类组分多以游离状态存在于植物体和果实中。构成寡糖的单糖主要是葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等五碳糖和六碳糖。
根据寡糖的单糖组成可分为同寡糖和杂寡糖,前者由同类单糖组成,后者由不同单糖组成;根据分子中是否存在游离的半缩醛羟基,还可分为还原性寡糖和非还原性寡糖,前者为糖基2糖基2糖的形式,后者为糖基2糖基2糖苷的形式;根据生物学功能可分为普通寡糖和功能性寡糖,前者可被机体消化吸收,产生能量,如蔗糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽寡糖等,后者具有特殊的生理学功能但不被肠道吸收。还有一类寡糖是在侧链上修饰不同的化学基团,如胺基、羟基、硫酸基等,此类产物有糖醛酸、胺基糖、脱氧糖等。
2 寡糖的提取与制备
目前主要有从天然产物直接提取、酶催化合成或酶解天然多糖、酸水解天然多糖和化学合成等4种途径。
2. 1 天然产物直接提取
从天然原料中提取未衍生化的寡糖产品十分困难。目前适用此法的寡糖有棉籽糖(从甜菜提取) 、大豆寡糖(从大豆乳清提取) 、黑曲霉寡糖(从菌体提取)等。近年此法不断取得进展。武卫红用不同体积的75 %乙醇室温提取鲜地黄中的总寡糖。Kotiguda等用70 %乙醇室温浸泡菜豆, 130 r/min摇床提取13 h,用薄层色谱和纸色谱在提取液中检测到筋骨草糖(六糖) 。