人脑胶质瘤中肿瘤干细胞的体外培养及生物学特性(1)
中国组织工程研究与临床康复 Ｊ２眷第－５ ２００８—１２—１６出版 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １６，２００８ Ｖｏ１．１２，Ｎｏ．５１
人脑胶质瘤中肿瘤干细胞的体外培养及生物学特性★ 潘志刚 ２，刘文超２，江澜’，岳亚军’，蔡伟’，杨剑’，薛安林’，刘汉山’ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｇｌｉｏｍａ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐａｎ Ｚｈｉ．ｇａｎｇ’， ，Ｌｉｕ Ｗｅｎ．ｃｈａｏ ，Ｊｉａｎｇ Ｌａｎ ，Ｙｕｅ Ｙａ－ｊｕｎ’，Ｃａｉ Ｗｅｉ’，Ｙａｎｇ Ｊｉａｎ’，Ｘｕｅ Ａｎ－ｌｉｎ’，Ｌｉｕ Ｈａｎ・ｓｈａｎ’ Ａｂｓｔｒａｃｔ ＢＡＣＫＧＲ０ＵＮＤ：Ｓｏｍｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ａ ｆｅｗ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｃｏｕｌｄ ｍｉｇｒａｔｅ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ＢＴＳＣｓ、ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｇｌｉｏｍａ ｔｉｓｓｕｅ ｎ ｖｉｔｒｏ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：Ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ＢＴＳＣｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＢＴＳＣｓ，
ａｎｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ＢＴＳＣｓ． ＤＥＳＩＧＮ．ＴＩＭＥ ＡＮＤ ＳＥＴＴＩＮＧ：Ｃｅｌｌａｒ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｗａｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，ｔｈｅ Ｆｏｕｒｔｈ
Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ＰＬＡ ｆｒｏｍ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ｔｏ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ｉｎ ２００７． ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ：Ｓｅｖｅｎ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｇｌｉｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ ３ ａｎａｐｌａｓｆｉｃ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ ｏｎｅｓ ａｎｄ ４ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ ｏｎｅｓ． Ｍ＿ＥＴＨ０ＤＳ：ＢＴＳＣｓ ｗｅｒｅ ｓｅｅｄｅｄ ｉｎｔｏ ｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅ ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ２％Ｂ２７，ｈｕｍａｎ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ，ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ｉｎｓｕｌｉｎ，Ｌ—ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｎｄ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ．Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ａｔ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １ Ｘ １０ ／Ｌ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｏｎ ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ２％Ｂ２７，ｈｕｍａｎ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａ１ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｏ ａｓ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ ｓｐｈｅｒｅｓ．Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ ｓｐｈｅｒｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｆｉｆｔｈ ｐａｓｓａｇｅ ｗｅｒｅ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ ａｎｄ ｓｅｅｄｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ—ｃｏａｔｅｄ ｃｏｖｅｒ ｓｌｉｃｅ ｕｓｉｎｇ ＤＭＥＭ，Ｆ１２ ｍｅｄｉｕｍ ａｄｄｅｄ ｗｉｔｈ ０．１０ ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ．Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＴＳＣｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ． ＭＡＩＮ ＯＵＴＣＯＭＥ ＭＥＡＳＵ『ＲＥＳ：Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ血ｅ ＣＤ１３３ ａｎｄ
Ｎｅｓｔｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＢＴＳＣＳ． ＲＥＳＵＬＴＳ：Ａ ｃｅｒｔａｉｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｇｌｉｏｍａ ｔｉｓｓｕｅ ｈａｄ ｔｈｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｔｏ ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｆｌｅｅ—ｆｌｏａｔｉｎｇ ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ—ｌｉｋｅ ＢＴＳＣｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ．Ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅｕｓ ｗａｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｂｉｇｇｅｒ，ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ—ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｒａｔｉｏ ｗａｓ ｈｉｇｈ，ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ—ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅｓ，ｄａｕｇｈｔｅｒ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｆｒｏｍ ＢＴＳＣｓ ｗｅｒｅ ｐａｒｔｌｙ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｗｉｔｈ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｂｏｔｈ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｐａｓｓａｇｅｄ ＢＴＳＣｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ＣＤ１３３ ａｎｄ Ｎｅａｔｉｎ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｔＷＯ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｎｅｒｖｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：Ｔｕｍｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｇｌｉｏｍａ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｎ ｂｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ａｎｄ ｔｈｅｙ ｃａｎ ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗ，
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓ ＣＤ１３３．
Ｐａｎ ＺＧ Ｌｉｕ ＷＤ，Ｊｉａｎｇ Ｌ，Ｙｕｅ ＹＪ，Ｃａｉ Ｗ，Ｙａｎｇ Ｊ，Ｘｕｅ ＡＬ，Ｌｉｕ ＨＳ．Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａｔｉｓｓｕｅｉｎ ｖｉｔｒｏ．ＺｈｏｎｇｇｕｏＺｕｚｈｉＧｏｎｇｃｈｅｎｇＹａｎｊｉｕ ｙｕＬｉｎｃｈｕａｎｇＫａｎｇｆｕ２００８；１２（５１）：１００５５—１００５８ ［ｈｔｔｐ：Ｈｗｗｗ．ｃｒｔｅｒ．ｃｎ ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ】
摘要 背景：有研究者提出，脑内存在少量正常的神经干细胞能够向肿瘤组织迁移。这需要对从胶质瘤体外培养得到的肿瘤干细
胞与正常的神经干细胞进行鉴别。 目的：从人脑胶质瘤组织中分离脑胶质瘤干细胞进行体外培养，并对其干细胞特性加以鉴定，观察脑肿瘤干细胞的生长特 性。 设计、时间及地点：细胞学观察实验，于２００７—０２／１２在解放军第四军医大学细胞工程研究中心完成。 材料：７份肿瘤标本来源于胶质瘤患者，问变性星形细胞瘤标本３份，多形性胶质母细胞瘤标本４份。 方法：将获取的胶质瘤细胞置于含２％Ｂ２７、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、左旋谷胺酰氨、胰岛素、青霉 素和链霉素生长因子的无血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基中，重新悬浮为单细胞悬液，以１×１０ Ｌ。接种于含有Ｂ２７、表皮细胞生 长因子及碱性成纤维细胞生长因子的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基中培养分离培养肿瘤干细胞球。取第５代的肿瘤干细胞球，离心后 除去原培养基，用含有体积分数为０．１０胎牛血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基接种于放置有多聚赖氨酸包被盖玻片的小平皿中，观 察肿瘤干细胞分化情况。 主要观察指标：利用细胞免疫荧光及组织免疫组织化学法检测脑肿瘤干细胞在细胞培养或组织切片中ＣＤ１３３及巢蛋白表达。 结果：在胶质瘤中存在一定量的细胞能在无血清培养基中存活并悬浮生长，并增殖形成克隆性脑肿瘤干细胞球，细胞核较 大，核质比例高，具有肿瘤细胞的特性，与原肿瘤组织标本的苏木精一伊红染色比较，肿瘤干细胞分化后的子代细胞中大部 分与胶质瘤细胞相似。原代及传代脑肿瘤干细胞表达神经干细胞的特异性标志物巢蛋白和ＣＤ１３３。 结论：人脑胶质瘤中存在一定量的肿瘤干细胞，并能在体外将其分离培养，能够自我更新增殖、诱导分化，表达神经干细
胞标志物ＣＤ１３３。 关键词：肿瘤干细胞：分离培养；鉴定；胶质瘤
潘志刚，刘文超，江澜，岳亚军，蔡伟，杨剑，薛安林， 组织工程研究与临床康复，２００８，１２（５１）：１００５５—１００５８
ＩｓｓＮ ｊ６７３．８２２５ ＣＮ ２１．１５３９，Ｒ ｃｏＤＥＮ：ＺＬＫＨＡＨ 刘汉山．人脑胶质瘤中肿瘤干细胞的体外培养及生物学特性ｆＪ］．中国 ［１１ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｔｅｒ．ｏｒｇ ｈｔｔｐ：／／ｃｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ］
Ｄｅｏａｍｎｅｎｔｏｆ Ｍｅｄｉｃ￣Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａ１ ０ｆ Ｊｉａｎｇｓｕ Ａｒｍｅｄ Ｐｏｌｉｃｅ Ｆｏｒｃｅｓ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ ２２５００３，Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ； Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｘｉｊｉｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ＰＬＡ．Ｘｉ’ａｎ ７１００３２． Ｓｈａａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ． Ｃｈｉｎａ
Ｐａｎ Ｚｈｉ—ｇａｎｇ★． Ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｆｏｒ ｍａｓｔｅｒ’ｓ ｄｅｇｒｅｅ，Ａｔｔｅｎｄｉｎｇ ｐｈｙｓｉｃｉａｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＭｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｏｆ Ｊｉａｎｇｓｕ Ａｒｍｅｄ Ｐｏｌｉｃｅ Ｆｏｒｃｅｓ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ ２２５００３，Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｃｈｉｎａ ｘｗｚｄｇｓ＠１２６ ｔｏｍ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ｔＯ：Ｌｉｕ Ｗｅｎ－ｃｈａｏ，Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ， Ｃｈｉｅｆｐｈｙｓｉｃｉａｎ， Ｄｏｃｔｏｒａｌ ｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｘｉｊｉｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＣｈｉｎｅｓｅ ＰＬＡ．Ｘｉ’ａｎ ７ｌ００３２． Ｓｈａａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ
无血清培养基分离并鉴定U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞
无血清培养基分离并鉴定U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞摘要】目的应用无血清培养基分离U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞，并鉴定相关肿瘤标志物表达。
方法体外培养人骨肉瘤U2OS细胞株和U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞，免疫荧光检测U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞球中CD105表达。
采用免疫印迹法检测人骨肉瘤U2OS细胞株和U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞Nanog和Oct4蛋白表达。
采用半定量PCR检测人骨肉瘤U2OS细胞株和U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞SOX2、Nanog和Oct4 mRNA的表达。
结果荧光显微镜下可见，U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞球中部分细胞CD105呈阳性表达。
免疫印迹检测结果显示人骨肉瘤U2OS细胞株的Nanog和Oct4蛋白相对表达量为0.853±0.404和0.603 ±0.153，均明显低于U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞0.973±0.305 和0.827±0.322（均p<0.05）。
半定量PCR检测结果显示U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞SOX2、 Nanog和Oct4 mRNA的相对表达量为0.190±0.027、0.178±0.025、0.170±0.021，均明显高于人骨肉瘤U2OS细胞株0.032±0.009、0.086±0.016、0.019±0.006（均p<0.05）。
结论人骨肉瘤U2OS细胞株中存在肿瘤干细胞，无血清培养可用于分离培养人骨肉瘤肿瘤干细胞。
【关键词】骨肉瘤骨肉瘤干细胞无血清培养基悬浮培养【中图分类号】R730 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）31-0073-02骨肉瘤是一种起源于间叶组织的恶性肿瘤，多见于青少年。
是恶性程度最高的肿瘤之一[1] 。
尽管化疗结合手术的新型治疗方法改善了患者预后，但骨肉瘤患者在联合化疗时耐药患者的比例高于30%[2, 3] ，对于已转移的骨肉瘤，生存率并没有得到显著的提高，患者长期存活率只有65%左右。
卵巢癌干细胞相关表面分子机制研究进展
７和４３０６．发现其致瘤性显著高
于ＮＳＰ（非ＳＰ）．前者７．５×１０５细胞７周 全部成瘤．后者相同细胞数１１周才部分 形成肿瘤。在卵巢癌患者癌组织中分离的 ＯＶＣＡＲ３、ＩＧＲＯＶ－１、ＳＫ．ＯＶ．３三系细胞均 含有ＳＰ细胞．患者腹水中ＣＤ４５－／ＣＤ３１。 细胞也有ＳＰ细胞：进一步分析其表面分 子标记，发现在人和鼠ＳＰ细胞中ＣＤ４５、 ＣＤ３１阴性；只有鼠高表达ｃ．ｋｉｔ／ＣＤｌ １７， 而人ＳＰ和ＮＳＰ均不表达ＣＤｌｌ７：鼠ＮＳＰ 高表达ＣＤ４４．而大多数人卵巢癌细胞不 表达该分子：可以看出鼠和人ＳＰ细胞表 面分子表达不一样。由于ＢＣＲＰ．１可泵出 一些亲脂性的化疗药如阿霉素等．使得 ｓＰ细胞耐药性较ＮＳＰ强．不易从体内清 除，且易复发。同时研究发现副中肾管抑 制物质（ＭＩＳ）对鼠ｓＰ和ＮＳＰ细胞在试管 内均有抑制作用，尤其对ｓＰ细胞抑制作 用远远高于传统化疗药如阿霉素等，可能 与作用于ＢＲＣＰ－Ｉ有关。所以ＭＩＳ与其他
卵巢癌组织中强致瘤性细胞２００５
年Ｂａｐａｔ等［５］从一位６３岁四期卵巢癌患 者腹水中取得肿瘤组织，分离得到原代卵
作者单位：２２３００２上海交通大学第六人 民医院妇产科
万方数据
塞旦医堂盘查２堂生箜踅鲞笙！鱼塑
表现为低甲基化和非甲基化状态．部分的 揭示了ＣＤｌ３３形成的机制。 ３．２卵巢癌中具有ＯＣＩＣｓ特性细胞的分 离及其作用机制２００８年Ｚｈａｎｇ等［１０］分 离了人卵巢癌中自我增殖的ｓＰ细胞，该 细胞移植后能在动物体内增殖出与原肿 瘤相同的肿瘤。只要１００个ＣＤ４４＋ＣＤｌ
Ｎｏｔｃｈ－１、Ｎａｎｏｇ、ｎｅｓｔｉｎ、ＡＢＣＧ２和Ｏｃｔ－４
等的高表达证实了其干细胞样特性。 Ｂｏｕｒｇｕｉｇｎｏｎ等…］研究了ＣＤ４４的作 用机制．在人乳腺癌和卵巢癌中对透明质 酸（ＨＡ）介导的ＣＤ４４和胚胎干细胞转录 因子（Ｎａｎｏｇ）的相互作用进行了研究，ＨＡ 是细胞外基质中一种主要的氨基葡聚糖． 与多药耐药和肿瘤生长紧密相关。使用特 异性的引物通过逆转录ＰＣＲ扩增Ｎａｎｏｇ． 检测到了两种肿瘤中均有Ｎａｎｏｇ的转录 表达。此外还发现ＨＡ与肿瘤细胞结合促 进了ＣＤ４４对Ｎａｎｏｇ的作用．即促进 Ｎａｎｏｇ活化和多潜能十细胞调节子Ｒｅｘｌ 和Ｓｏｘ２的表达。Ｎａｎｏｇ可以与转录蛋白一 ３信号传导和激活子（ＳＴＡＴ．３）在细胞核 内形成复合物．引起ＳＴＡＴ．３特异性激活 和多药转运蛋白ＭＤＲｌ（多药耐药）基因 的表达。而且还观察到ＨＡ和ＣＤ４４互相 作用可以使锚蛋白和ＭＤＲｌ相连接使化 疗药物如阿霉素和紫杉醇从细胞内泵 出，并引起这些肿瘤细胞耐药。通过 ＮａｎｏｇｃＤＮＡ转染肿瘤细胞引起Ｎａｎｏｇ过 表达，引起了ＳＴＡＴ．３的转录激活、ＭＤＲｌ 过表达和多药耐药。相反通过转染肿瘤 细胞反义ＮａｎｏｇＲＮＡ，不但抑制了ＨＡ／ ＣＤ４４介导的肿瘤特性而且提高了化疗 的敏感性，可见ＣＤ４４与肿瘤耐药有一定 关系。 研究发现具有卵巢癌干细胞特性的 表面分子标记很多如ＣＤｌ３３、ＣＤ４４、 ＣＤｌ７７等．研究肿瘤干细胞特性必须要 研究其特异性分子标记的具体作用机 制，两者密不可分，只有弄清其作用机制 才能更精确地进行高效治疗．而目前研 究较多的是ＣＤｌ３３．下面对其具体作用 做一概述。
鼻咽癌干细胞研究进展
达不同种类的ＡＴＰ结合盒（Ａ１１Ｐ．ｂｉｎｄｉｎｇ
ｃａｓｓｅｔｔｅ，ＡＢＣ）转运蛋白，如ＭＤＲｌ和ＢＣＲＰ 等，导致其对化疗药物天然抵抗和放射敏 感性差。ＳＰ细胞及ＳＰ细胞亚群已作为干 细胞深入研究的有力工具．为实体瘤千细 胞的研究和寻找特异性分子标志物提供 了重要途径。２００７年Ｗａｎｇ等１１１１利用 ＣＮＥ２鼻咽癌细胞分选出ｓＰ细胞．并迸 一步研究证实了此ＳＰ具有干细胞特性． 在体内具有强致瘤性、抵抗放化疗作用。 且免疫荧光分析ＣＫｌ９在ＳＰ细胞和ＮＳＰ 细胞的表达分别为１４．５％和５．０％（尸＜ ０．０５）。表明ＣＫｌ９可能为鼻咽癌干细胞 的特异性分子标记物。 ２．２．３分选ＣＤｌ３３＋细胞ＣＤｌ３３是一种 新鉴定的特征性干细胞表面抗原．其显 著特点是其表达随着细胞的分化迅速下 调。Ｓｉｎｇｈ等ｌ，Ｉ首先以ＣＤｌ３３为分子标志 从一系列脑肿瘤分离出ＴＳＣ。发现 ＣＤｌ３３＋细胞具有显著的增殖能力、自我 更新能力和多向分化能力：将少至１００ 个ＣＤｌ３３＋细胞接种到ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠脑 组织就能形成与原发肿瘤表型相同肿 瘤．而ＣＤｌ３３一细胞多达ｌ×１０５个细胞亦 不能形成肿瘤。随后以ＣＤｌ３３为分子标 志从前列腺ｆ１２１、肝癌【１３１、结肠癌１１４】中分离 出了ＴＳＣ。近来有研究者发现，在舌癌、 喉癌、口底癌和上颌窦癌等头颈部鳞癌 肿瘤组织中仅占细胞总数１０％以下的 ＣＤｌ３３＋细胞能在体外培养条件下形成肿 瘤细胞球以及裸鼠体内形成移植瘤，
ＣＤｌ ３３‘细胞则没有这种能力【一７】。２００８年
［Байду номын сангаас１］Ｗａｎｇ
Ｊ，Ｃ，ｕｏ Ｌ Ｐ。Ｃｈｅｎ Ｌ ｚ，ｅｔ ａ１．
ｃａｎｃｅｒ
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｃｅｌｌｓ
肿瘤相关成纤维细胞的生物学特征及Transwell共培养对胃癌细胞生长和
-1582-中国药理学通报Chioese Pharmacological Bulletin2019Nov；35(11)：1582~9网络出版时间：2019/10/2816:14网络出版地址：htt p：//kd neAkcms/deCil/34.1086.r.20191024.1434.038.html肿瘤相关成纤维细胞的生物学特征及Transwell共培养对胃癌细胞生长和转移的影响邵久针"，王颖锤1"2仰鑫1，许尤琪3，沈明勤"(1.南京中医药大学附属中西医结合医院中药药理毒理实验室，江苏南京210028；2.江苏省中医药研究院中药药理毒理实验室，江苏南京210028；3.江苏省第二中医院肿瘤科，江苏南京210008)dW：10.3969//imn.1001-1978.2019.11.019文献标志码:A文章编号：1001-1978(2019)11-1582-08中国图书分类号:R322.44；R329.24；R73-35；R735.202.2摘要：目的培养原代人胃癌相关成纤维细胞#cancer ww-ciated fibobOsts，CAFs)和正常成纤维细胞(normal fibo-blwy/NFW，探究生物学特性及对胃癌细胞影响。
方法CAF-和NFs分离培养后，MTT法绘制生长曲线，免疫荧光法、WoCm bO-、qRT-BCR检测a-SMA和Vimentin表达。
MGC—03与CAFs、NFs进行Transwell共培养，Transwell法检测胃癌迁移和侵袭,MTT法比较细胞活力及AMD3100影响，pH计、乳酸酶法、DCFHNA法测定共培养体系酸化、乳酸及活性氧(ROS)含量’结果CAFs、NF呈长梭形、多角形等，CAFs增殖和重叠生长现象均高于NFs°CAF s细胞a-SMA 和Vimentin为阳性表达，而NF s为低表达或阴性’胃癌细胞活力低密度共培养组>中密度组>高密度组，CAFs共培养体系出现pH值降低，乳酸、ROS含量高现象,且只有CAFs-低密度共培养组促癌效果明显’结论胃癌细胞与CAFs、收稿日期:2019-06-12,修回日期:2019-08-10基金项目：江苏省自然科学基金资助项目(No BK20161605)；江苏省研究生科研与实践创新计划项目(No SJCX19.0343)作者简介:邵久针(1994-)，女,硕士生，研究方向：肿瘤药理学，E-mail:935625337@；沈明勤(1963-)，男，研究员，硕士生导师，研究方向：中药药理学，通讯作者,E-mail:；王颖锤(1985-),女，硕士，助理研究员，研究方向：细胞药理学，通讯作者,E-mail:wyy9260@oeauiophago/omeand miiochondeiaweeeob/eeeed by e.ecieon miceo/copy，and ihe eegu.aioey mo.ecu.ae mechankm of HCQ combined with BEV w/s revealed by transcnpCmo sequenciny(RNA-seq).只£5^1 Compared with singio dmy youps,tho combination of HCQ and BEV cou.d syneegisiica.y inhibii HUVECproliferation,pomoia HUVEC apoptosis,and inhibil ih3eoemaiion oeeascu.aesieuciuesin HUVECs.HCQ could inhibit duNphdyy of HUVECs.Transcnptomo so-quenciny results showed tU/i Co cambination of HCQ and BEV influocO69dikeoni expressed yenos,and NFs共培养受比例影响较大，低密度共培养更能明显提高胃癌细胞的增殖和迁移能力，而高密度共培养可能会反过来抑制肿瘤细胞的增长和转移，可能与乳酸、ROS含量有关’关键词：胃癌;肿瘤相关成纤维细胞;原代培养；Transwell共培养;异质性;反Warburg效应胃癌是常见的恶性肿瘤，位于全球发病率第5位、死亡率第3位，而我国属胃癌高发国家,发病与死亡例数约占世界的50%,是癌症防治的重点［1］o 癌症的演化过程中，肿瘤细胞会积极募集成纤维细胞等基质细胞,营造低氧高酸性的肿瘤微环境,对肿瘤的发生、增殖、转移和凋亡具有重要的调节作用［2］。
miltenyi biotec(德国美天旎生物公司)CD133相关专利产品
CD133是近年在干细胞领域研究较为活跃的细胞膜糖蛋白之一,常表达于未成熟的造血干细胞或祖细胞,新近有报道认为它在脑肿瘤、前列腺癌、小鼠的Lewis肺癌、B16黑色素瘤的干细胞中均有表达,已被认为是这些肿瘤干细胞的标志之一。
miltenyi biotec（德国美天旎）拥有CD133全系列的全球专利。
美天旎部分CD133：一.CD133的分子结构人CD133抗原为5次跨膜糖蛋白，目前发现的同源性抗原有CD133_1和CD133_2，其基因分别定位在人类的4号和2号染色体上，分析CD133的基因结构发现，CD133_1基因至少含有27个外显子，CD133_2基因比CD133_1基因少1个27 bp的4号外显子。
CD133_1抗原cDNA全长为3 794 bp，其中5′端有37 bp的非翻译区，3′端有1 159 bp的UTR，中间为2 598 bp的开放阅读框，编码865个氨基酸的蛋白。
转录起始密码子ATG位于38bp 处，ATG之后还有一编码19个氨基酸的信号肽序列,终止密码子位于第2 763位,第3 906核苷酸处有一长20 bp的polyA序列。
CD133_1与CD133_2的相对分子质量分别为120 KD 和112 KD，CD133_2由含856个氨基酸的肽链组成，比CD133_1少9个位于E1区的氨基酸[2]。
在发现人CD133的同年，在小鼠中也发现了CD133_1的同源性抗原并命名为Prominin_1，二者具有60％的相似结构，之后，成功克隆出Prominin_2，与Prominin_1和人CD133分别有29％和26％的相似结构，认为是Prominin_1的同源性抗原。
CD133的功能目前尚不清楚，存在于C端的酪氨酸暗示它可能是通过酪氨酸残基磷酸化作用而发挥级联效应的生长因子受体。
二. CD133阳性的肿瘤干细胞利用某些干细胞标志物与肿瘤细胞标志物相结合的方法确定肿瘤干细胞特异性的标志物，是当前肿瘤干细胞筛选的主要手段。
肿瘤干细胞及黑素瘤干细胞的研究进展
关键词 ：
中 图分 类 号 ： ７ ９５ Ｒ ３．
文 献 标识 码 ： Ａ
文章 编 号 ：６ ２ ０ ０ （０ ７ ０ － ｌ ８ ０ １ ７ － ７长在 特定 的微 环境 ，并 具 有正 常分 化潜 能 的重 要条件 。 不 同类 型的成 体 干细胞 增 殖 、 化 能力不 同 。 分 在 早期 胚胎 发育 过程 中 ， 干细 胞对 称性 分 裂 ， 因此 每个 子代 细胞 保持 亲代 细胞 的特 性 。而 成体 干细 胞 为非 对称 性分 裂 ， 中一个 子代 细胞 保持 亲代 细胞 特 性 ， 其 另一 个发 生分 化 。 间质干 细胞 是正 常组 织更 新 主要 的细 胞来 源 。骨髓 中的干 细胞 ， 能够 发 生终 末分 化 ，
态 下 无 限增 殖 ， 无 限复 制 寿命 ， 主 要 是 由于 其 有 这
和空 间上 默契 。细 胞 间直接 作用 在早 期 胚胎 发 育三 胚 层形 成 过程 中的调节 作用 尤 为突 出 。③细 胞 外基 质 的调控 作用 ，首 先细 胞外 基质 对 干细 胞有 结 构和 功能 上 的支持 作用 ， ： 如 上皮 组织 中的角 化上 皮 干细 胞 ，骨髓 中的造 血 干 细胞等 均 由细胞 表 面 的黏 附分
影 响 ，从 而在 生物 学行 为方 面 与周 围细胞 达 到 时 间
根 据 干 细胞 的来 源 及 分 化 潜 能 将 干 细 胞 分 为
胚 胎 干 细胞 （ｍｂｙ ｎ ｌ ｔ ｃｌ， Ｓ ） 生 殖 干 细 胞 ｅ ｒｏ ａ ｓ ｍ ｅ Ｅ ｃ 、 ｅ ｌ
（ｅｍｎ ｌｔ ｃｌ 和 成 体 干 细 胞 （ｄｌｓ ｍ ｃｌ 。 ｇｒ ｉａ ｅ ｅ ） ｓ ｍ １ ａｕｔｔ ｅ ） ｅ １ Ｅ ｃ 源 于囊 胚 内细胞 团 ， Ｓ来 是一 种 高度 未 分化 细胞 ， 它具 有 发 育 的全 能性 ， 能分 化 出成 体 的所 有组 织 和 器官 ， 括生 殖细 胞 。在 体外 ， Ｓ 能 够 在未 分化 状 包 Ｅｃ
神经干细胞体外培养技术
神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。
文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。
此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。
根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。
基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。
本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。
二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLINGCORP，BATON ROUGE，LOUISIANA，Made in USA）0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。
（二）试剂1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。
中国中枢神经系统胶质瘤免疫和靶向治疗专家共识(最全版)
中国中枢神经系统胶质瘤免疫和靶向治疗专家共识（最全版）脑胶质瘤是指起源于神经胶质细胞的肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤之一。
其中胶质母细胞瘤(GBM)的发病率最高，占全部胶质瘤的46.1%，年发病率约为3.20/10万。
包括最大程度手术切除、术后辅助同步放化疗和化疗(替莫唑胺：TMZ)在内的现代综合治疗，仅能延缓胶质母细胞瘤的进程，肿瘤不可避免地复发。
中位的进展时间6.9个月，总生存期14.6个月，治疗效果并不理想，急需开拓新的治疗策略。
靶向治疗主要是针对已经明确的肿瘤细胞致癌位点，从基因到蛋白分子水平，从而诱发肿瘤细胞的特异性死亡。
靶向治疗后的细胞反应可以引起或不引起相应的机体抗肿瘤免疫反应。
肿瘤免疫治疗是应用免疫学原理和方法，提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和效应分子输注宿主体内，协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长。
最近研究证实，中枢神经系统(CNS)存在淋巴管和活跃且被严密调控的免疫系统[1]，打破了中枢神经系统是"免疫豁免(immune privileged)"区的传统认识，同时GBM的生长可以破坏血脑屏障的紧密性，有利于淋巴细胞进出脑组织[2]；即便是血脑屏障完整，淋巴细胞在趋化因子的作用下也可穿过血脑屏障[3]。
这些为脑GBM的免疫治疗提供理论依据。
随着对CNS免疫系统的重新认识、以及免疫治疗在其他实体肿瘤领域取得重大成果，脑胶质瘤免疫治疗已经成为一种极具潜力的治疗方式。
并且，从整个肿瘤的领域来看，随着肿瘤免疫学机制的逐渐阐明，在未来的几十年内，肿瘤的治疗策略将从以肿瘤为中心转向以患者(包括免疫系统)为中心。
为规范和提高胶质瘤的免疫治疗和靶向治疗，中国医师协会脑胶质瘤专委会和上海抗癌协会神经肿瘤分会牵头，组织国内有关专家，经反复讨论和修改，首次制订了《中国中枢神经系统胶质瘤免疫及靶向治疗专家共识》(以下简称共识)，供广大临床医务工作者参考和应用，希望能有助规范和推动我国胶质瘤的治疗，最终造福于广大患者及其家属。
神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法、培养基及用途
神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法、培养基及用途神经干细胞是具有自我更新和分化成多种细胞类型能力的多能干细胞。
神经干细胞分化为少突胶质细胞是近年来研究的热点之一。
少突胶质细胞是一种类似于星形细胞的神经胶质细胞，在神经系统中起着很重要的支持作用。
在临床应用方面，少突胶质细胞的作用同样非常重要。
在这篇文章中，我们将会讨论神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法、培养基及其用途。
神经干细胞分化主要分为两种方法：自然分化和向导分化。
自然分化是指在无添加外源性因素的情况下，神经干细胞随机分化为不同种类细胞。
而向导分化是指在添加一定的外源性因素的帮助下，神经干细胞有选择性地分化为特定种类的细胞。
目前，神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法主要采用向导分化方法。
向导分化方法主要包括以下几种方式：1.小分子化合物诱导小分子化合物是一种可以促进神经干细胞分化的化学物质，通过添加小分子化合物，可以促进神经干细胞向少突胶质细胞的分化。
例如，添加化合物可溶性文件夹（SB431542）可以促进神经干细胞向少突胶质细胞的分化。
2.神经营养因子诱导3.基质分子诱导4.遗传学方法遗传学方法通常采用基因转染的方式，通过转染一些特定的DNA/RNA到神经干细胞中，可以促进其向少突胶质细胞分化。
例如，转染SOX9和PAX6基因可以使神经干细胞向少突胶质细胞分化。
神经干细胞分化需要一种特殊的培养基，称为神经分化培养基。
神经分化培养基的成分复杂，包括不同种类的营养物质、生长因子和基质分子。
不同的培养基成分会影响分化的种类和分化效率。
目前，常用的神经分化培养基包括：1. DMEM/F12：Dulbecco的最小必需培养基/12号哈弗地球村培养基2. 人血清/胎儿牛血清/N2/B27补充因子：这些成分可以为细胞提供必需的蛋白质和营养物质3. 滑膜糖蛋白（CSPG）：CSPG可以促进神经分化4. 神经营养因子（NT-3和BDNF）：NT-3和BDNF可以促进神经分化5.基底板（FN）和羟乙基甲基丙烯酸（HEMA）：这些基质分子可以为细胞提供粘附环境，从而促进神经分化。
人白血病细胞系KG_1a中肿瘤干细胞样亚群细胞的初步研究
收稿日期： ２００８－０１－１７ 接受日期： ２００８－０４－０９ 重庆市教委科学技术研究基金资助项目（Ｎｏ．ＫＪ０５０３０９） ﹡通讯作者。Ｔｅｌ／Ｆａｘ： ０２３－６６７８５３９０， Ｅ－ｍａｉｌ： ｃｑｕｍｓｚｈｌ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
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·研究论文·
流式细胞仪（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）测定。实验结果经配 套周期分析软件分析， 计算出细胞周期的分布。 １．２．４ 免疫细胞化学和流式细胞术检测ＣＤ３４表面 分子表达 免疫细胞化学采用ＳＡＰ法， 具体步骤 为：取对数生长期 ＫＧ－１ａ 细胞， 吹打混匀后用 ＰＢＳ 洗涤３次， 制成单细胞悬液（１０６ 个／ｍｌ）后离心涂片。 ４％ 多聚甲醛固定 ３０ ｍｉｎ， ＰＢＳ 洗涤 ３ 次， １０% 正常 羊血清封闭， 室温放置１０ ｍｉｎ， 甩片后加鼠抗人ＣＤ３４ 一抗４ ℃温育过夜， ＰＢＳ洗涤３次， 加生物素标记二 抗３７ ℃温育３０ ｍｉｎ， ＰＢＳ洗涤３次， 加碱磷酶标记链 霉素卵白素３７ ℃温育３０ ｍｉｎ， ＰＢＳ洗涤３次， 加ＤＡＢ 显色５ ｍｉｎ， 自来水冲洗， 苏木素复染２ ｍｉｎ， 自来水冲 洗， 凉干封片， 于光学显微镜下观察， 细胞膜和胞浆着 红色， 胞核着蓝色为 ＣＤ３对照。
摘要 探讨人白血病细胞系 ＫＧ－１ａ 中是否存在具有肿瘤干细胞样生物学特性的亚群细胞。 瑞氏染色和吖啶橙染色分别观察白血病细胞系 ＫＧ－１ａ 细胞形态和 ＲＮＡ 含量； 流式细胞术检测细胞 周期分布； 免疫组化和流式细胞术检测 ＫＧ－１ａ 细胞 ＣＤ３４ 的表达； 流式细胞术检测 ＣＤ３４＋ＣＤ３８– 亚 群细胞； 烟酸己可碱Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色后用荧光显微镜观察ＫＧ－１ａ细胞中侧群（ｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ， ＳＰ） 样细胞所占比例。结果显示， 白血病细胞系 ＫＧ－１ａ 细胞核仁易见， 形态原始； 部分细胞 ＲＮＡ 含量 低， 细胞处于 Ｇ０／Ｇ１ 期的比例占 １５．５％。绝大多数细胞的胞浆和胞膜皆表达 ＣＤ３４ 抗原， ＫＧ－１ａ 中 ＣＤ３４＋ 细胞占 ９６．３％， ＣＤ３４＋ＣＤ３８– 亚群细胞占 ７．０２％； ＳＰ 样细胞大致比例为 ７．６０％。本研究表明， 人白血病细胞系 ＫＧ－１ａ 中存在具有肿瘤干细胞样生物学特性的亚群细胞。