pCS-CG-DsRed2-vigilin重组载体的构建及vigilin重组慢病毒包装

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第三代慢病毒高效率包装系统的建立

基因组学与应用生物学，第第第2009 年，28 卷， 2 期，326－330 页Genomics and Applied Biology 2009 Vol.28 No.2 326－330实验技术与方法Techniques and Methodology第三代慢病毒高效率包装系统的建立张磊刘庆友胡天张晓溪崔奎青陆凤花石德顺广西大学动物繁殖研究所南宁530005 同等贡献作者通讯作者摘要慢病毒介导法是最有前途的转基因动物生产方法之一，高滴度慢病毒颗粒的包装是慢病毒转基因动物技术的关键。

本研究应用含有增强型绿色荧光蛋白基因eGFP的第 3 代慢病毒载体系统，用脂质体转染法将慢病毒系统4 质粒共转染293T 包装细胞，培养4872 h 收集病毒上清液，通过超速离心进行浓缩，采用批量快速测定法LaSRT测定病毒滴度。

结果显示，用脂质体转染法包装的慢病毒能成功地感染293T 细胞，经检测病毒滴度达到5×108 IU/mL 以上，初步建成了高滴度慢病毒包装平台，为慢病毒介导制作转基因动物奠定了良好的研究基础。

关键词慢病毒病毒包装转基因动物The Construction of High-efficiency Packaging System of the 3rd LentivirusZhang Lei Liu Qingyou Hu Tian Zhang Xiaoxi Cui Kuiqing Lu Fenghua Shi Deshun Animal Reproduction Institute Guangxi University Nanning 530005 The authors who contribute equally Corresponding author DOI：10.3969/gab.028.000326Abstract Lentivirus-mediated method is one of the most promising methods of producing transgenic animalshigh-titer lentiviral particles packaging is the key of lentivirus-mediated transgenic animal technology. In this study293T cells were co-transfected with four plasmids which are the 3 rd generation of lentiviral vector systems contain-ing enhanced green fluorescent protein gene eGFP using the Lipofectamine 2 000 mediated transfection method.Virus supernate was collected after 4872 hours and then concentrated by ultracentrifuge.Large-scale real-timetitration LaSRT was applied to test the titer of virus. The results showed that 293T cells could be successfully in-fected by the virus packaged using Lipofectamine-mediated transfection as evidenced of that the virus titer reachedhigher than 5 ×108 IU/mL indicating that a high-titer lentiviral packaging platform was preliminary estabilished.This result will be beneficial for the further study of producing transgenic animal by lentivirus-mediated method.Keywords Lentivirus Virus packageing Transgenic animals 慢病毒lentivirus属于逆转录病毒科Retrovi - 邓继先和沈伟2004。

前列腺特异抗原3慢病毒表达载体的构建与包装

《中国癌症杂志》2013年第23卷第11期 CHINA ONCOLOGY 2013 Vol.23 No.11857前列腺特异抗原3慢病毒表达载体的构建与包装刘晓军1　王娜2　姚旭东1　曹达龙11.复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032；2.复旦大学附属肿瘤医院肿瘤研究所，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032 ［摘要］　背景与目的：前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3，PCA3)作为一种长链非编码RNA(lncRNA)已被证实在前列腺癌中高度特异性表达，暗示其可能在前列腺癌中发挥重要作用，为深入研究，我们将完整的PCA3基因转入真核表达载体，并构建慢病毒包装系统。

方法：从前列腺癌细胞株LNCaP细胞中提取总RNA，运用重叠延伸方法扩增到PCA3基因，测序正确后定向接入真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，酶切鉴定并测序正确后进行慢病毒包装和滴度测定。

结果：经PCR鉴定及测序，PCA3表达质粒序列与Gene Bank 序列进行Blast比对分析，同源性为99.8%，PCA3慢病毒滴度测定为2×108。

结论：PCA3成功插入真核表达载体并完成了慢病毒包装，为深入研究PCA3基因在前列腺细胞中的作用奠定了基础，进而为探索前列腺癌的治疗提供了新的途径。

［关键词］　前列腺癌；前列腺癌抗原3；真核表达载体；慢病毒 DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.11.001 中图分类号：R737.25 文献标志码：A 文章编号：1007-3639(2013)11-0857-06Construction of eukaryotic expression vector and package of lentivirus vector encoding prostate cancer antigen 3 LIU Xiao-jun 1, WANG Na 2, YAO Xu-dong 1, CAO Da-long 1 (1.Department of Urology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College Fudan University, Shanghai 200032, China; 2.Department of Cancer Institute, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College Fudan University, Shanghai 200032, China)Correspondence to: YAO Xu-dong E-mail: yaoxudong67@ ［Abstract ］ Background and purpose: The increased of specific expression of prostate cancer antigen 3 (PCA3), as one of long non-coding RNA, has been observed in prostate cancer, indicating that PCA3 may contribute to the development of prostate cancer. To further study its roles in prostate cancer, we construct a lentivirus expression vector carrying the whole PCA3. Methods: PCA3 was amplified from prostate cancer cell line LNCaP by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). After the sequence was proved to be correct, we recombined the pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-PCA3. After transformation into E.coli cells, the candidate clones were identified by PCR amplifying, restricting enzyme digestion analysis and DNA sequencing, and the viral titer was determined. Results: Through the Blast analysis software, we compared the results of PCA3 sequence amplified by PCR with GeneBank sequence, finding that the homology is 99.8%. The lentivirus vector was constructed successfully, and the virus in the supernatant reached a titer of 2*108. Conclusion: The successful construction of the lentivirus vector encoding PCA3 not only lays the foundation for the further research into the effect of PCA3 gene on the prostate cancer but also provides a new therapy for advanced prostate cancer.　［Key words ］ Prostate cancer; Prostate cancer antigen 3; Eukaryotic expression vector; Lentivirus基金项目：国家自然科学基金(No：81272836)；上海市科学技术委员会上海市自然科学基金(No：11ZR1407400)；上海市科学技术委员会上海市医学引导类项目(No：114119a4200)。

视锥视杆细胞同源盒基因的慢病毒载体的构建

２０１２年８月第６卷第１５期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｕｇｕｓｔ　１，２０１２，Ｖｏ１．６，Ｎｏ．１５　视锥视杆细胞同源盒基因的慢病毒载体的构建　李伟　高玲卢光跨刘刚　王建周民稳　【摘要】　目的构建视紫红质启动子（ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ，ｎｈｏ）驱动的、大鼠视锥视杆细胞同源盒基因（ｃｏｎｅ－ｒｏｄ　ｈｏｍｅｏｂｏｘ　ｇｅｎｅ，ＣＲＸ）为目的基因的重组慢病毒载体ＬＶ—Ｒｈｏ—ＥＧＦＰ／ＣＰ，＿Ｘ，研究其在体外的转染效率。　方法用ＰＣＲ法扩增质粒ｐＥＧＦＰ—Ｃ３／ＣＲＸ中的ＥＧＦＰ／ＣＲＸ基因片段，取代慢病毒载体ＬＶ—Ｒｈｏ—ＥＧＦＰ中的　ＥＧＦＰ片段，构建表达载体ＬＶ－Ｒｈｏ－ＥＧＦＰ／ＣＲＸ，经酶切和双向测序验证。用磷酸钙沉淀法四质粒共转染２９３Ｔ　细胞，包装、收集病毒，利用有限稀释法测定病毒滴度。用慢病毒原液感染光感受器细胞来源的人视网膜母　细胞瘤细胞株ＨＸＯ－ＲＢ　，观察感染情况。结果成功构建慢病毒表达载体ＬＶ—Ｒｈｏ—ＥＧＦＰ／ＣＲＸ，产生的慢病　毒滴度为２×１０　ＩＵ／ｍｌ，感染４８　ｈ后，ＨＸＯ．ＲＢ　细胞内可见强弱不等的绿色荧光。结论重组载体ＬＶ—Ｒｈｏ－　ＥＧＦＰ／ＣＲＸ产生的慢病毒能感染光感受器细胞来源的ＨＸＯ－ＲＢ　细胞，但还需提高转染的效率和滴度。　【关键词】视网膜；慢病毒载体；ＣＲＸ　

Ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＣＲＸ　ｇｅｎｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｉ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ＬＶ－Ｒｈｏ・ＥＧＦＰ／ＣＲＸ　ⅡＷｅｉ．　ＧＡＯ　，ＬＵ　Ｇｕａｎｇ—ｘｉｕ，　ｕ　Ｇａｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｊｉａｎ，ＺＨＯＵ　Ｍｉｎ—ｗｅｎ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ　Ｆｉｍｔ　Ｐｅｏｐｌｅ　Ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆｆｉｎｉｎｇ，ｆｉｎｉｎｇ　２７２１１１，Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＬＩ　Ｗｅ　，Ｅｍａｉｌ：Ｚｅａｖｅｓ９９９０８８８＠１２６．ｃｏｍ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｃｏｎｅ—ｒｏｄ　ｈｅｍｅｏｂｏｘ　（ＣＲＸ）ｇｅｎｅ—ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ（ＬＶ—Ｒｈｏ—ＥＧＦＰ／ＣＲＸ）ｄｒｉｖｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ（ＬＶ—Ｒｈｏ－ＥＧＦＰ／ＣＲＸ）ｗａｇ　ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｂｙ　ｒｅｐｌａｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＥＧＦＰ　ｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ＬＶ—Ｒｈｏ－ＥＧＦＰ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＥＧＦＰ／ＣＲＸ　ｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ｆｒｏｍ　ｐＥＧＦＰ－　Ｃ３／ＣＲＸ　ｖｅｃｔｏｒ．Ｉｔ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　２９３Ｔ　ｃｅｌｌ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｃａ３（ＰＯ４）２　ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｗａｓ　ｈａｒｖｅｓｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｉｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｍ　ｗｅｒｅ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ—ｄｅｒｉｖｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ＨＸＯ—ＲＢ“ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ａｆｔｅｒ　４８　ｈ　ｔｈｅ　ＧＦＰ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ　ＬＶ—Ｒｈｏ－　ＥＧＦＰ／ＣＲＸ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ｔｈｅ　ｔｉｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｗａｓ　２×１０　ＩＵ／ｍ１．Ｔｈｅ　ＨＸＯ－ＲＢ４４　ｃｅｌｌｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（２×１０　ＩＵ／ｍ１）．Ａｆｔｅｒ　４８　ｈ　ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ，ｓｏｍｅ　ＨＸＯ－　ＲＢ“ｃｅｌｌｓ　ｃｏｕｌｄ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ＧＦＰ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ　ＬＶ－Ｒｈｏ－ＥＧＦＰ／ＣＲＸ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ—ｄｅｒｉｖｉｎｇ　ＨＸＯ—ＲＢ４４　ｃｅｌｌｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｉｔｒａｔｉｏｎ　２×１０　ＩＵ／ｍｌ　ｉｎ　ａ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｄｅｇｒｅｅ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｒｅｔｉｎａ；Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ；　ＣＲＸ　

针对小鼠VEGFA基因的siRNA干扰载体的构建和慢病毒包装

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医ห้องสมุดไป่ตู้
药２１０１年第４２卷第５期
・１・
・
实验研究・
针对小鼠ＶＧＡ基因的ｓＮＥＦｉＡ干扰载体的构建和慢病毒包装Ｒ
毛娅妮黄娟。肖伟陈晓云
１广州市妇女儿童医疗中心儿童医院院区眼科（１１０；２中山大学中山眼科中心（１００５０２）５０６）
合成４对ｓＮｉＡ干扰序列，将ｓＮＲｉＡ干扰序列克隆到ｐＤＡ．一Ｗ／ｍＧＰｍｉＲｃＮ６２ＧＥＦ — Ｒ载体中，构建４个干扰质粒，转化入感受态细胞Ｄ－ｏ。干扰载体瞬时转染靶细胞同时设阴性对照质粒组和不转染组，并通过ｑＣＩｔＩＳＰＲ方法检测干扰载体对
ｉｔｅｔｉｌｅｔｒｃｒｉｒＭｅｈｄ４ｐｉｆｓｎｏａｌｎｉｒｃｏａｒ．ｖａｖｅｔｏｓａｒｏｉｓＲＮＡｉｔｒｒｎｅｓｑｅｃｓｗｅｅｄｓｎｄａｄｓｎｈｓｚｄｂｓｄｏｒｎｅｅｅｃｅｕｎｅｒｅｉｅｙｔｅｉｅａｅｎｔ－ｆｇｎａｇｔｇｎｓｉｅｅｅ，ｓＲＮＡｔｒｒｎｅｓｑｅｃａｌｎｄｉｔｃｉｅｅｅｃｅｕｎｅｗｓｃｏｅｎｏｐＤＮＡ．－Ｗ／ｍＧＦＲａｒｅ．４ｉｔｒｒｎｅｐａｍｉｓｗｒｏ — ｎｆ６２ＧＥＰｍｉｃｒｉｒｎｅｆｅｃｌｅｓｄｅｅｃｎ

慢病毒包装流程 ——简约版

试剂配制：HBS：280 mM NaCl, 10mM KCl, 1.5 mM Na2HPO4, 12 mM Glucose,50 mM HEPES, 0.5mol/LNaOH, pH调至7.05，定容至1L，0.22µm滤膜过滤除菌，分装至50ml离心管-20°C保存。

2.5M CaCl2 溶液，0.22µm滤膜过滤除菌，分装至Ep管-20°C保存。

细胞培养条件：293-T及Huh7均用含10%FBS的DMEM培养液，HepG2用10%FBS的DMEM培养液培养。

HepG2-ATCC培养过程中不铺胶原，种板前铺胶原。

采用四质粒系统phouge ,pMDL,pVSVG ,pREV，表达载体phouge：pCDH- EF1-MCS-T2A-Puro磷酸钙转染法转染293-T细胞。

转染35mm板为例转染前14-16h细胞消化细胞，以汇合度60-70%均匀铺到35mm板中，转染前1h细胞换液，弃掉旧的培养液，换成新鲜无FBS的培养液。

加培养液时要小心，293-T细胞贴壁不牢。

制备磷酸钙-DNA沉淀：配制质粒混合物：phouge 2µg , pMDL 1µg, pVSVG 0.6µg, pREV 0.4µg（质粒体积最好大于0.5ul，如果浓度过高，将质粒稀释）在1.5ml Ep管中加入90µl超纯水，在水中央加入混好的质粒，将10µlCa Cl2 加到底部，沿管壁加入100µl HBS，在HBS与水的分界处用黄枪头吹几个吹散CaCl2，静止20-30min（25min），混匀后均匀滴到细胞中，轻轻摇动，放到37°C培养箱。

8-12h后给细胞换成新鲜的完全培养液，加NEAA(100X)20µl(1µl/1ml培养液)。

注意要观察细胞状态，细胞状态变差，要及时换新鲜培养液。

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采用三质粒系统包装慢病毒并分别感染ＨＥＫ２９３Ｔ和ＨｅｐＧ２细胞。结果电泳显示，构建的ｐＣＳ－ＣＧ－ＤｓＲｅｄ２一ｖｉｇｉｌｉｎ
用ＫｐｎＩ和Ｓａｃ Ⅱ分别单酶切切下８００ｂｐ和６００ｂｐ的插入片段，阳性克隆质粒测序结果与ｐＤｓＲｅｄ２一Ｎ１中ＤｓＲｅｄ２序列
ＳＨＥＮＷｅｎ－ｙａｎ，ＬＩＲａｎ，ＱＩＮＹａｎｇ，ｅｔａｌ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＷｅｓｔＣｈｉｎａＳｃｈｏｏｌｏｆＰｒｅｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄＦｏｒｅｎｓｉｃ
沈文燕，李冉，覃扬，杨文理，刘秋英，魏玲，俞小琴
（四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室，四川成都６１００４１）
【摘要】目的构建ｐＣＳ－ＣＧ－ＤｓＲｅｄ２一ｖｉｇｉｌｉｎ慢病毒重组栽体，以及包装ｐＣＳ－ＣＧ－ＤｓＲｅｄ２一ｖｉｇｉｌｉｎ重组慢病毒。方
Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓｗａｓａｐｐｌｉｅｄａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｕｓｅｄｔｏｃｏｎｆｉｒｍｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔ．Ｔｈｅ
【中图分类号】Ｒ３７３．２【文献标志码】Ａｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２ — ３５１１．２０１４．０２．００４
ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐｌａｓｍｉｄｏｆｐＣＳ＿・ＣＧ－・ＤｓＲｅｄ２・－ｖｉｇｉｌｉｎａｎｄｐａｃｋａｇｉｎｇｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｏｆｖｉｇｉｌｉｎ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００４１，Ｓｉｃｈｕａｎ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｏｆｐＣＳ－ＣＧ－ＤｓＲｅｄ２一ｖｉｇｉｌｉｎａｎｄｔｏｐａｃｋａｇｅｔｈｅ
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１４２・
西部医学２０１４年２月第２６卷第２期ＭｅｄＪＷｅｓｔＣｈｉｎａ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ２０１４，Ｖｏ１．２６，Ｎｏ．２
ｐＣＳ — ＣＧ — ＤｓＲｅｄ２一ｖｉｇｉｌｉｎ重组载体的构建及ｖｉｇｉｌｉｎ重组慢病毒包装＊
ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｏｆｖｉｇｉｌｉｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＤｓＲｅｄ２ｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍｐＤｓＲｅｄ２－Ｎ１ａｎｄｉｎｔｏｔｈｅＮｈｅＩａｎｄＮｏｔＩ
法用ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ将目的片段红色荧光蛋白基因ＤｓＲｅｄ２从ｐＤｓＲｅｄ２一Ｎ１中切下，连入ｐｃＤＮＡ３．１ＮＡ３．１（一）一ＤｓＲｅｄ２中切下ＤｓＲｅｄ２片段插入ｐＣＳ－ＣＧ－ｖｉｇｉｌｉｎ中。甩相应的内切酶鉴定，阳性克隆送测序鉴定。
ｓｉｔｅｓｏｆｐｌａｓｍｉｄｐｃＤＮＡ３．１（一）．ＴｈｅＤｓＲｅｄ２ｇｅｎｅｗａｓｃｌｅａｖｅｄａｎｄｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅＫｐｎｌｓｉｔｅＯｆｐＣＳ－ＣＧ－ＤｓＲｅｄ２ｖｉｇｉｌｉｎ．
一
致；ＨＥＫ２９３Ｔ和ＨｅｐＧ２细胞感染后均能观察到较强的红色荧光。结论带有红色荧光基因的ｐＣＳ－ＣＧ－ＤｓＲｅｄ２一ｖｉｇｉ一
１ｉｎ重组载体构建成功；成功包装出带红色荧光标签的ｖｉｇｉｌｉｎ重组慢病毒，且该病毒具有较高的感染效率。【关键词】ｖｉｇｉｌｉｎ；ＤｓＲｅｄ２荧光蛋白；重组栽体；重组慢病毒