高级药理学 体外抗菌活性试验
《兽医药理学综合实验》教学课件：实验13 抗菌药的体外抑菌作用
移液枪 200 µL ，共8支
灭菌枪头 200 µL，共8盒
酒精灯 8个
37±1℃恒温培养箱
操作步骤
1、抗菌药物的配制 ➢ 抗菌药物原液的配制：配制各种抗菌药物原液的溶剂和 稀释剂应根据药物理化性质与抗菌活性而定。原液浓度 常为测定最高浓度的10倍以上。肉汤稀释法常用原液浓 度为1280 µg/ml ，琼脂稀释法用的原液浓度为5120 µg/ml 。 ➢ 大部分原液-20℃可保存3个月，4℃保存1周。 ➢ 测定浓度范围：包括质控标准菌株的MIC，一般128 µg/ml 为测定浓度上限 。
抗菌药原液的配制与保存期限
抗菌药
青霉素类 头孢菌素类
氨基苷类 四环素类 林可胺类
磺胺类
红霉素
溶剂
浓度 (µg/mL)
pH6.0磷酸盐缓冲液 1280
pH6.0磷酸盐缓冲液 1280
pH7.8磷酸盐缓冲液 1280
pH4.5磷酸盐缓冲液 1280
pH7.8磷酸盐缓冲液 1280
用NaOH溶解再用蒸馏 水稀释
• 3、涂布平板：
➢ 用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多 余的菌液旋转挤去；
➢ 在MH琼脂平板上均匀涂布接种3次，每次 旋转平板60度；
➢ 最后沿平板内沿涂抹1周，盖子半开室温 放置3-5min，待干。注意：涂布均匀、 致密。
4、放置药敏纸片
➢ 将镊子通过酒精灯火焰灭菌，待冷却后，用此镊子夹 取不同药敏纸片，按一定间隔贴在琼脂表面，各纸片 中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。
➢ 一般140 mm平板放置纸片不超过12个，100mm平板不超 过5个纸片
5、孵育 ➢ 放置好纸片15min内倒置平板并将其置于35±2 ℃
体外抗菌实验培训课件
凡由检品中检出大肠埃希菌时，表明该药品可能
被粪便污染，患者服用后，有被粪便中可能存在的其 他肠道致病菌和寄生虫卵等病原体感染的危险。因此， 口服药品中不得检出大肠埃希菌。
检验要点：
(1)形态：革兰阴性短小无芽胞杆菌。
(2)分离培养：在伊红美兰（EMB)培养基上分解乳
糖，产生紫黑色、有金属光泽的菌落。
石炭酸系数（又称酚系数）
是以石炭酸为标准，在规定的试验条件下，作用 一定时间，将待测的化学消毒剂与石炭酸对伤寒沙门 菌或金黄色葡萄球菌的杀菌效力相比较， 所得杀菌 效力的比值。
体外抗菌实验
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棋盘格法
是由于在试验时，含两种不同浓度 药物的试管排列呈棋盘状而得名， 用以 评价两种药物同时用不同浓度进行联合 试验时的抗菌活性。
体外抗菌实验
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（二）特殊药品的无菌检查法
如果阳性对照管不长菌，则必须进行特殊处 理后方可按照一般药品的无菌检查法进行。
1．油类药物的无菌检查
一般油剂因与常规培养基不混溶，药品中的 微生物不易生长，所以一般可采用吐温培养基， 其余同一般药品无菌检查法。
体外抗菌实验
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2．抗菌药物或含防腐剂药物的无菌检查
板上菌落呈无色或粉红色。二糖铁培养基TSl上分
解葡萄糖、产酸产气，不分解乳糖、蔗糖，有动力、
产生黑色沉淀。
(3)生化反应：见表21—l。
体外抗菌实验
第一节 常用的体外抑菌试验
连续稀释法：
可用于测定药物的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀 菌浓度(MBC)。可以用液体培养基，也可用固体培 养基。
1．液体培养基连续稀释法 2．固体培养基连续稀释法
分平板法和斜面 法。
体外抗菌实验
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3.抗菌药物的体内外活性评价方法
FIC指数=MICA药联用/MICA药单用+MICB药联用/MICB药单用
FIC≤ 0.5 协同效应
FIC＞05-1 相加效应
FIC＞1-2 无关效应
FIC≥2
拮抗效应
联合抗菌作用
由于各种抗菌药物抗菌活性、抗菌谱不同， 在处理部分细菌感染时需要联合两种甚至 两种以上的抗菌药物。
五、抗菌药物对细菌形态影响 的研究方法进展
光镜：各种染色 电镜 激光共聚焦显微镜
白念
白色念珠菌.JPG
黑曲霉
THANKS
体内 ：
–ED50（动物） –临床有效率与细菌清除率 –抗生素后效应 –血清杀菌滴度(SBA)
一、药物敏感性实验测定方法 MIC/MBC测定
NCCLS：National Committee for Clinical Laboratory Standards
Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI)
曲线一般分为三个时相：延迟时、杀菌期 和恢复再生长期。可比较不同抗菌药物的 杀菌速度和持续时间。
杀菌曲线
通过杀菌曲线可以发现，在低于MIC值时， 杀菌曲线斜率为正值，随着药物浓度的 增加，斜率逐渐减小；当抗生素浓度为 MIC时，杀菌曲线有两种情况，一为曲线 斜率呈负值，另一为曲线近水平状，表 明前者有杀菌作用，为杀菌剂，而后者 则只是具有抑菌作用，为抑菌剂。
测定抗菌药物联用（24～48h）效果时应遵循以 下标准：
与活性最强的成分相比，每毫升CFU的常用对数 值下降≥2定义为协同；
与活性最低的成分相比，每毫升CFU的常用对数 值升高≥2定义为拮抗；
与活性最强的成分相比，每毫升CFU的常用对数 值下降＞1且＜2定义为相加；
研究妇洁颗粒的体外、体内抗菌活性
研究妇洁颗粒的体外、体内抗菌活性摘要：目的研究观察妇洁颗粒的体外、体内抗菌活性。
方法采用平皿二倍稀释法测定了妇洁颗粒对临床分离的64株临床常见的革兰氏阳性及革兰氏阴性菌的体外抗菌作用。
选择了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌及乙型溶血性链球菌进行了小鼠体内细菌感染的保护实验。
结果该药体外对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及大肠杆菌的作用为最强，MIC50分别为，2和1 g·L-1；体内实验也显示对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及变形杆菌造成的体内感染动物有较好的保护作用。
结论对临床常见的革兰氏阳性及革兰氏阴性菌均具有较强的杀灭或抑制作用。
关键词：妇洁颗粒；抑菌；大肠杆菌；金黄色葡萄球菌阴道炎、宫颈炎是妇科多发病、常见病，大多数是由细菌等病原微生物引起，长期炎症，可发展为宫颈糜烂。
妇洁颗粒为治疗阴道炎、宫颈炎的中成药，具有清热解毒、活血消炎的功效。
为了解抗菌谱及药效，我们对妇洁颗粒进行了抗菌实验研究。
1 材料受试物妇洁颗粒，深棕色膏剂，每克膏相当于生药 g，由本所提供，批号020820；阳性对照药：妇乐冲剂：规格6 g/袋，山东泰安红旗制药厂生产，批号020309。
菌种、动物与试剂实验菌株，本实验共选用7种细菌。
包括金黄色葡萄球菌12株、表皮葡萄球菌10株、大肠杆菌14株、肠球菌10株、普通变形杆菌12株、乙型溶血性链球菌6株，共计64株。
以上菌株均为山东大学齐鲁医院收集的临床分离菌株。
全部菌种均进行常规方法鉴定；金黄色葡萄球菌ATCC25922、大肠埃希氏菌ATCC25923，均来源于中国药品生物制品检定所。
以上述菌株作为试验中的质控菌株，各菌分别稀释至终浓度为105 cfu/ml备用。
健康昆明种小鼠，体重18～22 g，由山东鲁抗医药集团提供，合格证号：鲁动质字D20XX0921。
营养肉汤，卫生部上海生物制品研究所生产，批号000101；MH 琼脂，上海市医学化验所试剂厂生产，批号990601。
荷芩止痒搽剂体外抗菌活性的研究
荷芩止痒搽剂体外抗菌活性的研究目的：观察荷芩止痒搽剂对常见皮肤致病菌体外抗菌试验效果。
方法：采用平皿钢圈法对金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌（绿脓杆菌）、白假丝酵母、紧密单孢枝霉、裴氏着色真菌、石膏样小孢子菌、星形石膏样毛癣菌、红色毛癣菌、疣状毛癣菌和犬小孢子菌10种皮肤感染常见致病菌的抗菌效果进行观察。
结果：荷芩止痒搽剂原液对金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢菌（绿脓杆菌）抑菌圈分别为24mm和11mm；白假丝酵母、紧密单孢枝霉、裴氏着色真菌、石膏样小孢子菌、星形石膏样毛癣菌、红色毛癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌无指示菌生长。
结论：荷芩止痒搽剂浓缩液（2∶1）、原液、1∶1、1∶8、1∶16以及1∶32倍液对本次试验所观察的10种常见皮肤致病菌有不同程度抗菌作用。
标签：荷芩止痒搽剂；体外抗菌；皮肤致病菌皮肤瘙痒为临床常见的一种症状。
针对临床实践中存在的HIV/AIDS皮肤瘙痒症问题，云南省中医中药研究院以中医理论为基础，在辨病、辨证，病症相结合的基础上自主研究和开发了“荷芩止痒搽剂”。
该搽剂主要由阳荷、黄芩等组成，具有解毒、消肿、除湿和止痒作用。
该搽剂对皮肤没有损害，不增加患者内服药，安全、有效、经济、简便、快捷、患者乐于接受。
为了考察其对常见皮肤致病菌的抗菌活性，现对其进行了体外抗菌活性研究。
现报道如下。
1材料与方法1.1受试药物荷芩止痒搽剂原液；荷芩止痒搽剂浓缩液，由云南省中医中药研究院附属医院制剂室提供。
批号：20110401。
样品配制：无菌纯水倍比稀释。
1.2试验用菌株YM1030金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、YM1040铜绿假单孢菌（绿脓杆菌）（Pseudomonasaeruginosa）、YM2005白假丝酵母（Candidaalbicans）、YM3077紧密单孢枝霉（Hormodendrumcompa）、YM3079裴氏着色真菌（Hormodendrumpedrosoi）、YM3080石膏样小孢子菌（Microsporumgypseum）、YM3092星形石膏样毛癣菌（Trichophytongypseum）、YM3093红色毛癣菌（Trichophytonrubrum）、YM3096疣状毛癣菌（Trichophytonverrucosum）、YM3099犬小孢子菌（Microsporumcanis），由云南大学微生物实验室提供。
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。
原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。
影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。
操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。
用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。
记录抑菌圈的直径，实验。
重复10次。
主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。
（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。
水杨酸异丙酯体外抗菌活性的测定
水杨 酸（ａｃｌ ｃ ，Ａ 经外 源处理 可诱 导烟草 、 铃 Ｓｌｙｃａｉ Ｓ ） ｉｉ ｄ 马
标准 株 ４株 购 于 北 京 生 物 研 究 所 分 别 为 大 肠 杆 菌 （Ｔ Ｃ－ １１ 、 氏志贺氏菌（ Ｃ ５２４ 、 脓杆菌 （ Ｃ． Ａ Ｃ －４０ ）福 ４ 艘 一１０ ）绿
安徽农业科学 ． ｕｎｌ ｆ ｎｕ Ａ ．ｃ．Ｏ８ ３ （４ ：４ ５ —１８ ２ Ｊ ｒａｏ Ａ ｈｉ Ｓｉ２Ｏ ，６ ３ ） １ １ ４５ ｏ ８
责任编辑
李玮
责任校对
张士敏
水 杨 酸 异 丙 酯 体 外 抗 茵 活 性 的 测 定
裴海龙， 晓 王希 鲁海燕， 新 （北 学 命 学 院陕 西 ７ ６ 陈 玲， 楠， 黄建 西 大 生 科 学 ，西 安 ｌ ９ ０） ｏ
ｓｉ ｄｃｔ ａ ｒ ｇｏ ｔｅＭＩ ｆｉｐｏｙ ｉ ｌｅｗ ｓ ｕｔ ｉ ｉ ｅ ｔ ｔａ ｆｈ Ｃ ｏ ｓ ｒｐｌａ ｃ ａ ａ ｓｎ ａ ｄ ｈ ｎ ｏ ｓ ｙｔ ｌ Ｏ． ．０ｍｇｍ１ ｎｉ ａｔ ａ ａｔｉ ｆｓｐｏｙ ｓｌｙ ｔ ０ ｔ Ｏ３ ｅ ．Ａ ｔｂｃ ｒ ｌ ｃｖｔ ｏ ｉ ｒ ｌ ａｉ ｌｅ ５ｏ — ｅ ｉｙ ｉ ｏ ｐ ｃａ ｓ ｏｇｒｔ ｎ ｔ ｎｅ ａ ｒ ｈ
薯 、 和菜 豆等重 要农作 物产生 对 由真菌 、 黄瓜 细菌 和病毒 等
引起 的病 害的局部和系统性抗性 ＿ ， Ｉ 因而备受人 们关 注。水
１ｌ２ 和产气大肠杆菌 （Ｔ ｃ ６６５ 。 Ｏ０ ） Ａ℃ 一４ １） 最终进行体外抗 菌试 验用菌株共计 １ 。 ９株 １２ 方法 ． 检测机构 为西 北大学 气 一质 联用实 验室 。参 照 体外抗菌试验方法 中琼脂稀 释法进行 ， 体操 作如下 Ｊ 具 。 １２ １ 牛 肉膏汤琼脂 培养 基的制备 。牛 肉膏 ３ｇ 蛋 白胨 ｌ ．． 、 ０ ｇ氯化钠 ５ｇ 、 和琼脂 ２ ， ０ｇ加入 ｌ ０ ｌ ０ｍ 蒸馏 水中 ， ０ 调节 ｐ Ｈ值 为 ７０～ ．， ． ７ ２ 高压 灭菌（２ Ｐ ，０ｍ ｎ ， １１ ａ２ ｉ）分装斜 面 ， ｋ 放冷 置冰
美罗培南的体外抗菌活性研究
美罗培南为碳青霉烯类抗生素， 对大部分革兰氏 阴性需氧菌具有强大的抗菌作用， 是治疗由产 .BCDE ’ FGGH 3 I I JJJ9 20FK79 ;L6 I EGMN1KE I JKO9 FG/ * 和 I 或 为了解国产美罗培 A/H? P ! Q 细菌引起感染的重要药物。 南的体外抗菌活性， 本研究对经表型筛选法和分子生 物学方法确认的 !!" 株产 .BCDE 和 I 或 A/H? 酶的临 床分离株采用琼脂稀释法测定最低抑菌浓度， 并与其 它抗菌药物比较， 报道如下。 ! !" ! !" !" ! 材料和方法 材料 菌株 (""! 年 , 月 R (""( 年 % 月北京天坛
敏感试验结果判断结果
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作者简介： 顾怡明， 女， 生于 !&,- 年， 硕士， 主治医师， 主要从事细菌耐药性研究。
・3,/ ・ 表+ ++ 种抗菌药物对产 :!;<= 大肠埃希氏菌的 （ ! 8 .+ 9 体外活性作用
!" &+0 , .&0 & ./0 . &-0 * ’ /&0 * +,0 + .&0 & *.0 * +’’ +’’ #$%&’ * +, * * ,./ ,./ * ’0 +/& ’0 ’,#$%)’ ,./ ./ ,/&, +/* /&, +/* ,’0 & ’0 /& #$%( + 1 +/* / 1 +/* ’0 ’, 1 +/* ’0 & 1 +/* ./ 1 /&, * 1 /&, - 1 /&, / 1 /&, / 1 /&, ’0 ’. 1 ’0 ’. 1 /