重组猪α干扰素的酵母表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用

２０１２年８月　第４期１～６　甘肃农业大学学报　

Ｊ０ＵＲＮＡＩ　ＯＦ　ＧＡＮＳＵ　ＡＧＲＩＣＵＩ　ＵＲＡＩ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　第４　７卷　

双月刊　

重组猪　干扰素的酵母表达及其对伪狂犬病毒　的抑制作用　

张鲁滨　，王一成　，吴润　，李军星　，袁秀芳　，徐丽华　（１．甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州７３００７０；２．浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江ｇｃ＃ｌ　３１００２１）　

摘要：利用自动发酵罐高效分泌表达ｒＰｏＩＦＮ　ａ，经硫酸铵沉淀、Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ阴离子交换层析和Ｓｕｐｅｒｄｅ　２００分子筛层析纯化重组猪　干扰素，用纯化的ｒＰｏｌＦＮ～ａ进行ＰＲＶ体＃ｂＮＮｉ￣Ｎ．结果表明：随着表达时间的延　长，发酵表达液中ｒＰｏｌＦＮ—　含量增高，其中７２　ｈ表达液中ｒＰｏｌＦＮ—　的含量可达０．５２　ｇ／ｕＩ　，约占总蛋白量的　５７．５Ｏ％ｏ，活性为１．Ｏ０×１０　Ｕ／　Ｉ　．ｒＰｏｌＦＮ—　提纯液的浓度为７．０２／，ｇ／ｔｄ　，纯度为９８．１　，活性高达１．００×１０９　Ｕ／／ｘＩ　．纯化ｒＰｏＩＦＮ－ａ的ＰＲＶ抑制作用和感染阻断作用的比活均为１．４２Ｘ１０　ｕ／ｔ，ｇ，对ＰＲＶ增殖抑制作用的比活　为１．４２　ｘ　１０。Ｕ／ｔ＊ｇ．表明发酵表达的ｒＰｏｌＦＮ－ａ对伪狂犬病毒病具有良好的抑制活性，为进一步开展重组猪　干扰　素临床试验提供依据．　关键词：猪ａ干扰素；巴斯德毕赤酵母；酵母表达；伪狂犬病毒；抑制作用　中图分类号：Ｓ　８５８．２８　文献标志码：Ａ　文章编号：１００３—４３１５（２０１２）０４—０００１　０６　

．　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏ±ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ—　ｉｎ　Ｐｉｃｈｉａ　

ｐａｓｔｏｒｉｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ　ｖｉｒｕｓ　

ＺＨＡＮＧ　Ｌｕ—ｂｉｎ　，ＷＡＮＧ　Ｙｉ—ｃｈｅｎｇ。，ＷＵ　Ｒｕｎ　，ＬＩ　Ｊｕｎ－ｘｉｎｇ　，ＹＵＡＮ　Ｘｉｕ—ｆａｎｇ　，ＸＵ　Ｌｉ—ｈｕａ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｇａｎｓｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｉ．ａｎｚｈｏｕ　７３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．Ａｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｈａｎｄｒｙ　

ａｎｄ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００２１，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ａ（ｒＰｏｌＦＮ—ｄ）ｗａｓ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｂｖ　Ｐｉｃｈｉ“ｐａｓｔ０～　ｒｉｓ　ｉｎ　ａ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒＰｏｌＦＮ—　ｏｎ　Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ　ｖｉｒｕｓ（ＰＲＶ）ｒｅＤｌｉｃａｔｉｏｎ　钾　ｖｉｔｒｏ　ｗａｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｓｕｌｆａｔｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｖ　ａｎｄ　ｇｅｌ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｕｒｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ｒＰｏＩＦＮ—ａ　ｉｎ　ｓｕＤｅｒｎａｔａｎｔ　ｒｅａｃｈｅｄ　０．５２＞ｇ／／，Ｌ　ａｆｔｅｒ　７２　ｈｏｕｒｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ　ａｃｃｏｕｎｔｅｄ　ｆｏｒ　ａｂｏｕｔ　５７．５０　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｏｔａ１　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗａｓ　１．００×１０　Ｕ／　Ｉ　．Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｒＰｏＩＦＮ－ｄ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　７．０２　ｕｇ／￡上Ｌ　ｒＰｏＩＦＮ—ａ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　９８．１　９／６　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　１．００　Ｘ　１０。Ｕ／　Ｉ　．Ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒＰｏＩＦＮ—ａ　ｏｎ　ＰＲＶ　ｗａｓ　ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ　１．４２×１０　Ｕ／ｕｇ．Ｔｈｅ　ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒＰｏＩＦＮ－　ｏｎ　ＰＲＶ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ａＤ—　ｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ　１．４２　Ｘ　１０　Ｕ／ｕｇ．Ｔｈｅ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒＰｏｌＦＮ—ａ　ｏｎ　ＰＲＶ　ｗａｓ　ａｐｐｒ０ｘｉｍａｔｅ１ｖ　１．４２　ｘ　１０。Ｕ／ｕｇ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｉｓ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｒＰｏｆＦＮ－￣ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｂｙ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｈａｓ　ａ　ｈｉｇｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ＰＲＶ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｒＰｏｌＦＮ　ａ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｔｅｓｔ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｏｒｃｉｎｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ—ａ；Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ；ｙｅａｓｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅ　ｖｉｒｕｓ；ｉｎｈｉｂｉｔｉＯｎ　ｅｆｆｅｃｔ　

第一作者：张鲁滨（１９８４），男，硕士研究生，主要从事兽医微生物与免疫学研究．　ｍａｉｌ：１ｕｂｉｎ．ｚｈａｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ　

通信作者：王一成，男，研究员，主要从事动物传染病防治技术研究．Ｅ－ｍａｉｌ：９５７１１＠　ｉ　．　ｏｍ　

基金项目：浙江省科技计划项目（２０１０Ｃ３２０８７）．　

收稿日期：２０１２　０３　１０；修回日期：２０１２～０５　１７　甘　肃　农　业　大　学　学　报　干扰素（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，ＩＦＮ）是由受病毒侵染细胞　所分泌的一种细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤、调节　机体免疫等生物学活性．重组猪ａ干扰素（ｒｅｃｏｍｂｉ—　ｎａｎｔ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ａ，ｒＰｏＩＦＮ—ａ）是利用基因工　程表达的一种干扰素，具有天然猪ａ干扰素抗病毒　的广谱性和高效性．Ｌｅｆｅｖｒｅ等［１］、陈涛等ｌ２］、曹瑞兵　等口］先后克隆出猪ａ干扰素基因，并在大肠杆菌中　成功表达；谢海燕［　、葛丽等［　、刘键等［６］成功利用　毕赤酵母表达了ｒＰｏＩＦＮ　目前ｒＰｏｌＦＮ—ａ已成为　兽用生物制药领域的研究热点，被广泛应用于抗病　毒研究ｌ７　］．　伪狂犬病是由伪狂犬病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ　ｖｉ—　ｒｕｓ，ＰＲＶ）引起的传染病，可致母猪发生流产、死产，　哺乳仔猪表现发热、神经症状和极高的死亡率，可造　成巨大的经济损失．ＰｏＩＦＮ—ａ所具有的可刺激机体　产生抗病毒蛋白质，同时能激活病毒感染细胞相关　基因的表达而使机体迅速处于抗病毒的防御状态的　作用Ｅ　］，使ＰｏＩＦＮ—　可作为有效治疗该病的首选药　物之一．曹瑞兵等ｌ＿】ｌｊ进行了重组猪ｌ３干扰素对伪狂　犬病毒的体外抑制试验，比活为４．１７×１０。Ｕ／ｍｇ；　汤仁树等＿】。］证明５０　ＩＵ／ｍＬ　ｒＰｏＩＦＮ－ｕ可抑制　ＰＲＶ对ＰＫ一１５致细胞病变效应，但都存在活性偏低　的问题．鉴于此，本研究应用毕赤酵母高效表达　ｒＰｏＩＦＮ—ａ，对其进行抑制伪狂犬病毒的体外试验，　以期为进一步的临床试验提供理论依据．　

１　材料与方法　１．１菌种、细胞株、病毒　毕赤酵母ｒＰｏＩＦＮ—ａ菌株、猴肾细胞（Ｍａｒｅ－　１４５）、水疱性口炎病毒（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ，　ＶＳＶ，ＴＣＩＤ　。为１０　∞／ｏ．１ｍＬ）、伪狂犬病毒　（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ　ｖｉｒｕｓ，ＰＲＶ，ＴＣＩＤ￣ｏ为１Ｏ　・　／ｏ．１Ｈ　）　等均由本实验室保存．　１．２培养基和主要试剂　酵母完全培养基（ＹＰＤ）、诱导培养基（ＢＭ—　ＧＹ）、甲醇诱导培养基（ＢＭＭＹ）按照Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公　司Ｍｕｌｔｉ—ｃｏｐｙ　Ｐｉｃｈｉａ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔ配制，蛋白分　子质量标准购自上海升正生物技术有限公司，Ｔｒｉｓ、　硫酸铵等试剂均为国产分析纯，ＭＥＭ购自赛默飞　世尔生物化学制品有限公司，胰蛋白酶购自吉诺生　

物医药技术有限公司，新生牛血清购自杭州四季青　生物工程材料有限公司．　１．３主要仪器　ＢｉｏＦｌｏ４１５发酵罐购自美国新布朗什维克科学　公司，ｐＨ型精密数显酸度计购自意大利ＨＡＮＮＡ，　层析仪（ＡＫＴＡ　ｐｕｒｉｆｉｅｒ）购自美国通用电气公司，　３１１０系列水套ＣＯ２培养箱购自Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　公司．　１．４毕赤酵母高效表达ｒＰｏｌＦＮ－￣　毕赤酵母表达ｒＰｏＩＦＮ—ａ参照王朝文等　的方　法并稍作修改．取一８０℃保存的毕赤酵母ｒＰｏＩＦＮ—　

ａ菌株，划线接种于ＹＰＤ平板，３０。Ｃ培养２　ｄ，再挑　取单个菌落，接种于５　ｍＩ　ＢＭＧＹ中，３０℃　２２０　ｒ／ｒａｉｎ摇菌１２　ｈ，镜检无杂菌后，全部接种于　４００　ｍＬ　ＢＭＧＹ中，３０。Ｃ　２２０　ｒ／ｒａｉｎ摇菌２４　ｈ，镜检　无杂菌后，将菌液７　０００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｒａｉｎ，弃上清，　菌体用少量ＢＭＭＹ重悬，接种于４　０００　ｍＩ　ＢＭＭＹ　中，使发酵液的酵母菌体浓度Ｄ值达到１．发酵表达　条件为：溶氧（Ｄｏ）３５　，ｐＨ６．０，培养温度３０。Ｃ，搅　拌速度２００￣９５０　ｒ／ｍｉｎ，通气速率２～２５　Ｌ／ｍｉｎ，氧　气添加速度Ｏ　～５０　．设定溶氧与搅拌速度、通气　速率、氧气添加速度关联．以３０　氨水调节ｐＨ，氨　水的补加速度与ｐＨ关联．流加甲醇维持诱导表达，　甲醇补加速度与Ｄ０关联．分别于表达０、２４、４８、　７２、９６、１２０　ｈ取发酵液样品，离心制备表达上清，　ＳＤ￣ＰＡＧＥ检测，Ｑｕａｎｔｉｔｙ　Ｏｎｅ软件分析蛋白含量　和浓度．　１．５　ｒＰｏｌＦＮ－￣的纯化　取诱导７２　ｈ的表达液，７　０００　ｒ／ｍｉｎ离心　２０　ｍｉｎ，获取表达上清，加入硫酸铵至４５　饱和度，　沉淀表达上清中的蛋白．用Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　（０．０５　ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ９．０的Ｔｒｉｓ—ＨＣ１）重新溶解蛋白沉　淀，先经Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５柱脱盐处理，回收蛋白液上　样于Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ平衡过的Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ阴离　子交换柱，以０～０．３　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１的０．０５　ｍｏｌ／Ｉ　ｐＨ　９．０的ＴｒｉＳ—ＨＣ１进行梯度洗脱，收集蛋白洗脱　液，再进行Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００分子筛层析，以０．０１　ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ　７．２的ＰＢＳ缓冲液过柱，流速０．２　ｍＬ／ｍｉｎ，收集ｒＰｏＩＦＮ—ａ蛋白峰，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　检测，Ｑｕａｎｔｉｔｙ　Ｏｎｅ软件分析蛋白含量和纯度．