第5讲 核酸电泳
核酸凝胶电泳
引言： 核酸是带均匀负电荷的生物大分子， 引言： 核酸是带均匀负电荷的生物大分子， 在电场中向正极移动， 在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分 子的电荷密度大致相同，在自由泳动时， 子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸 分子的迁移率区别很小，难以分开。 分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度 的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应， 的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应， 使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现 较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、 较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、 纯化核酸片段的标准方法。 纯化核酸片段的标准方法。用低浓度的荧光嵌入 染料溴化乙锭（EB）进行染色， 染料溴化乙锭（EB）进行染色，可直接在紫外灯 下确定DNA在凝胶中的位置。 DNA在凝胶中的位置 下确定DNA在凝胶中的位置。
影响核酸电泳的因素： 影响核酸电泳的因素：
• • • • 1．核酸的性质 2．凝胶孔径的大小 3．电场强度和电场方向 4．电泳环境 缓冲液的组成和离子强度 直接影响迁移率。 直接影响迁移率。
核酸电泳的指示剂 ：
• 核酸电泳常用的指示剂有两种： 核酸电泳常用的指示剂有两种： • ⑴溴酚蓝 • ⑵二甲苯青， 二甲苯青，
【实验材料】 实验材料】
• • • • 1．电泳仪。 电泳仪。 电泳槽。 2．电泳槽。 紫外透射仪。 3．紫外透射仪。• 1．琼脂糖凝胶板的制备 将1～2%琼脂糖凝胶加热溶化 2%琼脂糖凝胶加热溶化 均匀，冷却到60 70℃ EB至浓度 60～ 至浓度0.5 µg/ml， 均匀，冷却到60～70℃加EB至浓度0.5 µg/ml，倒入封 好的凝胶槽，厚度约3 mm，在距底板0.5 0.5～ mm的 好的凝胶槽，厚度约3～5 mm，在距底板0.5～1 mm的 位置放置样品梳，检查梳子齿间有无气泡， 位置放置样品梳，检查梳子齿间有无气泡，可用吸管小心 吸出气泡，待冷却成形后取出梳子及隔板， 吸出气泡，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳 槽中，缓冲液淹没过胶1 mm为止 为止。 槽中，缓冲液淹没过胶1～2 mm为止。 • 2．加样 样品中加1/5体积的上样缓冲液，混匀，取10～ 样品中加1/5体积的上样缓冲液，混匀， 10～ 1/5体积的上样缓冲液 µl加入凝胶点样孔中 同时要设立合适的DNA 加入凝胶点样孔中， DNA相对分 15 µl加入凝胶点样孔中，同时要设立合适的DNA相对分 子质量标准物。 子质量标准物。 • 3．电泳 电压＜10 V/cm，电泳至溴酚蓝移出样品槽到 电压＜ V/cm， 凝胶板的2/3距离时，关闭电源。 2/3距离时 凝胶板的2/3距离时，关闭电源。 • 4．取出凝胶块，置紫外透射反射分析仪上观察，即可见 取出凝胶块，置紫外透射反射分析仪上观察， 桔红色DNA区带。 桔红色
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1 不能有效的回收大片段DNA
2 不能有效回收少量DNA
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二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳
polyacrylamide gel electrophoresis PAGE
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（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质
在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原 产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯 基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。
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3 电场夹角：电场方向的夹角常为1100 - 1200， 研究证实900夹角也非常有效的。
4 温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行， PFGE一般应在4℃ 进行。较高的温度DNA泳 动较快；但是较高的温度也引起较小片段 的泳动截留和明显的条带变宽。
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7 电泳缓冲液 常用的有TAE、TPE及TBE
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TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较
都是常用电泳缓冲液。三者相比：
1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝 胶的阳极一侧将发生酸性化；
2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；
3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；
垂直交变电场系统
A-
B-
A+B
+A B-
场翻转系统
-
+B
+A
箝位匀转胶系统
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（三） 影响分辨率的因素
1 脉冲时间（0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较 大分子，减少脉冲时间分离较小分子。 2 电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大 了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度 会导致较小片段泳动的紊乱。
核酸凝胶电泳的原理
核酸凝胶电泳的原理核酸凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）是一种常用的分离和分析核酸分子的技术方法。
其原理基于核酸分子在电场中的运动速度与其分子大小和电荷量之间的关系。
本文将详细介绍核酸凝胶电泳的原理、步骤和应用。
核酸凝胶电泳的原理：核酸凝胶电泳是基于核酸分子的带电性质和凝胶的分子筛效应来实现分离的。
核酸分子在电泳的过程中，根据它们的分子大小和电荷量的不同，在电场中具有不同的迁移速度。
核酸分子带负电：DNA和RNA分子都是由带负电的核苷酸通过磷酸二酯键所连接而成的。
由于核酸分子的磷酸基团带负电，核酸分子在电场中迁移的方向是由负极向正极。
凝胶的分子筛效应：核酸凝胶电泳使用的凝胶通常是琼脂糖（agarose gel），其由高分子链状结构组成。
琼脂糖分子链间存在微小的孔隙，可以形成分子筛效应。
较小的核酸分子可以更容易地穿过凝胶的孔隙，迁移速度较快；而较大的核酸分子则受到凝胶孔隙的阻碍，迁移速度较慢。
核酸凝胶电泳步骤：1. 准备凝胶：将琼脂糖加入缓冲液中，加热溶解并冷却，形成一层凝胶。
2. 加载样本：将待分析的核酸样本加入样品槽中。
3. 施加电场：将电泳槽连接至电源，打开电源，施加电场。
通常，电场的方向是由负极向正极，使核酸分子向阳极迁移。
4. 分离与可视化：在经过一段时间的电泳后，核酸分子会分离成不同的带状。
使用染料如乙溴乙酸（ethidium bromide）染色或荧光标记的核酸进行可视化。
核酸凝胶电泳应用：1. 分离和鉴定核酸：核酸凝胶电泳可用于分离DNA和RNA，用于鉴定某个样品是否含有特定的核酸序列。
2. 估算核酸大小：通过核酸凝胶电泳可以估算核酸的大小，通过与已知大小的DNA分子进行比较。
3. 检测突变和多态性：核酸凝胶电泳可以用于检测基因突变和多态性的存在与否，例如用于遗传病的检测和基因型分析。
4. DNA指纹图谱：核酸凝胶电泳可用于建立DNA指纹图谱，用于个体识别、亲子鉴定和犯罪现场的分析。
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核酸电泳操作规范
核酸电泳步骤
1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml): 称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成
1.0%琼脂糖凝胶液.
2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中。
添加1×TAE 电泳缓冲液至没过胶板1-2毫米为止.
3. 加样:在点样板上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。
4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.
5. 电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min.
6. 观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存.。
5植物RNA提取及电泳
标 准 (kb)
1~50 0.7~25 0.5~15 0.25~12 0.15~6 0.08度低 溶点(kb)
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3 0.05~1 0.5~1 0.1~0.5 0.01~0.1
核酸凝胶电泳的基本原理
1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状 态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正 电极方向迁移；
2）由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质， 电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。 而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数；
因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、在凝胶上 分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核 酸分子。
34~43 修饰的低熔点/ 25~35 凝点琼脂糖 35 8~15 超低熔点 25~30 低黏性低熔点琼 38 脂糖 30
85~95 63~65 65 40~45 70 85 75
不同厂家 生产的不 同商品其 凝结温度 和熔化温 度有一定 差异
不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围
浓度 （%）
0.3 0.5 0.8 1.0 1.2 1.5 2.0 3.0 4.0 6.0
溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其 负电荷减少、刚性和长度增加。
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所用的电压
低电压时DNA片段迁移率与所用 的电压成正比。
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琼脂糖种类
常见的有两种：标准琼脂糖和低 熔点琼脂糖；
不同类型琼脂糖的性质
琼脂糖类型 凝结温度/℃ 35~38 40~42 熔化温度/ ℃ 90~95 85~90
标准琼脂糖 高强度琼脂糖
3
核酸凝胶电泳
凝胶中DNA的成像
可以用透射或入射紫外光对EB染色
的凝胶成像，图像可以直接输出到 计算机观察。
凝胶中DNA的回收
现一般采用试剂盒回收： 存在的主要问题： 1 不能有效的回收大片段DNA
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不能有效回收少量DNA
一、DNA 琼脂糖凝胶电泳
Agarose gel electrophoresis
• 电泳原理： • DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷， 在电场中向正极移动。在一定电场强度下， DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成 反比。
10ul，RNA 样品4.5ul,混匀。
② 将离心管置于60℃水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。 ③ 向管中加入3ul 上样染料，混匀。
④ 上样。 ⑤ 电泳：电泳槽内加入1X MOPS缓冲液，于7.5V/ml 的电压
下电泳。
⑥ 电泳结束后，在紫外灯下检查结果。
二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳
polyacrylamide gel electrophoresis PAGE
3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；
4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE， 对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE 中的电泳分辨率要好于TBE。
（二） 凝胶载样缓冲液
载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的
样品相混合的一种缓冲液。
（一）凝胶的制备及电泳
琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
琼脂糖浓度(%)
0.3 0.6 0.7
线型DNA分子的分离范围(Kb)
5～60 1～20 0.8～10
0.9
1.2 1.5 12.0
核酸电泳系统
核酸电泳系统核酸电泳系统是一种用于分离和检测DNA、RNA等核酸分子的电泳设备。
以下是核酸电泳系统的一些主要特点、原理、应用和优缺点：一、特点：高效性：核酸电泳系统采用电泳技术，可以在短时间内将核酸分子进行高效分离和检测。
灵敏度高：核酸电泳系统具有高灵敏度，可以检测到微量的核酸分子。
分辨率高：核酸电泳系统具有高分辨率，可以将不同大小的核酸分子进行分离和检测。
可重复性好：核酸电泳系统具有很好的可重复性，可以获得一致的实验结果。
二、原理：核酸电泳系统是基于电泳技术的一种分离和检测核酸分子的方法。
在电场的作用下，核酸分子通过凝胶等介质进行迁移，从而实现分离和检测。
三、应用：核酸电泳系统广泛应用于生命科学、医学、食品检测等领域。
例如，在生命科学领域，核酸电泳系统可用于研究基因组、转录组、表达谱等；在医学领域，核酸电泳系统可用于检测病原体、遗传病、癌症等。
四、优点：快速：核酸电泳系统操作简便、快速，可以快速分离和检测核酸分子。
可靠：核酸电泳系统具有高可靠性和稳定性，可以获得可重复的实验结果。
自动化：核酸电泳系统具有自动化操作的功能，可以降低人为操作误差。
灵敏度高：核酸电泳系统具有高灵敏度，可以检测到微量的核酸分子。
五、缺点：成本高：核酸电泳系统的设备和试剂成本较高，需要较高的投入。
技术要求高：操作核酸电泳系统需要一定的技术和经验，需要专业人员进行操作和维护。
对样品要求高：核酸电泳系统对样品的纯度和质量要求较高，需要经过预处理和纯化等步骤。
总之，核酸电泳系统是一种重要的生物分析工具，具有高效性、灵敏度高、分辨率高等特点。
然而，其成本高、技术要求高等缺点也需要引起重视。