胎盘间充质干细胞研究进展

胎盘间充质干细胞提取工艺流程

胎盘间充质干细胞提取工艺流程
胎盘间充质干细胞（Wharton's jelly mesenchymal stem cells）的提取工艺流程一般包括以下步骤：
1. 胎盘收集：选取安全的胎盘来源，一般为胎儿顺产后鲜胎抽提的胎盘组织。

2. 清洗处理：将收集到的胎盘进行外表面的血液和组织清洗，以去除附着的污物。

3. 割裂分离：将清洗后的胎盘割裂，使其内部的胎盘间充质暴露在外。

4. 切碎消化：将割裂后的胎盘间充质组织进行切碎处理，并使用消化酶如胶原酶等进行消化，以分离细胞。

5. 过滤筛选：通过滤网或者离心等方法，筛选掉消化后的胎盘组织渣滓，留下单个的胎盘间充质细胞。

6. 细胞培养：收集到的胎盘间充质细胞进行培养，提供适当的培养基和条件，使其能够继续增殖和扩增。

7. 细胞鉴定：通过免疫细胞化学染色、流式细胞术等方法，对细胞进行鉴定，确认其为胎盘间充质干细胞。

8. 存储冻存：将已经被鉴定的胎盘间充质干细胞进行冻存，以便后续的应用和使用。

以上是一般的胎盘间充质干细胞提取工艺流程，不同实验室和厂家可能会根据具体需要进行微调和改变。

具体的工艺流程还需要根据实际情况进行优化和调整。

程控降温法与二步法对胎盘间充质干细胞冻存效果的影响

程控降温法与二步法对胎盘间充质干细胞冻存效果的影响章毅;陈侃俊;李萍;李冉;陈亮;陆薇;伍婷;金魏名【摘要】目的观察对比程控降温法与二步法对胎盘间充质干细胞深低温冻存效果的影响.方法分别采用程控降温法和二步法对3个批次的pMSCs进行液氮冻存,3个月后进行复苏,测定细胞存活率、活细胞数,观察体外培养1~4 d时的细胞形态,CCK8法进行细胞增殖检测,同时用流式细胞术鉴定细胞表面标记抗原,用油红O 染色、茜素红S染色和Masson染色进行细胞三向分化能力鉴定.结果程控降温法对比二步法冻存的细胞活率在冻存前、复苏后均无显著差异(P>0.05).倒置显微镜观察细胞形态,均在24 h时贴壁,呈短梭形,96 h时细胞密度达到95%左右,均匀铺满视野.增殖测定结果显示,培养第3~5天为两组细胞的对数生长期,第5天时增殖倍数达到最高,分别为第1天的6.44倍和6.29倍,经过短暂的平台期后进入衰亡期,增殖趋势一致;但分别在第4天(P<0.01)、第6天(P<0.05)和第7天(P<0.05)时,程控降温法冻存的细胞存活率极显著或显著高于二步法冻存的细胞.两种方法冻存细胞的表面标志性抗原CD73、CD90、CD105阳性细胞数百分比分别为99.85%、99.87%、96.45%和99.73%、99.73%、96.17%.诱导14 d后两组pMSCs均出现明显的成脂、成软骨、成骨细胞特性.结论采用程控降温法或二步法冻存pMSCs均能很好地维持细胞活力及生物特性,在条件允许情况下宜采用程控降温法,以获得增殖能力更好的种子细胞.%Objective To evaluate the effects of programmed or stepwise freezing on human placental mesenchymal stem cells (pMSCs). Methods Programmed or stepwise freezing was applied to three batches of pMSCs cryopreservation at -196℃ for three months. Cell viability and proliferation were measured through Trypan blue staining and CCK8 assay after being thawed and seeded, respectively. We furtherdetermined the characteristic antigenic markers of mesenchymal stem cells by flow cytometry. The adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation capacities of pMSCs were also tested by Oil red O, Alizarin red S and Masson staining, respectively. Results There was no significant difference with respect to the cell viability between programmed and stepwise freezing of pMSCs before or after being thawed (P> 0.05). Both groups of pMSCs adhered after 24 h culture, and reached about 95% density after 96 h. The pMSCs proliferation was in a logarithmic phase between 3 to 5 d cell culture and then reached to a declined phase. Cell viability of pMSCs cryopreserved by programmed freezing was significant higher than that by stepwise freezing at 4 d (P< 0.01), 6 d (P< 0.05) and 7 d (P< 0.05) culture. Moreover, both methods preserved the expression of antigenic markers and differentiating capacity of pMSCs. Conclusion The cell viability and biological characteristics of pMSCs can be maintained well by programmed method or stepwise cryopreservation. It is worth mentioning that the programmed cryopreservation method should be used to obtain the seed cells with better proliferation ability under permissible conditions.【期刊名称】《中国医药生物技术》【年(卷),期】2017(012)006【总页数】7页(P513-519)【关键词】低温保存;胎盘间充质干细胞;程控降温法;二步法【作者】章毅;陈侃俊;李萍;李冉;陈亮;陆薇;伍婷;金魏名【作者单位】200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团附属干细胞医院;200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团附属干细胞医院;200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团附属干细胞医院;200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团附属干细胞医院;200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团附属干细胞医院;200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团附属干细胞医院;200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团附属干细胞医院;200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团附属干细胞医院【正文语种】中文方法分别采用程控降温法和二步法对 3 个批次的pMSCs 进行液氮冻存，3 个月后进行复苏，测定细胞存活率、活细胞数，观察体外培养1 ～4 d 时的细胞形态，CCK8法进行细胞增殖检测，同时用流式细胞术鉴定细胞表面标记抗原，用油红 O 染色、茜素红 S 染色和 Masson 染色进行细胞三向分化能力鉴定。

人羊膜间充质干细胞的研究进展

种因素的影响产生不了这么多的细胞。
原代ｈＡＭＳＣｓ呈梭形、星形或多角形，进行传代培养后，细胞表现为成纤维细胞样克隆，呈细长的梭
形，排列紧密，多呈放射状或漩涡状贴壁生长。电镜
观察发现，ｈＡＭＳＣｓ平均大小许多和肠道上皮细胞不一样的微绒毛，胞浆
内含有丰富的中间丝，脂质小滴和空泡也比较常见，
含有中等量的高尔基复合体、粗面内质网、线粒体和致密体，胞浆周围有自噬空泡和胞饮小泡，细胞或突
细胞表面标记物ＳＳＥＡ－４、ＯＣＴ－４，而ＯＣＴ－４被认为是多能干细胞自我更新和多项分化潜能的基因。进行定向诱导并检测是文献报道常用的鉴定干细胞的方法 …，一般对细胞进行成骨成脂诱导，经成骨
将其作为替代细胞移植治疗各种疾病，并且取得了较好的临床效果。本文就ｈＡＭＳＣｓ的分离培养、生物学特性、分化潜能、致瘤性及临床前研究等进展进行综述。
［关键词］人羊膜间充质干细胞；生物学特性；临床前研究；干细胞
口腔生物医学２０１３年６月（第４卷第２期）ＯｒａｌＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏ１．４，Ｎｏ．２，Ｊｕｎ．２０１３
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９５・

间充质干细胞在器官移植中的作用研究进展

【ｂｔｃ】ＭｓｎｈｍｌｔｅｓＭＣ）ａｉｆｂｏｌｔｉｏｕｔｎｗｉｒｐｒｏｎ，Ａｓａｔｒｅｃｙａｓｍｃｌ（Ｓｓｒａｋｄｏｆｒａ —ｋｐｐｌｉ，ｈｈａｌｉｔｔｅｅｌｅｎｂｓｌｅｉａｏｃｅｕｐｅ
且经诱导有向内胚层和神经外胚层谱系分化的能力，
这些细胞包括骨细胞、骨细胞、肪细胞和肌原细软脂
胞，还有肌细胞、上皮细胞、星形（质）胞、胶细神经元、肝细胞和内皮细胞等］２。ＭＳｓ虽然最初是从骨髓Ｃ中分离出来的，相似的细胞群也可以从其他组织中但
的可塑性，能分化成多种细胞并具有很高的自我更新能力。它不仅有免疫赦免特性，具有免疫还调节作用，可抑制同种异体免疫反应。在自身免疫性疾病的治疗、器官移植方面起着重要作用，具有十分诱人的前景，也是当前研究的热点和焦点。
【关键词】ＭＣ；Ｓｓ器官移植；免疫抑制
织比如胎儿的肺和血液。此外，带血也已经成为脐
ＭＳｓＣ的一个来源。
１７９６年，ｒｄｎｔｎ等根据骨髓来源的成纤维样Ｆｉｅｓｉｅｅ细胞和造血干细胞系对细胞培养皿底部的贴附性的差异，首次从兔骨髓中成功分离了ＭＳｓ】。随后的研Ｃ究发现，Ｃ不仅可以分化为中胚层的各种细胞，ＭＳｓ而
ｓｌ－ｅｅｎｅｌｗｉｈｏｅｔｌｏｄｆｅｅｔｔｎｏｖｒｕｅｌｙｅ．ＭＳｍｍｕｅｐｖｌｇａｅｂｅｘｅ・ｅｆｎｗｉｇｃｌｔｔｅｐｔｎｉｉｒｎｉｅｉｔａｏｓｃｌｔｐｓｒｓｈａｔａｉＣｓｉｎｒｉｅｈｖｅｎｅｔｎｉｅｓｅｙｓｕｉｄａｄｃａａｔｒｅｏｅｒｉｉｌｔｄｅｎｈｒｃｅｚｄｆｒｔｉｍｍｕｏｅｕａｏｙｐｏｅｔｓａｄｉｈｂｔｎａｌｉｖｉｈｎｒｇｌｔｒｒｐｒｉｎｎｉｉｏｌｍｍｕｉａｉｎＴｅｅｃｌｔｅｉｏｎｚｔ．ｈｓｅｌａｅｏｓｕｅｕｏｕｏｍｍｕｅｄｓａｅａｄｏｇｎｔｎｐａｔｔｎＡｔｒｓｎａｅｏｏｐｔｎｃｌｏｎｆｎｅｔｓｆｌｒａｔｉｆｎｉｓｎｒａｒｓｌｎａｉ．ｅｅｔｉｈｓｃｍｅａｈｔｏｄｆａｉｔｖｓｉｅａｏｐｔｂｓａｏｐｏｉ —

干细胞研究进展(综述)

面抗原［４１。Ｊｉａｎｇ等提供有力证据证明成体ＭＳＣ中确
实存在ＭＡＰＣ，目前已在成体骨髓、肌肉和脑组织中
分离、纯化并建株，不同来源的ＭＡＰＣ有相同的生物
学特性【“】。ＭＡＰＣ能在体外由单细胞水平分化为具有
中胚层系、神经外胚层系和内胚层系特征的细胞
［３，８－．１ｌｌ
病、免疫缺陷性疾病和遗传疾病等，可用于各种医学量放化疗损伤、放射病、脊髓损伤、外伤、心脏病、周
实验，几乎涉及所有医学范畴，具有广阔发展前景。围血管性疾病、糖尿病、早老性痴呆、帕金森症等【”。
二、干细胞分类
ＭＳＣ具有多向分化潜能，可分化为纤维母细胞、
干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞聊；在合适的条件
因子女口ＳＣＦ、Ｆｌｔ３、Ｔｐｏ、ＬＩＦ、ＩＬ一６、ＩＬ一１１、ＴｌＮＦ～０【等，
又能分化为骨髓基质细胞，与干细胞归巢密切相关，
在造血重建中具有非常重要的地位［１０１。ＭＳＣ不表达
ＨＳＣ表原
ＣＤ４５，而表达ＳＨ２、ＳＨ３、ＣＤ２９、ＣＤ１０６和ＣＤ１６６等表
的优势地位又取决于调控这些基因的一组系列特异类血细胞，在特定条件下还可跨系统分化，向骨、软
性的转录因子的作用，不同的转录因子系列可使干骨、神经胶质细胞、心肌、骨骼肌、肝细胞、血管内皮细
细胞向不同方向分化，即具有可塑性圆。目前已有可胞、皮肤、消化道细胞、肺基质等组织细胞转化【ｎ。其机
增殖和多向分化潜能的特性。干细胞由受精卵发育和成人的各种组织和器官中，平时处于静止状态或
分化而来，最初形成原始胚胎干细胞，进一步分化增分裂缓慢，在损伤或血小板活化，释出组织生长因子

间充质干细胞治疗神经病理性疼痛的研究进展

［基金项目］国家自然科学基金（８１５７２２０５、８１９７４３４５）△［通信作者］孟纯阳，Ｅｍａｉｌ：ｃｈｕｎｙａｎｇｍｅｎｇ１６＠１６３．ｃｏｍ济宁医学院学报２０２０年１２月第４３卷第６期　ＪＪｉｎｉｎｇＭｅｄＵｎｉｖ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０２０，Ｖｏｌ４３，Ｎｏ．６ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００９７６０．２０２０．０６．０１２间充质干细胞治疗神经病理性疼痛的研究进展燕春州　综述孟纯阳△　审校（济宁医学院临床医学院，济宁２７２０１３；济宁医学院附属医院，济宁２７２０２９）摘　要　神经病理性疼痛（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃｐａｉｎ，ＮＰ）是指由神经系统损害或功能障碍引起的慢性疼痛，表现为自发性疼痛、痛觉过敏、异常疼痛和感觉异常等临床特征。

间充质干细胞是一类具有干细胞特征的非造血多功能成体干细胞。

研究证实多种来源的间充质干细胞均能有效缓解ＮＰ。

间充质干细胞可通过抑制炎症反应、改善运动功能、缓解机械痛敏和热痛敏等方面治疗ＮＰ。

本文就间充质干细胞治疗ＮＰ的研究进展做一综述。

关键词　间充质干细胞；神经病理性疼痛；坐骨神经损伤中图分类号：Ｒ４５６文献标识码：Ａ文章编号：１０００９７６０（２０２０）１２４２８０４ＲｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃｐａｉｎＹＡＮＣｈｕｎｚｈｏｕ，ＭＥＮＧＣｈｕｎｙａｎｇ△（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＪｉｎｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｉｎｇ２７２０１３，Ｃｈｉｎａ；ＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＪｉｎｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｉｎｇ２７２０２９，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃｐａｉｎ（ＮＰ）ｒｅｆｅｒｓｔｏｃｈｒｏｎｉｃｐａｉｎｃａｕｓｅｄｂｙｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍｄａｍａｇｅｏｒｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｉｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｙｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｐａｉｎ，ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ，ａｂｎｏｒｍａｌｐａｉｎａｎｄｓｅｎｓｏｒｙａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ，ｅｔｃ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｒｅａｋｉｎｄｏｆｎｏｎｈｅｍｏｇｅｎｉｃｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｗｉｔｈｓｔｅｍｃｅｌｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．ＳｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｍａｎｙｓｏｕｒｃｅｓｃａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙａｌｌｅｖｉａｔｅＮＰ．ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｐｌａｙａｒｏｌｅｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＮＰｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｍｏｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄｒｅｌｉｅｖｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｃａｌａｎｄｔｈｅｒｍａｌｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ．ＡｒｅｖｉｅｗｏｆｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＮＰｉｓｐｒｅｓｅｎｔｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ；Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃｐａｉｎ；Ｓｐａｒｅｄｎｅｒｖｅｉｎｊｕｒｙ神经病理性疼痛（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃｐａｉｎ，ＮＰ）是通常由外伤、感染或局部缺血引起，神经系统的原发病变或功能障碍引发的进行性神经系统疾病。

脐带间充质干细胞的研究进展

更短，具有更强的扩增能力，７代后可扩增３００倍；Ｌｕｎｄ等 ” 的研究认为一条人脐带共可扩增到１０个细胞；ＵＣ．
中华临床医师杂志（电子版）２０１２年３月第６卷第６期ＣｈｉｎＪＣｌｉｎｉｃｉａｎｓ（ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＥｄｉｔｉｏｎ），Ｍａｒｃｈ１５，２０１２，Ｖｏ１．６，Ｎｏ．６
脐带包含丰富的干细胞，每条脐带的ＭＳＣｓ的数目４×１０，密度为（１Ｏ～１５）×１０／ｃｍＪ，而每份脐血中的数目是（１—５）× １０，骨髓中的数目是每１０单个核细胞中含有１—１０个
ＭＳＣｓ［５２－５４］。
三、ＵＣ—ＭＳＣｓ的生物学特性由于脐带基质细胞的结构特征和主要功能与成纤维细胞相似，早期认为这些细胞是 “特殊的成纤维细胞 ”。以后进一步的研究示，这些细胞既不是成纤维细胞也不是平滑肌细胞，而是肌纤维母细胞，在超微结构上具有平滑肌细胞和成纤维细胞的特点，表达收缩蛋白如肌动蛋白、非肌球蛋白、索蛋白和ｄ－平滑肌肌动蛋白（肌纤维母细胞的标志）［２ｏ，３５，３９］，而肌球蛋白不表达。另外这些细胞还表达波形蛋白，这种中间丝蛋白表达于间充质来源的细胞如成纤维细胞，而不表达于平滑肌细胞。共表达波形蛋白和索蛋白提示这些细胞本质上是肌纤维母细胞。
时间从３０ｍｉｎ＿４至１６ｈ＿舶不等，取决于消化液的剂量和组织块的体积。然后用孔径７０—１００ｍ的滤网过滤以去除组织碎片。也可以不用酶消化，而采用组织块培养法。

胎盘干细胞储存是骗局吗

胎盘干细胞储存是骗局吗？最近，来自哈尔滨的孕妈张女士被一件事困扰，那就是“胎盘干细胞有没有必要保存”。

张女士介绍，在给她做订制孕产服务的高端妇产医院里的很多孕妈，都签了存储胎盘干细胞的合同，她和婆婆商量过，也想等孩子出生了，把孩子的胎盘存起来，但是婆婆对这件事无动于衷，倒是反问张女士“存她有什么用，存它倒不如吃了它”。

这让张女士很为难，因为她听已经签署存储胎盘干细胞合同的孕妈说，胎盘干细胞是无价之宝，不仅能预防、治疗疾病，还有美容抗衰老功效，预防、治疗疾病用不上的话，可以等自己年龄大了，皮肤松弛了用在美容抗衰老上。

这个存储的机会，一生也就一次，而且价格也不贵，如果不存的话，那就是丢弃了一个无价的宝藏。

那么，胎盘干细胞储存是骗局吗？胎盘干细胞有没有必要保存呢？胎盘干细胞究竟有什么作用？真的像上文中的孕妈说的那么神奇吗？焕生汇细胞存储银行的专家为我们介绍：胎盘间充质干细胞被誉为“全能种子细胞”，是目前证实的干细胞最佳来源。

它具有强大的增殖能力和多向分化潜能，可以联合脐带血干细胞共同治疗血液系统疾病和免疫系统疾病，促进造血功能，弥补脐带血细胞用量不足的问题。

截止目前，全球被批准的10个干细胞药物中，有9个是与间充质干细胞相关的。

来自胎盘的间充质干细胞目前涉及的疾病领域已超过了100种，包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等免疫系统疾病；帕金森、老年痴呆等神经系统疾病以及软骨损伤、骨关节炎等骨科疾病，这让胎盘干细胞成为了生命健康的宝库。

同时，干细胞也具有促进细胞再生、恢复器官年轻态、延缓衰老、美容等多种功效。

科学研究证实，异体使用间充质干细胞无需配型，且血缘越近，疗效越好，存储孩子一人的胎盘，可供全家多次使用，是整个家庭的健康保障。

采集胎盘主要就是保存里面的间充质干细胞，采集和提取不会给宝宝和妈妈造成任何伤害，且都是孩子一生只有一次的机会。

将这些干细胞存储起来，可以随用随取，而且宝宝自存，受益全家。

随着干细胞科学的飞速进展和越来越多的干细胞临床应用，新生儿干细胞储存将成为更多家庭保障、全家健康的新选择。

胎盘蜕膜间充质干细胞分离培养SOP

胎盘蜕膜间充质干细胞分离培养SOP一、样本接收1.正常足月顺产男婴，与产妇及其家属签署知情同意书后，在产房无菌条件下获取胎盘，放至无菌袋中，4℃运输至细胞中心。

2.观察运输箱的温度是否符合要求，采集瓶有无渗漏。

3.查看客户信息是否与交接表一致。

4.样本采集瓶外表面喷酒精擦拭消毒，并粘贴样本编码，填写样本接收记录，传入洁净区准备制备。

二、胎盘蜕膜间充质干细胞分离与接种1.准备耗材试剂：15cm培养皿、15ml离心管、50ml离心管、离心管架、10ml 移液管、T75培养瓶、离心管架、无尘布、封口膜、100目滤网过筛、灭菌手术刀、灭菌止血钳、灭菌镊子、灭菌剪刀、废液缸、无血清干细胞培养基（常温复温）、DPBS、双抗、75%酒精（已过滤）、Ⅰ型胶原酶。

2.仪器设备准备及预热：生物安全柜、二氧化碳培养箱、离心机、电动移液器、倒置相差显微镜、摇床（37℃150r/min）。

3.将75%酒精喷到台面，用无尘布擦拭台面，包括侧面及玻璃。

4.将生物安全柜开紫外30min通风10min，样本喷酒精擦拭，放入生物安全柜中，实验中所需要的相关试剂及耗材等喷酒精擦拭放入生物安全柜中。

5.取无菌托盘，加入含1%青链霉素的DPBS，将胎盘组织放入其中，并取适量样本保存液留样送检支原体。

并洗涤组织两三次，洗去表面的血污，直至清洗的液体无血色。

6.清洗结束后，将胎盘放入无菌托盘中，然后使用无菌剪刀分离胎盘底部靠近母体一侧的蜕膜组织，再将蜕膜组织剪碎至1-3mm3的微小组织块，加DPBS定容离心，500g 5min。

7.离心结束后，去上清。

按照蜕膜组织与消化液体积比为2:5的比例加入消化酶，在37℃150r/min的条件下震荡消化至少一个小时，再按消化酶与0.05%的胰酶体积比为1:1的比例加入0.05%的胰酶，在37℃150r/min的条件下震荡消化15min。

8.用无血清干细胞培养基终止消化，吹打悬液20-30次，打散组织，混匀细胞，将消化的组织液通过100um细胞筛网过滤出组织和胎盘蜕膜间充质干细胞两部分，组织留在滤网上，下层则是细胞悬液，加DPBS定容混匀离心。

间充质干细胞应用现状及展望

素）难治性急性ＧＶＨＤ患者中，６例在输注ＭＳＣ后急性ＧＶＨＤ症状完全消失，治疗有效者最长存活３年。
该研究认为，ＭＳＣ治疗ＧＶＨＤ可采用的剂量范围为（０．７～９．０） ×１０。／ｋｇ，可进行单次或两次输注，未出
及器官移植的临床与基础研究。兼任中华医学会外科学分会常务委员、外科手术学
组组长，中华医学会器官移植学分会常务委员、肝移植学组副组长，广东省医学会外科学分会主任委员，广东省医学会器官移植学分会名誉主任委员，广东省医学会常务理事，广东省医师协会副会长，国家自然科学基金评审专家。《中华肝脏外科手术学电子杂志》、《器官移植》、《新医学》总编辑，《中国实用外科杂志》、《中华消化外科杂志》、《中华普通外科学文献（电子版）》、《循证医学》副总编辑，《中华外科杂志》、《中华器官移植杂志》、《中华肝胆外科杂志》等编委。曾获“ 国家科学技术进步二等奖” 、 “ 教育部科学技术进步一等奖” 、 “ 教育部科学技术成果推广一等奖” 、 “ 广东省科
十划项目（２０１０Ｂ０５０７０００３）；广州市科技计划项目（２０１０Ｊ — Ｅｌ２１，２０１１Ｙ１ — ０００３３ — ３）；中央高校基本科研业务费专项资金
ｃｋｐｙ４３）
Ｅ：５１０６３０广州，中山大学附属第三医院肝移植中心中山大学器官移植研究所广东省器官移植研究中心