斑马鱼胚胎发育的不同阶段
斑马鱼饲养及繁殖孵化过程研究
斑马鱼饲养及繁殖孵化过程研究摘要：斑马鱼是一种重要的脊椎动物模式生物，因其胚体全透明，繁殖速度快，使用样品量少，饲养成本低，而被作为一种理想的模式动物广泛的应用于科学试验。
本实验通过对斑马鱼生长条件研究，探究斑马鱼可以生长的适宜条件，并在一定条件下使斑马鱼产卵，探究斑马鱼孵化及鱼苗生长条件，建立斑马鱼的养殖平台，为之后进行斑马鱼毒性急性急性实验奠定良好的基础。
关键词：斑马鱼；生长发育；繁殖；胚胎发育孵化；鱼苗斑马鱼（学名：Barchydanio rerio var，别名：蓝条鱼）是一种重要的低等脊椎动物模式生物，因其具有个体小、生殖周期短、繁殖能力强及胚胎透明便于观察等优点，被广泛应用于发育生物学、环境毒理学、免疫学等领域[1]。
斑马鱼在基因水平上87%与人类同源，早期发育也与人类极为相似，这使得斑马鱼及其胚胎在人类疾病的研究中有重要的应用价值[2，3]。
其胚胎、幼鱼和成鱼最早是被用来检测水中的有毒物质和致畸物[4]。
Streisinger 等[8]于 1981 年首次将斑马鱼与遗传学和生物学领域划上联系，使其研究领域得以拓展和延伸。
目前，斑马鱼已被广泛用于遗传学、生态毒理学、药物药效活性物质筛选、药物代谢、药物毒性物质筛选等方面[9]。
该实验通过观察斑马鱼的形态特征，生活习性，繁殖发育，调节孵化条件，熟悉并建立斑马鱼养殖、繁殖、孵化、鱼苗养殖等一系列养殖平台，为之后开展斑马鱼相关生理药理实验奠定基础。
1实验材料1.1 实验用鱼成年AB系斑马鱼，六月龄，来源于斑马鱼科研服务中心1.2 仪器与设备T-240F9L水族箱（宝潮水族专营店）；产卵缸（南京一树梨花生物科技有限公司）培养皿若干、斑马鱼饲料（斑马鱼科研服务中心）、控温棒（斑马鱼科研服务中心）、生化培养箱（上海坤天实验室仪器有限公司）、6孔板、电子分析天平（万分之一赛多利斯科学仪器有限公司）。
1.3 实验试剂无水乙醇、500ml硝化细菌菌液、260ml水质稳定剂（上海寸景水族用品有限公司）、250ml胚胎培养液、亚甲基蓝（分析纯，成都市科龙化工试剂场2斑马鱼形态及习性2.1外形及雌雄鱼分辨AB型斑马鱼（野生型）体长为4～6cm，最大体长可达8cm。
斑马鱼两种转基因方法的比较
斑马鱼两种转基因方法的比较柳晓瑜;王豪博;仇雪梅;于旭蓉;刘洋;王秀利【摘要】对斑马鱼(Danio rerio)的两种转基因方法进行比较,分别采用显微注射和电脉冲导入法将携带有GFP报告基因的表达载体质粒导入斑马鱼受精卵,得出电脉冲最佳导入条件为最适电压125 V/cm,电阻50 Ω,最佳导入时期为1-2细胞期(40-50 min),以及最佳外源基因浓度为300 ng/μL.利用两种方法均得到转GFP基因的斑马鱼,而两种方法对比的结果表明,显微注射法耗时费力,但转基因阳性率高；电脉冲法一次可以处理大批量受精卵,但转基因阳性率远低于显微注射法.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)012【总页数】5页(P205-209)【关键词】斑马鱼;显微注射;电脉冲导入法;转基因效率【作者】柳晓瑜;王豪博;仇雪梅;于旭蓉;刘洋;王秀利【作者单位】大连海洋大学生命科学与技术学院,大连116023;大连海洋大学生命科学与技术学院,大连116023;大连海洋大学生命科学与技术学院,大连116023;大连海洋大学生命科学与技术学院,大连116023;大连海洋大学生命科学与技术学院,大连116023;大连海洋大学生命科学与技术学院,大连116023【正文语种】中文自20世纪80年代首批转基因鱼诞生以来［1］，世界范围内掀起了转基因鱼研究的热潮，很多实验室都进行了一系列的转基因鱼的研究［2］。
目前，已有多种转基因技术应用于转基因鱼的培育和品种改良。
其中显微注射应用的最为广泛，1984年，我国科学家朱作言［1］应用显微注射的方法将人的生长激素基因注射到了鱼的受精卵原核，获得了生长速度快的转基因鱼。
之后显微注射技术被广泛应用，并日益改进和完善。
其次，电脉冲基因导入法和精子介导法在鱼类转基因的研究中也被大量使用。
Aliye等［3］应用电脉冲基因导入法将Cecropins基因导入青鳉受精卵中，得到了少量的转基因个体，但检测结果显示，这些阳性个体的抗菌活性明显高于对照组。
斑马鱼模式生物简介
姓名：谭克强专业：生物技术学号：2009211803斑马鱼模式生物简介斑马鱼是在印度和巴基斯坦河里发现的一种鲤鱼。
成年3~4cm 长，有漂亮的花纹，群居生活。
在实验室里，斑马鱼广泛用于标准毒理学检验。
1996年，一系列论文报道斑马鱼胚胎发育的突变体的筛选及鉴定[1]，揭开了斑马鱼广泛应用于基因组功能分析、获得与脊椎动物发育和疾病相关的新基因研究的序幕。
斑马鱼(Danio rerio)作为水生脊椎动物的代表, 是现代遗传学、细胞生物学及发育生物学等研究的常用模式动物。
生物信息学预测认为, 斑马鱼基因组可能编码超过 400 种 miRNAs[2]。
通过构建不同发育阶段斑马鱼的小 RNA cDNA 文库发现, 斑马鱼miRNAs总数已经达到217个[2], 其中一些miRNAs在斑马鱼中的功能已经被解析。
miRNAs整体缺失对斑马鱼胚胎发育的影响研究结果表明, 缺失 miRNAs 的斑马鱼胚胎早期发育过程明显缓慢, 最初的 24 h 发育进程就被延迟了 3~4 h。
在原肠胚发育过程中, 突变胚胎不能进行正常的外包和内卷, 正常胚胎的索前板迁移发生在 80%外包时期, 而突变胚胎由于外包的推迟, 索前板迁移发生在 50%~60%外包时期。
此后, 由于体轴延伸减少导致胚胎缩短和脑部区域细胞的积累。
而在发育晚期, Dicer 突变胚胎后部卵黄延伸的范围也减少[3]。
Dicer 突变严重影响了神经胚形成。
由神经板发育成神经管的过程不能正常完成, 使神经管变成一个实心的棒状结构。
Dicer 突变胚胎脑内缺乏脑间隔而导致脑室数减少, 神经管腔的缺失和神经底板的减少表明脊髓发育也被干扰。
另外, 视网膜的发育也受到影响。
尽管神经系统发育畸形, 基因表达分析却发现, 神经管的前-后轴和背-腹轴图示均没有被完全破坏, 说明胚胎神经系统的图式形成和命运决定过程受到 miRNAs 的影响较少, 而脑的正常发育和神经细胞分化却需要 Dicer 酶的作用[3]。
温度对斑马鱼胚胎发育的影响研究
胚胎发育的最适温度。董武等认为[1]：斑马鱼胚胎发育最适 温度为 25~29 ℃，其中 26℃为最佳温度，但我们的实验结果 显示，从发育速度，死亡率和出膜率等方面考虑，最佳发育温 度应该为 28℃。这可能与不同的鱼在不同的生活环境有其 不同的适宜温度范围有关。即使同一种鱼, 在不同的环境条 件中生存较长时间后，也会有不同的适宜其生长、发育的温 度范围。
死亡率 /%
时间 /h 图 3 不同温度下 13 h 内受精卵的死亡数随时间变化曲线 2.1.3 84 h 内不同温度处理时受精卵累积死亡情况
由图 4 可以看出，在 26℃和 28℃时，受精卵累积死亡 率(D)最低，随温度升高或降低，D 值都相应增大，并且较低 温度时对 D 的影响明显高于较高温度的影响。由图 5 可以 看出，不同温度处理对受精卵的出膜率也是有影响的，在 28℃时出膜率最高，随温度的升高或降低，出膜率都相应降 低，并且低温对出膜率的影响明显高于高温的影响。
第4期
温度对斑马鱼胚胎发育的影响研究
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平行组除温度以外的其他因子一致。 1.2.2 温度对斑马鱼受精卵的影响
通过调温电加热棒保证水温恒定，设 6 个梯度: 22℃、 24℃、26℃、28℃、30℃、32℃，同一温度梯度的两平行组放在 同一外套玻璃缸中，以保证同一处理温度的统一。日常通过 换水擦洗等维持水质稳定，每日对水温进行观察调控，保证 波动温差 < 0.3℃。实验分 3 部分：正常条件下受精卵死亡情 况，13 h 内不同温度处理时受精卵死亡情况和 84 h 内不同 温度处理时受精卵累计死亡情况。
参考文献
[1] 董武.斑马鱼及相关实验技术[M].北京：中国海洋大学出版社， 2006.
[2] 温室设计标准[S].北京：中国农业出版社,1998. [3] 周长吉.温室工程设计手册[M].北京：中国农业出版社,2007. [4] 建筑结构荷载规范[M].北京：中国建筑工业出版社，2006.
斑马鱼的培养及TALENs技术的应用
“斑马鱼的培养及TALENs技术的应用”预习报告一、实验原理1、TALENs实验技术原理类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)是最近发展起来的一类新型的人工核酸内切酶, 它由特异性的 TALE DNA 结合结构域和非特异性的 FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。
TALEN 能够根据用户需要切割特定的核苷酸靶序列, 造成 DNA 双链断裂, 从而诱导该靶序列产生 indel突变。
2、斑马鱼的生活习性以及作为模式生物的优势斑马鱼是生长在印度、巴基斯坦淡水河流中的一种硬骨鱼（鲤鱼），成年鱼全身仅长4－5厘米，因全身横向分布着一道一道褐色的斑马线而得名。
斑马鱼很容易在实验室饲养，一般3个月就可以达到生殖成熟期，雌鱼每次产卵200枚左右，一生可产卵数千枚，斑马鱼所产之卵经24小时即可胚胎发育成熟，仔鱼期只有1个月。
更独特的是，斑马鱼的卵是透明的，整个胚胎发育在体外完成，也是透明的。
优势：显著优势在于体积小( 3cm～4 cm)，可在较小的空间大量繁殖；产卵量高(每周200多个)；发育快，许多组织在受精后24 h开始形成；成熟周期短；体外受精且胚胎透明，可在体视解剖镜下观察；单倍体、雌核发育二倍体的制作和突变体的获得均较容易；精子可以冷冻保存。
所有这些特点都使斑马鱼非常适合于遗传学的研究。
斑马鱼的基因组中大约含有30000个基因，这个数目与人类差不多，而且它的许多基因与人类存在一一对应的关系。
它的神经中枢系统、内脏器官、血液以及视觉系统，在分子水平上85%与人相同。
二、实验目的通过本实验可以了解TALENs实验技术的基本原理，熟悉其几个关键实验步骤的操作，学习显微注射技术，从而能够独立应用这些技术进行相关学术研究。
三、实验器材1、实验仪器超净工作台(细菌操作用)、细菌培养摇床、台式离心机、凝胶电泳仪、凝胶电泳槽、凝胶成像仪、水浴锅、恒温培养箱、漩涡振荡器(Vortex) 、 NanoDrop(ND-1000 Spectro pho tometer)、PCR 仪，体视显微镜、恒温培养箱、配鱼缸、台式冷冻离心机 1.3.2 耗材细菌培养皿、移液枪、移液枪枪头、Eppendorf 离心管、PCR 管、显微操作仪，倒置显微镜，拉针仪，胶头滴管，胶固定板。
斑马鱼胚胎发育过程中的基因调控机制研究
斑马鱼胚胎发育过程中的基因调控机制研究斑马鱼是一种高度透明、易于研究的水生生物，因此成为了研究生物学的理想模型。
在斑马鱼的胚胎发育过程中，基因调控机制扮演着关键的角色，控制着发育的每个阶段。
本文将介绍斑马鱼胚胎发育过程中的基因调控机制的研究现状和研究进展。
一、基因调控网络的建立要研究斑马鱼胚胎发育过程的基因调控网络，首先需要识别和鉴定参与发育调控的关键基因。
通过全基因组筛选和高通量测序技术，科研人员可以在斑马鱼中鉴定出数千个关键基因并建立基因调控网络。
实例研究：一项研究使用了大规模chIP（染色质免疫共沉淀）测序技术，在斑马鱼胚胎中鉴定了数千个与基因转录调控相关的转录因子和DNA结合蛋白基因。
这项研究为构建斑马鱼基因调控网络提供了基础数据。
二、基因表达调控机制的研究与其他多细胞生物一样，斑马鱼的基因表达调控机制包括转录后修饰、microRNA调控等多种方式。
这些调控机制之间相互交织、紧密联系，共同控制着斑马鱼胚胎发育过程。
实例研究：基因表达调控机制的研究需要集成多种技术手段，如RNA测序、原位杂交、Western blot等。
一项研究通过整合这些技术手段，发现成纱突即成胆突转化过程中，转录因子sox32通过调控mir-21基因的表达，促进了细胞转化的过程。
三、非编码RNA调控机制的研究非编码RNA（non-coding RNA）是指不具有编码蛋白的RNA分子，包括有机体内丰富的microRNA、small interfering RNA等。
在斑马鱼胚胎发育过程中，非编码RNA发挥着重要的调控作用，参与调控基因表达、细胞分化等过程。
实例研究：研究人员使用转录组测序技术，发现在斑马鱼的转变腹盘（metamorphic olfactory placode）转化过程中，miR-130b的表达量显著上调。
miR-130b通过抑制蛋白质转录调节因子Dlx3b的表达，从而协调着细胞转化过程。
四、基因表达时序调控机制的研究在斑马鱼胚胎发育过程中，基因表达的时序也是关键的。
斑马鱼的品种介绍-斑马鱼怎么样？
斑马鱼的品种介绍-斑马鱼怎么样？斑马鱼的品种介绍-斑马鱼怎么样？斑马鱼的简介斑马鱼，是一种常见的热带鱼。
斑马鱼性情温和，小巧玲珑，几乎终日在水族箱中不停地游动，易饲养，可与其他品种鱼混养。
饲养水温20～23℃，在水温11～15℃时仍能生存。
斑马鱼体型纤细，孵出后约3个月达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次。
卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。
发育温度要求在25-31℃之间。
斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育。
由于斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视。
鱼胚胎突变体是研究胚胎发育分子机制的优良资源，有的还可做为人类疾病模型，斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一，在其它学科上的利用也显示很大的潜力。
斑马鱼怎么样？斑马鱼体色为银色或金色，覆盖著一些蓝色或紫色的横纹，这些横纹从头部延伸至尾鳍的后端，臀鳍和尾鳍上同样也有这种条纹，背部呈浅橄榄黄。
雄鱼比雌鱼更修长，但略小一些。
体长可达3.8厘米。
有许多人工培养的品种。
华盛顿大学西雅图一直在对斑马鱼进行研究，试图解决人类听力丧失的问题。
和许多其他水生生物一样，斑马鱼在身体表面长有毛细胞。
这些毛细胞的作用是探测水中的振动，其原理与人类内耳中的毛细胞相似。
但是，与人类不同的是，斑马鱼的毛细胞在受损后还可以再生。
研究人员希望他们的工作可以揭开谜底，保护人类的毛细胞免受损伤、并推动毛细胞的再生。
斑马鱼的品种介绍蓝斑马、红斑马、黄斑马、喷点斑马、电光斑马、闪电斑马、豹纹斑马、虹带斑马、火红金线斑马、银河斑马、蓝带斑马、虎纹斑马等。
斑马鱼是研究发育生物学的新兴模式动物。
斑马鱼由于具有饲育容易、胚胎透明、体外受精、突变种多、遗传学工具成熟等诸多优点，已成为研究脊椎动物发育与人类遗传疾病的新兴模式动物。
模式生物斑马鱼PPT课件
小鼠属于胎盘动物，胚胎操作时不能离开母体；实验分析时就需 要大量推论。在小鼠胚胎发育期间对其进行物理性操作难度较大，要观 察胚胎必须将母体处死，胚胎也随之死亡。小鼠的胚胎从受精到出生需 要20d，早期胚胎间的发育往往是不同步的。
斑马鱼的发育分为6个阶段：卵裂期，囊胚期，原 肠胚期、分裂期、成形期和孵化期。
第2页/共12页ຫໍສະໝຸດ 能够作为模式生物的主要原因：
1、价格便宜，容易获得。 成年斑马鱼的体长仅4cm左右，而且能承受高密度饲养—每升水
中最多可容纳5尾，意味着容易饲养大量群体，管理饲养易行。相比之 下，小鼠需要的空间要大，而且花费相对要高。
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一、斑马鱼在发育生物学中的应用
3、饱合诱变分析 用化学诱变剂处理成熟的雄性个体，然后用诱变了的精子与卵子受
精，产生的个体通过三代繁育来筛选发育异常的胚胎。因为发育过程是 由一系列的分子事件控制，要想解析完整的发育过程，必须要筛选到影 响一系列事件的全部基因或几乎全部基因，这就需要大量的动物个体进 行筛选。胚胎在子宫中发育，胚胎期受到影响的突变体无法呈现，因而 限制了其研究范围。斑马鱼卵子体外受精和胚胎体外发育的特征则解决 了这一难题。
是左鼻子。日本名古屋市立大学研究人员报告说，随着斑马鱼发育，大脑 中负责嗅觉的基因只在左脑中强烈发挥作用，因此左鼻就成了主要发挥作 用的鼻子。研究人员堵住斑马鱼的左鼻后，它就不再朝着散发它喜欢气味 的方向游动，从而证明是左鼻负责分辨气味。对斑马鱼的深入研究，未来 有利于人们弄清人脑中产生左右差异的机制。
可以揭开谜底，保护人类的毛细胞免受损伤、并推动毛细胞的再生。
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斑马鱼实验报告
2023级医学实验技术专业《细胞生物学实验技术》课程实验报告学号姓名成绩实验16-18 综合实验（具体实验内容）一．实验原理在规定的条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液，以120h为一个实验周期。
期间记录实验鱼的存活率、畸形率、22h、27h自主摆尾、48h心率、72h孵化率、120h体长，以此评估重金属／中药单体的安全浓度范围。
通过鱼类急性毒性试验可以评价受试物对水生生物可能产生的影响，以短期暴露效应表明受试物的毒害性。
鱼类急性毒性试验不仅用于测定化学物质毒性强度、测定水体污染程度、检查废水处理的有效程度，也为制定水质标准、评价环境质量和管理废水排放提供环境依据。
我国可采用的实验鱼有四大养殖淡水鱼（青鱼、草鱼、鲢鱼和鳞鱼）、金鱼、鲫鱼、野生的食蚊鱼、斑马鱼等。
本实验选用斑马鱼作为实验材料。
二．实验器材斑马鱼胚胎，重金属三．实验试剂二甲基亚飙，超纯水，E3培养基（5 mM NaCl 、0.17 mM KCI 、0.33 mM CaCI2、0.3mMMgSO4)四．实验步骤1．暴露浓度配制重金属1、10、100pg/ L2．斑马鱼胚胎培养及暴露取性成熟斑马鱼所产正常胚胎，于受精后2h内在解剖显微镜下观察，随机挑选发育正常处于囊胚期的胚胎约5000颗，重金属不同度组、共暴露5d，对照组为0.01%DMSO( v / v ）或超纯水＋E3培养基暴露，不做任何处理。
每天更换暴露液。
各组斑马鱼胚胎／幼鱼以14h/10h的光暗周期培养于（28.0±0.5)" C 的稳定环境中，实验组暴露至受精后120h。
3．暴露期间观察指标每日定时于倒置显微镜下观察并记录各组斑马鱼各项生长指标，包括胚胎孵化率，畸形率（畸形包括原肠胚终止、脊柱畸形、心包囊水肿等），存活率，22h、27h自主摆尾，48h心率。
4．收样在收集样本当天，检测斑马鱼的体重和体长将斑马鱼仔鱼于0.03%MS-222中麻醉，样本收集于EP 管中，-80℃冷冻保存。
温度对斑马鱼胚胎发育的影响
温度对斑马鱼胚胎发育的影响李忻林;董洪坪;王婷;黄四洲;蔡佩玲【摘要】目的探讨温度对斑马鱼胚胎发育速度及器官分化的影响.方法将带绿色荧光的转基因斑马鱼胚胎分配至3个培养皿中,各放160个胚胎,分别放置于28.5℃(标准发育温度)、31℃(高温)和25℃(低温)3个不同温度中进行孵育,孵育至3h、6h、10 h、24h和48 h时进行观察拍照,并在36 h、48 h和72 h时用荧光显微镜观察胚胎的心脏和血管,比较不同温度对胚胎发育进程及各器官发育的影响.结果3种温度下,胚胎存活率分别为92.5％、89.4％和91.25％,没有显著性差异.相同发育时间内,与标准温度中发育的胚胎相比,31℃中的胚胎发育较快,而25℃的胚胎发育所处的时期较早.发育到相同分期,31℃所需时间比标准温度短,而25℃所需时间长.3个不同温度下,胚胎心脏和血管的发育均不受影响.结论高温促进胚胎发育,低温延迟发育,但高温或低温均不影响胚胎器官正常发育.结合实际科研需要,可通过调控温度来调节斑马鱼胚胎的发育进程.【期刊名称】《四川动物》【年(卷),期】2014(033)006【总页数】7页(P829-835)【关键词】温度;斑马鱼;胚胎;发育【作者】李忻林;董洪坪;王婷;黄四洲;蔡佩玲【作者单位】成都大学医护学院,成都610106;成都医学院基础医学院,发育与再生四川省重点实验室,成都610500;成都医学院基础医学院,发育与再生四川省重点实验室,成都610500;成都大学医护学院,成都610106;成都医学院基础医学院,发育与再生四川省重点实验室,成都610500;成都大学医护学院,成都610106【正文语种】中文【中图分类】Q132.4斑马鱼(zebrafish, Danio rerio)有诸多优点，1)有近似人类的各种器官系统，如心血管系统、神经系统(Schmidt et al., 2013)等，适合研究胚胎及器官发育；2)体外受精且早期胚胎透明，利于观察发育中完整的形态变化；3)养殖设备简单且成本低；4)性成熟周期短，繁殖能力强，3～4个月即发育成熟，每周可交配一次，每次产卵100～300枚；5)易进行诱发突变及转基因操作来研究基因功能。
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斑马鱼胚胎发育的不同阶段
1）
2）
3）
1.5小时，受精卵卵裂，该时期为16
细胞期
2小时，受精卵继续卵裂，细胞堆叠
明显变高
4）
5）
6小时，可以看到动物极被卵裂的细
胞包围起来，大概整个受精卵的一半
被外面的一层细胞包围
9小时，细胞通过外包运动从腹侧区迁
往背侧，进一步包围受精卵
6）
19小时，胚胎显著增长，鱼体躯干开
始伸直，尾部显著发育
24小时，胚胎进一步发育，尾部伸直，
躯干和尾部可发生侧向收缩