植物脱毒技术2---无病毒植物检测的方法电子教案
植物脱毒技术
一、授课章节
植物脱毒技术2---无病毒植物检测的方法。
二、学时安排
2学时。
三、教学目标
1．了解无病毒植物检测的方法。
四、教学重点、难点分析
重点：
检测方法。
难点：
检测。
五、教具
电化教学设备, 试管苗。
六、教学方法
讲授法，演示法。
七、教学过程
Ⅰ导入
植物脱毒的病毒病仅次于真菌类病害，对农业生产造成了巨大的损失，如何通过一些技术手段来达到去除植物体内病毒，恢复种性或进行生产，这就是植物脱毒技术。
II新课
三、无病毒植物的检测
（一）直观检测法
对于非潜隐性病毒，可以直接观察植株茎叶有无这一病毒可见的症状特征，这是一种最简便的方法，然而对于潜隐性病毒就需要更敏感的测定方法。
（二）指示植物检测法
指示植物检测是利用病毒在植物体上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的依据，也叫枯斑测定法。这种专门用以产生局部病斑的寄主称为指示植物，又称鉴别寄主。
1.检测方法
1
诱变物质的微核检测技术
诱变物质的微核检测技术 一．实验目的 1.了解微核检测的方法和意义 2.通过检测评价环境中常见物质的诱变情况 3.锻炼自主设计实验的能力 二．实验原理 微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。 在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。 微核的形成原理 一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。 当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。 第一、二次减数分裂后期的落后染色体，将在末期形成微核
第一次减数分裂末期，落后染色体和片段形成微核 引起染色体断裂的理化因素： 物理因素：具有能量的各种射线均可以作用于DNA导致链的断裂，如α射线，β射线，γ射线，X-ray ，中子，质子，UV 化学因素：许多诱变剂和重金属都可能引起染色体畸变，如环磷酰胺，氧化铬CrO3，叠氮化钠NaN3，甲级磺酸乙酯EMS，硫酸二乙酯 通常染色体断裂之后有三条发展途径：1，两个断裂端重新愈合回复到原来的染色体结构。2，断裂的连接修复发生错误，产生染色体变异：缺失，重复，倒位，异位等。3断裂的染色体不愈合，细胞分裂时形成微核，最后丢失。 微核细胞率 含有微核的细胞数占观察细胞总数的比率称为微核细胞率（千分率），简称微核率。①微核细胞率可以用来反映遗传物质受损伤的程度；②在一定的剂量范围内，微核率与环境因子的剂量呈正相关③人们常用微核率来反映环境中有害毒物的污染程度：一般认为，微核率在10‰以下时无污染，为环境本底；10-18‰时，有轻度污染；18-30‰时，有中度污染；＞30‰，有重度污染。 微核技术应用 由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出等都存在污染环境的可能性，欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，需要有一套高度灵敏，技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。
2016-2017学年高中生物第5章第2节植物种苗脱毒技术检测
第二节植物种苗脱毒技术 一、种苗脱毒的含义 1．外植体的来源：从感染病毒的植株上所剥离的茎尖分生组织。 2．培养方法：在离体条件下将外植体进行组织培养。 3．幼苗特点：不含病毒。 二、利用分生组织作为外植体的原因 1．农作物在种植过程中，经常会受到病毒、细菌和真菌等病原体的感染。 2．侵入植物体内的病毒可以通过维管束和细胞壁间的胞间连丝扩散到所有的组织器官。 3．植物的茎尖等分生组织处于分化的初级阶段，其组织内的维管束还未形成，此时植物体内的病毒只能通过胞间连丝移动到分生区，而这一移动过程远不及细胞分裂的速度，所以分生区一般不会受到病毒侵染。 三、马铃薯脱毒苗的培养程序 取材和消毒：剪芽并剥去外叶，自来水下冲洗 10 min，再用质量分数为5%的漂白粉溶液消毒后，用无菌水冲洗2～3次。 ↓ 剥离和接种：在解剖镜下，用解剖刀小心地除去茎尖周围的叶片组织，露出分生区，用解剖针细心剥取所需的茎尖，并将其接种于MS培养基上，切面接触培养基。 ↓ 培养：将接种的茎尖置于25 ℃、1 500 lx～3 000 lx光照条件下培养。 预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中
植物种苗脱毒的保障与方法 1．保障脱毒苗无毒的方法 (1)选取的外植体为分生组织。 (2)对材料消毒。 (3)所用培养基经过严格灭菌。 (4)操作过程为无菌操作。 (5)培养室为无菌室。 2．几种脱毒方法 材料一微繁殖技术又称快速繁殖技术，就是将植物体的一部分组织小块进行培养，并诱导分化成大量的小植株，从而达到快速无性繁殖的目的。在20 m2的培养室内最多可容纳100万株试管苗。这一技术已有几十年的历史，现已基本成熟，并形成诸如工厂化生产兰花这样产值巨大的工业生产体系。 材料二植物的脱病毒技术是微繁殖的一个分支，植物病毒严重地影响着农业生产，对于无性繁殖的植株来说，一旦感染上病毒就会代代相传，日趋严重。但在茎尖分生组织中，细胞繁殖十分迅速，病毒还未侵入，因此就成了植物体相对无病毒的特殊区域。 阅读上述材料请回答：
植物病毒检测技术研究进展汇总
植物病毒检测技术研究进展 刘茂炎 摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。 关键词：植物病毒；检测技术；PCR 病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。 1.生物学鉴定 最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。1929年美国病毒学家霍姆斯（Holmes）用感病的植物叶片粗提液接种指示植物，2~3天后接种叶片出现圆形枯斑，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比，能测出病毒的相对侵染力，对病毒的定性有着重要的意义，这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物，该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella)，
基因芯片及其在植物病原物检测中的应用
基因芯片及其在植物病原物检测中的应用 摘要:基因芯片是近年来发展起来的一项新兴技术，是把大量DNA探针或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上，形成致密、有序的DNA分子点阵，在基因定位、DNA测序、突变检测、基因筛选、基因诊断和发现新基因等方面起着重要的作用。基因芯片技术已广泛应用于病原物检测，在植物病害预测和防治中起着重要的作用。 关键词:基因芯片; 病原物检测 1996年，美国Affvmetrix生物公司制造出世界上第一块商业化的基因芯片(Gene chips)，由此掀起了基因芯片研究热潮。基因芯片被迅速而广泛地应用于生命科学与医学的各领域，被誉为继大规模集成电路后又一次意义深远的科技革命[1]。随着基因芯片技术的不断发展，其在生命科学和医学中的研究领域中的应用几乎是全方位的，包括基因定位、DNA测序、突变检测、基因筛选、基因诊断和发现新基因等［2］。本文仅叙述基因芯片原理已经基因芯片在植物病原物检测中的作用。 基因芯片的基本原理 基因芯片，又称DNA芯片(DNA chips)，属于生物芯片(bio-chip)中的一种，是综合微电子学、物理学、化学及生物学等高新技术，把大量DNA探针或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上，形成的致密、有序的DNA分子点阵，因固相载体常用硅玻片或硅芯片，故称之为基因芯片［3］。基因芯片技术的基本原理是分子生物学中的核酸分子原位杂交技术:将短链核酸分子固定在固相载体上作为探针，待分析样品经过标记后与固定在芯片上的探针杂交。其技术流程主要包括芯片的制备、待测样本的制备和标记、杂交反应、结果检测和数据处理分析等。与传统的核酸印迹杂交技术相比，基因芯片具有可信度高、信息量大、操作简单、重复性强以及可以反复利用等诸多优点［4］。
植物细胞的微核检测技术-
设计性实验 化生院生物科学教研室
一、实验目的 ?1、了解细胞微核形成的机理及其形态特点；?2、学习植物根尖细胞的微核检测技术。?3、小组合作，掌握设计实验的基本能力。
二、实验原理 ?微核(micronuclei)简称MCN，是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。 ?一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的，在有丝分裂后期不能向两极移动，所以游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，即可在它附近看到一到几个很小的圆形结构，直径大约是细胞直径的1/20 ~1/5，这就是微核。
?微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，因此，微核是常用的遗传毒理学指标之一，指示染色体或纺锤体的损伤。微核测试已用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。
三、实验材料： 大蒜、大豆、蚕豆等。 四、实验仪器设备： 显微镜、恒温培养箱、恒温水浴锅、镊子、 载玻片及盖玻片。
五、实验步骤： 1、幼根的培养：提前3~5天进行培养，将大蒜瓣剥去外边膜 质枯皮，下端可见许多微微凸起的根原体，将蒜瓣架在烧杯（大小与蒜瓣适宜）口上，杯中盛满清水，使蒜瓣的下部浸入水中，置培养箱中，注意每天换水，经3~5天后，即可长出1-2cm的嫩根。 2、处理根尖：阳性检测采用1.0~2.5M CrO3，0.5~ 1.5M NaN3，150250mM EMS，对照用自来水处理， 处理时间24h。 3、恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每次 2-3min，洗净后在水中恢复培养24h。
植物病毒分子检测方法概述
植物病毒分子检测方法概述 邵碧英 (福建出入境检验检疫局 福州 350001) 植物病毒粒体主要由核酸和蛋白外壳构成,蛋白外壳由许多外壳蛋白(CP)组成。 CP和核酸因病毒的不同而异,是检测、鉴定植物病毒的主要依据。广义的植物病毒分子检测方法包括蛋白质检测(或血清学试验)和核酸检测方法,本文分别介绍。 1 以病毒外壳蛋白为基础的检测方法 植物病毒的CP具有抗原性,很多病毒可以被提纯并制备成高效价的抗血清,根据特异性的抗原抗体反应可检测植物病毒的存在。血清学方法有很多,应用较广泛的是酶联免疫吸附反应,在此基础上加以改进也发展了一些新的检测方法。 111 酶联免疫吸附反应(EL ISA) EL ISA是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板)吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法。酶标抗体(或抗抗体)与相应抗原反应时形成酶标记的免疫复合物,酶遇到相应的底物时产生颜色反应,颜色深浅与抗原量正相关。该方法已被用于各种植物病毒检测。 后来发展的用酶标A蛋白取代酶标抗抗体的EL ISA被称为A蛋白酶联吸附法(SPA-EL ISA)。几种植物病毒的SPA-EL ISA诊断试剂盒已被研制成功[1]。 EL ISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测。 112 斑点免疫吸附法 20世纪80年代发展的以硝酸纤维素膜(NCM)为固相载体的酶联免疫吸附试验—斑点免疫吸附法,检测原理类似于EL ISA,但酶与底物反应产生不溶性产物,在NCM 上形成有色斑点,斑点颜色深浅与抗原的量成正比。也已用于各种病毒检测。 斑点法简便,反应时间短,反应结果可长期保存,不需任何特殊设备,也适合于大量样品的测定。 113 直接组织斑免疫测定法(IDD TB)与EL ISA相比,斑点法更为简便,但仍然需要提取病毒的粗提液或提纯制剂,试验过程较繁琐。改进后的直接组织斑免疫测定是直接把植物组织切块固定于膜上,然后利用抗原抗体特异反应来检测植物病毒。 鞠振林等[2]以IDD TB检测病组织中的马铃薯X病毒Potato virus X等多种病毒获得较好结果。徐明全等[3]采用IDD TB法从兰花叶片中检测到建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus。把石斛兰叶片从叶尖至叶尾每0.5cm切割1次并压印在膜上,检测结果可直接显示出感染病毒的具体部位。 组织印迹法明显比EL ISA和DIBA的试验程序简单、快速。但病毒在植物的不同部位分布不均匀,同一样品要重复多次,以提高检测的准确性。 114 电印迹免疫分析(EBLA) 电印迹免疫分析方法首先用SDS2PA GE 分离病毒CP,把蛋白带转移到膜上,再进行抗原杭体反应,根据CP分子量和吸附特异性抗血清的特殊带来判断该病毒的存在与否。 EBLA和EL ISA、DIBA相比具有明显的优点,通过电泳将植物病毒的CP和植物组织中的其它蛋白分离开来,排除了杂蛋白的干扰,可检测低浓度的植物病毒。此方法 — 7 7 3 —
植物组织培养脱毒方法综述
植物组织培养脱毒方法综述 摘要：植物病毒是制约花卉产业发展的重要因素，通过茎尖处理、茎尖结合热处理、冷处理、化学药剂处理及愈伤组织处理等方法可以去除植物病毒。通过查阅国内外研究文献和资料，综合阐述了茎尖培养脱毒、热处理脱毒、化学药剂培养脱毒、愈伤组织脱毒、冷处理脱毒等方法。 关键词：组织培养；脱毒；茎尖培养 正文： 植物病毒分布广、危害大，对世界花卉产业的发展产生了巨大的冲击。近年来。随着我国从国外引种花卉的种植面积的扩大以及不规范的繁殖技术，病毒病开始流行，严重影响了中国花卉产业的发展。目前国内外多用组织培养脱毒方法来阻止病毒病的继续传播以便提高植物的产量和质量。因此，本文对当前植物组织培养脱病毒方法作了综述，以期从中得到启示，进一步促进植物脱毒方法及应用的相关研究。 植物组织培养脱毒方法有茎尖培养脱毒、热处理脱毒、冷处理脱毒、化学药剂处理脱毒、花药培养脱毒、愈伤组织脱毒、珠心胚培养脱毒、茎尖微体嫁接脱毒等，其中由于茎尖培养脱毒效果好，是目前植物无病毒苗培育应用最广泛、最重要的一个途径。研究表明，如果将不同的方法结合起来应用效果会更好，通常将茎尖结合热处理来脱毒。 1、茎尖培养脱毒 茎尖培养脱毒原理：在染病毒植株体内，病毒分布并不均匀，在生长点病毒含量最低。病毒通过维管束和胞间连丝传播，在分生区内无维管束，病毒扩散慢，加之植物细胞不断分裂增生，所以病毒含量少，在茎尖生长点几乎检测不出病毒，因此切取茎尖愈小愈好，但实际操作中茎尖取太小不易培养成活，过大又不能去毒。 1．1 茎尖培养的方法及注意事项 将消毒后的材料放置在20～40倍解剖显微镜下，用解剖刀剥取0．1～1 mm 的茎尖，迅速放入培养基中，如果在空气中暴露时间过长，就会因失水引起茎尖死亡。赵军良等人的研究表明，带有一个叶原基的茎尖，脱毒效果最好，成活率最高[3]。不同的植物材料茎尖剥取的方法和最适合脱毒的茎尖大小不同。在菊花的茎尖培养中，在超净工作台内将消毒后的茎尖中用肉眼能看到的叶柄切除，在实体解剖镜下用解剖刀剥离顶芽至露出带有1～2片叶原基的生长点，生长点大小约在0.3～0.5 mm左右。大于以上尺寸脱毒率将会下降，反之成活率将会下降，迅速将摘出的生长点置于培养基中。就香石竹而言，切掉叶柄后，生长点是在几重叶原基的包围下，要从外到内逐一切掉外层叶原基，当生长点露出时把包括1—2片叶原基在内的生长点切下，迅速移入事先预备好的培养基内，注意生长点的方向及不要把生长点埋在培养基内。在康乃馨的茎尖培养中取带有1—2个叶原基、长0.2-0.3 mm的茎尖接种到培养基上，接种时只须沾取茎尖置于轻轻划破的培养基表面即可。洋葱可用0.5—0.7 mm茎尖培养，能有效地脱除洋葱中的O YDV和GI v病毒。在对白葱的茎尖脱毒研究表明，以带有1片叶原基大小为0.2-0.6 mm的茎尖外植体较为适宜。 1．2 茎尖培养可能出现的问题及防治方法 茎尖培养可能出现褐化、玻璃化等现象，这会严重影响植物的成活率，所以
微核试验报告
方便面面饼液对蚕豆根尖微核率的影响 专业年级:2012级生物工程 成员:王浩楠 王绍伟 谢帅
一、摘要 用蚕豆根尖细胞微核技术检测不同种类方便面面饼液微核的诱变效果。设置了阴性对照：自来水处理组，实验组：小浣熊、康师傅、统一、五谷道场、幸运五组饼液分别处理蚕豆根尖，阳性对照：用0.02g/L的醋酸铅溶液处理。发现方便面面饼液在诱导微核产生方面影响明显，醋酸铅溶液具有诱导微核产生的作用。 关键字：蚕豆根尖，方便面面饼，微核千分率，污染指数 二、实验背景和目的 随着现代社会的发展，越来越多的化学物质运用到人们的日常生活之中，如种类繁多的食品添加剂。而其中有些物质具有较强的危害，如致畸，致癌，致突变性。为了检测已存在或潜在的危害，各种检测技术应运而生。微核试验是检测染色体或有丝分裂器损伤的一种遗传毒性试验方法。无着丝粒的染色体片段或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期仍留在子细胞的胞质内成为微核。用微核试验来评价药物、放射线、有毒物质等对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤仍是一个直观有效可行的方法,在遗传毒理、医学、食品、药物、环境等诸多方面得到了广泛的应用。微核计数经济,迅速,简便,不需要特殊技能,可以统计更多的细胞并实现计算机自动计数。我们采用蚕豆作为实验材料，采用植物微核技术来检测方便面面饼中添加剂对人体是否产生危害。 方便面是日常生活中经常接触到的食品，其市场占据快餐食品的大壁江山，在超市中油炸方便面与非油炸方便面占到快餐食品的60%
到70%。另一方面，在各媒体的报道中，经常出现有关方便面的食用危害，而且很有争议，所以这也是我们进行本实验的一个原因。三、实验原理 微核是间期细胞中在细胞核之外存在的一个或多个圆形或杏仁状结构，大小在主核的1/3以下，是有丝分裂后期丧失着丝粒的落后的染色体片段形成。20世纪70年代初，Matter和Schmid等首先用动物骨髓细胞微核率来测定怀疑具有诱变活力的化合物，并称之为微核。许多能引起染色体断裂的理化因素，如辐射、化学诱变剂等，均可作用于分裂细胞而产生微核。 在有丝分裂的后期，断裂的染色体片段或完整的染色体落后于其他染色体，当大部分染色体到达细胞两极并重新被核膜包裹时，这些落后的染色体或染色体片段不能进入主核，便形成了独立于主核之外的核质物团，并在间期时浓缩成小核。含微核的细胞数占观察细胞总数的比率称为微核细胞率，简称微核率，可以用来反映遗传物质受伤的程度。在一定范围内，微核率与环境因子的剂量呈正相关，因此，人们常用微核率来反映环境中有害物质的污染程度。 不同厂家生产的面饼化学成分不一，用微核作为面饼材料是否含有有害人体健康物质的手段之一。 四、实验用品 材料：蚕豆种子，小浣熊、康师傅、统一、五谷道场、幸运五个品种方便面 器材：镊子4把，解剖针4支，显微镜，水浴锅，大托盘、培养皿7
植物病毒病检测方法
植物病毒病检测方法 植物病毒病是农业生产上一种重要病害，严重影响农作物的产量和质量, 目前还没有1种治疗效果较理想的药剂，对发病植株做到早期诊断及提前检测就显得尤为重要。植物病毒学历经近百年的发展，植物病毒的检测方法与手段也在不断发展与改进。常用的方法有侵染力测定法、血清学方法、电子显微镜计数和分子生物学法等。 1.4.1侵染力测定法 侵染力测定法是将病毒样本接种在植物上，根据侵染力的大小定量。它的灵敏度在所有定量法中是比较高的，而且是其他定量法的基础。设计一种新的定量法，如果不经过侵染力的验证，将无法判断测定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。侵染力测定法包括局部枯斑法、淀粉－碘斑法、系统感染率的测定法等。侵染力测定多用粗汁液来接种，为了避免抑制物质的作用和使半叶枯斑数目控制在一定范围，须用缓冲液稀释接种物。 局部枯斑法1929年F.O.Holmes发现TMV在心叶烟（Nicotiana glutinosa）接种叶片上引起局部坏死斑点，在一定的病毒浓度范围内，所产生的斑点数目与病毒浓度成正比例。这一发现成为病毒侵染性定量测定的基础（田波，1987）。所有机械传染的病毒都有可能应用局部斑点法，但实际上只有少数病毒具有可用于定量测定的局部斑寄主。一个待测样品所形成的斑点数目除取决于接种物中病毒浓度外，还受试验植物种类、环境条件和接种物中是否含有病毒抑制物质的影响。 淀粉－碘斑法当所研究的病毒没有过敏性枯斑寄主时，采用此法。Holmes（1931）发现TMV接种的烟叶上有时形成明显的黄化斑块，但不能用于计数。将这种接种叶用95％乙醇加热到80℃固定，然后用I2和KI混合液（10克I2，30克KI，1500毫升H2O）染色时，则侵染点处出现淀粉－碘的蓝色反应。当下午采摘叶片，褪色过夜，然后用碘液染色，则侵染点较周围组织着色浅；当采摘叶片前，植株先在黑暗中放几个小时，再用碘液染色，则侵染点组织着色深。这是由于病毒侵染既降低光合组织中碳水化合物的形成，也降低碳水化合物从光合组织中的运出。淀粉－碘染色的强弱受环境条件的影响较大，不如局部枯斑法可靠，但在标准化条件下仍可用于侵染性的定量测定。 侵染性滴度法当上述方法都不适用时，可采用侵染性滴度法。即把欲测定样品用缓冲液稀释，可用十倍稀释、成倍稀释、半倍稀释或更低稀释。这种方法的缺点是需用大量实验
2017-2018学年高中生物 第五章 植物的组织培养技术 第二节 植物种苗脱毒技术自我小测 中图版
第五章植物的组织培养技术第二节植物种苗脱毒技术 1．马铃薯可以进行的生殖方式是（） A．出芽生殖和有性生殖 B．分裂生殖和营养生殖 C．营养生殖和有性生殖 D．出芽生殖和营养生殖 2．利用植物的茎尖或叶片、茎段等，在无菌条件下，培养在玻璃器皿中人工配制的培养基上，使它发育成完整的植株。这种技术可以用来培育植物新品种、在较短的时间内大量繁殖植物、防止病毒的侵害。下列关于这种技术的叙述，正确的是（） ①这种技术利用了植物细胞的全能性②这种技术叫做组织培养，可以克隆生物体③这种技术属于细胞工程的应用领域之一④这种技术是一种无性繁殖的方式A．①②B．①②③ C．①②③④D．①②④ 3．甘薯种植多年后易积累病毒而导致品种退化。目前生产上采用茎尖分生组织离体培养的方法快速繁殖脱毒的种苗，以保证该品种的品质和产量。这种通过分生组织离体培养获得种苗的过程涉及细胞的（） ①有丝分裂②分化③减数分裂④全能性 A．①②③B．②③④ C．①③④D．①②④ 4．在下列选项中，没有采用组织培养技术的一项是（） A．花药离体培养得到单倍体植株 B．秋水仙素处理萌发的种子或幼苗得到多倍体植株 C．基因工程培育的抗棉铃虫的棉花植株 D．快速繁殖月季 5．在植物组织培养过程中，愈伤组织的形成和形态发生是十分关键的一步。除需要必备的营养外，还需要有起诱导作用的物质，这些物质是（） A．铜、锌等微量元素B．细胞分裂素和生长素 C．蔗糖和葡萄糖D．维生素和氨基酸 6．无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键，以下说法正确的是（） ①由于植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对无菌操作的要求非常严格 ②对培养基及器具用高压蒸汽灭菌③对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒效果，另一方面还要考虑植物材料的耐受能力 ④培养中不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待⑤对培养材料可用高压蒸汽灭菌⑥如果不小心引起污染，将可能造成培养工作前功尽弃
植物组织培养之草莓的脱毒与快速繁殖
一、草莓简介 草莓是对蔷薇科草莓属植物的通称，属多年生草本植物。草莓的外观呈心形，鲜美红嫩，果肉多汁，含有特殊的浓郁水果芳香。 草莓具有极其丰富的营养价值。 1、（丰富的胡萝卜素）草莓中所含的胡萝卜素是合成维生素A的重要物质，具有明目养肝作用; 2、（滋补调理）草莓对胃肠道和贫血均有一定的滋补调理作用; 3、（治病）草莓除可以预防坏血病外，对防治动脉硬化，冠心病也有较好的疗效; 4、（防癌）草莓是鞣酸含量丰富的植物，在体内可吸附和阻止致癌化学物质的吸收，具有防癌作用; （回主页） 草莓营养价值高，口味好，深受消费者喜爱，特别是近几年种植面积大幅提高。但由于病毒病的传播感染，导致草莓品种种性退化，产量、品质下降，商品率降低，严重影响了草莓的发展。 下面就简单介绍几种草莓易得的病： 二、草莓易得的病 1、叶斑病：又称蛇眼病，主要为害叶片、叶柄、果梗、嫩茎和种子。在叶片上形成暗紫色小斑点，扩大后形成近圆形或椭圆形病斑，边缘紫红褐色，中央灰白色，略有细轮，使整个病斑呈蛇眼状，病斑上不形成小黑粒。 2、白粉病：主要为害叶片，也侵害花、果、果梗和叶柄。叶片上卷呈汤匙状。花蕾、花瓣受害呈紫红色，不能开花或开完全花，果实不膨大，呈瘦长形；幼果失去光泽、硬化。近熟期草莓受到为害会失去商品价值。 3、灰霉病：是开花后的主要病害，在花朵、花瓣、果实、叶上均可发病。在膨大时期的果实上，生成褐色斑点，并逐渐扩大，密生灰霉使果实软化、腐败，严重影响产量。 4、根腐病：从下部叶开始，叶缘变成红褐色，逐渐向上凋萎，以至枯死。支柱在中间开始变成黑褐色而腐败，根的中心柱呈红色。 5、黄萎病：该病是土壤病害，主要症状是幼叶畸形，叶变黄、叶表面粗糙无比。随后叶缘变褐色向内凋萎，直到枯死。 6、除此之外，草莓还容易有一些病虫危害，例如： 线虫危害：寄生在草莓组织中，危害叶柄、芽、根等，使被害器官变成红色，严重时植株枯死。 蛴螬危害：在草莓收获期和八九月份咬食根、茎，使植株枯死。 （回主页） 根据报道，侵染草莓的病毒多达二十多种。长期大田分株繁殖容易使草莓植株中病毒积累，导致草莓品种退化,，严重影响经济收益。所以利用先进的技术使草莓脱毒，以及后期的快速繁殖已成为草莓业发展的必要环节。 下面就来详细介绍草莓的脱毒与快繁。
微核试验报告
基础生物学实验自主设计性实验 实验名称：方便面面饼液对蚕豆根尖微核率的影响专业年级：2008级生物科学类 成员: 指导教师： 起止时间：2010年10月-2010年12 月 一、摘要
用蚕豆根尖细胞微核技术检测不同种类方便面面饼液微核的诱变效果。设置了阴性对照：自来水处理组，实验组：小浣熊、康师傅、统一、五谷道场、幸运五组饼液分别处理蚕豆根尖，阳性对照：用0.02g/L的醋酸铅溶液处理。发现方便面面饼液在诱导微核产生方面影响明显，醋酸铅溶液具有诱导微核产生的作用。 关键字：蚕豆根尖，方便面面饼，微核千分率，污染指数 二、实验背景和目的 随着现代社会的发展，越来越多的化学物质运用到人们的日常生活之中，如种类繁多的食品添加剂。而其中有些物质具有较强的危害，如致畸，致癌，致突变性。为了检测已存在或潜在的危害，各种检测技术应运而生。微核试验是检测染色体或有丝分裂器损伤的一种遗传毒性试验方法。无着丝粒的染色体片段或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期仍留在子细胞的胞质内成为微核。用微核试验来评价药物、放射线、有毒物质等对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤仍是一个直观有效可行的方法,在遗传毒理、医学、食品、药物、环境等诸多方面得到了广泛的应用。微核计数经济,迅速,简便,不需要特殊技能,可以统计更多的细胞并实现计算机自动计数。我们采用蚕豆作为实验材料，采用植物微核技术来检测方便面面饼中添加剂对人体是否产生危害。 方便面是日常生活中经常接触到的食品，其市场占据快餐食品的大壁江山，在超市中油炸方便面与非油炸方便面占到快餐食品的60%到70%。另一方面，在各媒体的报道中，经常出现有关方便面的食用
植物组织培养脱毒方法综述
植物组织培养脱毒方法综述 符国芳,李 青 (北京林业大学,北京100083) 摘要:植物病毒是制约花卉产业发展的重要因素,通过茎尖处理、茎尖结合热处理、冷处理、化学药剂处理及愈伤组织处理等方法可以去除植物病毒。通过查阅国内外研究文献和资料,综合阐述了茎尖培养脱毒、热处理脱毒、化学药剂培养脱毒、愈伤组织脱毒、冷处理脱毒等方法。 关键词:组织培养;脱毒;茎尖培养 中图分类号:S432 4+1 文献标识码:A 文章编号:1002-7351(2007)03-0255-04 Summarization on the methods of virus elimination by plant tissue culture FU Guo fang,LI Qing (Beijing Forestry U niversity ,Beij ing 100083,China) Abstract:Plant virus is the factor that inhibits flow er industr y development Plant v irus can be eliminated by shoot tip treatment,shoot t ip and heat treatment,cold treatment,chemical treatment and callus treatment,so o n By searching the research bibliog ra phies home and abr oad,this paper describes the methods to eliminate v irus by shoot t ip culture,heat treatment,chemical treat ment,callus treatment and cold treatment,so on Key words:tissue culture;vir us elimination;shoot tip culture 植物病毒分布广、危害大,对世界花卉产业的发展产生了巨大的冲击。近年来,随着我国从国外引种花卉的种植面积的扩大以及不规范的繁殖技术,病毒病开始流行,严重影响了中国花卉产业的发展。目前国内外多用组织培养脱毒方法来阻止病毒病的继续传播以便提高植物的产量和质量。因此,本文对当前植物组织培养脱病毒方法作了综述,以期从中得到启示,进一步促进植物脱毒方法及应用的相关研究。 植物组织培养脱毒方法有茎尖培养脱毒、热处理脱毒、冷处理脱毒、化学药剂处理脱毒、花药培养脱毒、愈伤组织脱毒、珠心胚培养脱毒、茎尖微体嫁接脱毒等,其中由于茎尖培养脱毒效果好,是目前植物无病毒苗培育应用最广泛、最重要的一个途径 [1]。研究表明,如果将不同的方法结合起来应用效果会更好, 通常将茎尖结合热处理来脱毒。1 茎尖培养脱毒 茎尖培养脱毒原理:在染病毒植株体内,病毒分布并不均匀,在生长点病毒含量最低。病毒通过维管束和胞间连丝传播,在分生区内无维管束,病毒扩散慢,加之植物细胞不断分裂增生,所以病毒含量少,在茎尖生长点几乎检测不出病毒,因此切取茎尖愈小愈好,但实际操作中茎尖取太小不易培养成活,过大又不能去毒[2]。 1 1 茎尖培养的方法及注意事项 将消毒后的材料放置在20~40倍解剖显微镜下,用解剖刀剥取0 1~1mm 的茎尖,迅速放入培养基中,如果在空气中暴露时间过长,就会因失水引起茎尖死亡。赵军良等人的研究表明,带有一个叶原基的茎尖,脱毒效果最好,成活率最高[3]。不同的植物材料茎尖剥取的方法和最适合脱毒的茎尖大小不同。在菊花的茎尖培养中,在超净工作台内将消毒后的茎尖中用肉眼能看到的叶柄切除,在实体解剖镜下用解剖刀剥离顶芽至露出带有1~2片叶原基的生长点,生长点大小约在0 3~0 5mm 左右,大于以上尺寸脱毒率将会下降,反之成活率将会下降,迅速将摘出的生长点置于培养基中 [4]。就香石竹而言,切掉叶柄后, 收稿日期:2007-01-08;修回日期:2007-03-15 作者简介:符国芳(1982-),女(土家族),湖南张家界人,北京林业大学硕士研究生,从事园林植物组织培养研究。第34卷第3期 2007年9月福建林业科技Jour of F ujian Forestry Sci and T ech V ol 34 N o 3Sep ,2007
植物组织培养脱毒快繁技术在马铃薯育种中的应用
植物组织培养脱毒快繁技术在马铃薯育种中的应用 摘要：脱除病毒是植物组织培养深入探讨研究中的一个技术难题。本文简要介绍植物组织培养的基本原理和方法，综述植物脱除病毒的热处理、茎尖培养和抗病毒药剂三种方法的原理和技术方法，介绍了几种常用的病毒检测方法。本文以马铃薯为例，重点介绍了利用热处理加茎尖组织培养法获得马铃薯脱毒苗的具体技术方法，脱毒率可达100%。同时还对植物组织培养脱毒快繁技术的应用前景作了分析。 关键词：茎尖培养，脱毒快繁技术，病毒检测，应用前景. 1．脱毒技术及其原理 植物组织培养脱毒快繁是人工在无菌条件下利用植物体的一部分，在人工控制的营养和环境条件下繁殖植物，脱除病毒得到无毒苗株，继而在大田快速繁殖的技术。脱毒及离体快繁，是目前植物组织培养应用最多、最广泛和是有效的一个方面。现在植物的脱毒技术有多种，其中应用最广泛的有三种：热处理法、茎尖培养脱毒法、抗病毒药剂法，将不同的方法相结合起来应用效果更好。 1.1 热处理法 1.1.1 概述 热处理法是利用病毒和寄主植物对高温的忍耐性的差异，使植物的生长速度超过病毒的扩散速度，得到一小部分不含病毒的植物分生组织，然后进行无毒个体培育。 热处理可通过热水浸泡或湿热空气进行。热水浸泡对休眠芽效果较好，湿热空气对活跃生长的茎尖效果较好，既能消除病毒又能使寄主植物有较高的存活机会。热空气处理比较容易进行，把旺盛生长的植物移入到1个热疗室中，在35~40℃下处理一段时间即可，处理时间的长短，可由几分钟到数月不等[3] 。热处理的方法有恒温处理和变温处理，处理的材料可以是植株，也可以是接穗。 1.12原理 热处理脱毒是根据病毒与寄生细胞对高温的忍耐程度不同，选择适当的温度和处理时间，植物组织中的很多病毒被部分地或完全地钝化而可控制其的活动，但很少伤害甚至不伤害寄主组织，从而让植物细胞加快生长，使生长点附近不带病毒，从而达到脱毒的目的。 1.2 茎尖培养脱毒法 1.2.1 概述 茎尖培养脱毒就是采取茎尖分生组织离体培养的方法获取无病毒试管苗，其方法是在解剖镜下，用解剖刀进行迅速准确地茎尖剥离，因为茎尖分生组织基本不带病毒，利用植物茎尖分生组织进行离体培养，再结合病毒检测，就可以获得无病毒的植株。 茎尖培养脱毒法脱毒率高，脱毒速度快，能在较短的时间内得到较多的原种繁殖材料，但这种方法存在的缺点是植物的存活率低。为了克服这一缺点，现在经常是将茎尖培养与热处理相结合来使用。茎尖培养与热处理相结合之所以能够提高脱毒效果，是由于热处理可使植物生长本身所具有的顶端免疫区得以扩大，有利于切取较大的茎尖（1mm左右），从而能够提高培养或嫁接的成活率。 1.2.2 原理 茎尖培养脱毒的原理是植物体内病毒靠维管束系统移动，分生组织中没有维管束存在，病毒只靠胞间连丝移动，速度很慢，难以追上生长活跃的分生组织，所以旺盛生长的根尖、茎尖一般都无病毒或很少有病毒分布。 据研究，植物体内某一部分组织器官不带病毒的原因是：分生组织的细胞生长速度快，病毒在植物体内繁殖的速度相对较慢，而且病毒的传播是靠筛管组织进行转移或通过细胞间连丝传递给其他细胞，因此病毒的传递扩散也受到一定限制，这样便造成植物体的部分组织细胞没
植物的病毒检测技术
植物的病毒检测技术 植物病毒病害是一类重要病害,几乎在各类作物上都有发生,严重影响农作物的产量和质量,用一般的方法难以防治,是生产上的一大难题。种植无病毒种子、苗木是一种非常有效的防治措施。因而如何对种子、苗木等无性繁殖材料以及在发病早期对植株进行快速准确地检测诊断就显得尤为重要。最初植物病毒检测主要依靠生物学性状,但生物学方法费时费力,检测周期长,而且易受环境条件的影响,反应不稳定、重复性差。目前植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外壳蛋白为基础)和核酸检测,前者主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等。 1 血清学检测方法 1．1 酶联免疫吸附测定(ELISA) 酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板) 吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法,其基本原理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。该方法首先将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。ELISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测,目前该方法已被广泛用于植物病毒检测。在此基础上加以改进又发展了一些新的检测方法,如A 蛋白酶联吸附(SPA-ELISA)、斑点免疫吸附(DIBA)、直接组织斑免疫测定( IDDTB) 、伏安酶联免疫分析[1]、快速ELISA 等。 1．2 快速免疫滤纸测定法(Rapid immuno-filter paper assay , RIPA) 快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应,其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上,通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在。所不同的是RIPA使用了一种红色乳胶,从而使检测更加简单和直观。RIPA[2]目测检测提纯TMV 的灵敏度分别可达 5ng/ml～50ng/ml 。 1.3 免疫胶体金技术( Immunogold2label as2say) 免疫胶体金技术最早起源于电镜方面的研究,由于金在生物学上是惰性的,且有良好的电荷分布,可以和蛋白质(如抗体、A 蛋白等)紧密结合,因此广泛应用于生物学和微生物学的各个领域。其原理是用柠蒙酸钠将氯金酸金离子还原为胶体金。胶体金颗粒在适当的条件下,以静电、非共价键方式吸附抗体IgG(或A蛋白)分子,从而形成稳定的IgG(或A蛋白) - 胶体金复合物。通过抗原抗体特异性结合,抗体(或A蛋白)胶体金复合物就可以结合在抗原上。金颗粒吸附在病毒粒体周围,从而得到明显的鉴别性和可见度[3] 。 随着技术的发展,1971年Taylor 等报道了免疫金染色技术( Immunogold staining) ,1981年Danscher又创建了免疫金- 银染色技术( Immunogold-silver staining) 。自1983年首次成功使用胶体金标记的抗体检测植物病毒以来,该技术逐渐被应用于植物病毒的检测。20 世纪80年代发展起来的斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold fitration assay) 是一种快速免疫胶体金诊断技术,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗体抗原反应和洗涤在一特殊的渗滤装置中迅速完成,从而大大缩短了检测时间。在此基础上,又建立了更为简
实验二 植物细胞微核检测技术
实验二植物细胞微核检测技术 一、实验目的 1、理解细胞微核形成的机理及其形态特点， 2、学会培养植物根尖的技术。 3、学会植物根尖的微核诱导技术。 3、学会习植物根尖细胞的微核检测技术。 4、了解毒理遗传学在实际生活与工作中的应用范围及意义。 二、实验原理 毒理遗传学，用遗传学方法研究环境因子对生殖细胞或体细胞的遗传物质的损伤及其毒理效应的遗传学分支学科。环境因素造成的遗传毒理效应包括三个方面：突变形成、癌形成、致畸效应，简称为毒理遗传的三致效应。毒理遗传学的应用：鉴定生殖细胞、体细胞致突变物；预测潜在的致癌物；环境遗传毒物污染的监测和评价。根据危害鉴定、描述剂量-反应关系、致突变机制，进行危险度和致癌危险度评价。 微核(micronuclei)简称MCN，是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。 微核形成：有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片不能
向两极移动，游离于细胞质中，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核，直径大约是细胞直径的1/20～1/5。 三、实验材料、仪器及试剂 大蒜、显微镜、恒温培养箱、恒温水浴锅、镊子、载玻片及盖玻片、盐酸、乙醇、石碳酸品红染液、硫酸铜。 四、实验步骤 1、幼根的培养（提前3—5d进行培养） 将大蒜瓣剥去外边膜质枯皮，下端可见许多微微凸起的根原体，将蒜瓣架在烧杯（大小与蒜瓣适宜）口上，杯中盛满清水，使蒜瓣的下部浸入水中，置培养箱中，注意每天换水，经3—5d后，即可长出1-2cm的嫩根。 2、处理根尖：阳性检测采用0.1g/L硫酸铜，以及自行设计（或采集）的液体，对照用自来水处理，处理时间24h，处理液浸没根尖。 3、恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每次2-3min，洗净后在水中恢复培养24h。 4、固定：切取1cm左右的根尖，用无水乙醇：冰醋酸（3：1）固定液固定24h后弃去固定液，移入70％酒精中，4℃冰箱保存。 5、酸解：弃去固定液，用蒸馏水漂洗2-3次，吸净水。用1
植物组织培养脱毒快繁技术的综述
植物组织培养脱毒快繁技术的综述 李西雁 (广西职业技术学院农业技术工程系20０２级应用生物技术专业) 摘要：脱除病毒是植物组织培养深入探讨研究中的一个技术难题。本文结合在桂林莱茵生物科技股份有限公司的实践情况,简要介绍植物组织培养的基本原理和方法,综述植物脱除病毒的热处理、茎尖培养和抗病毒药剂三种方法的原理、发展史和技术方法,并介绍了几种常用的病毒检测方法。本文以马铃薯为例,重点介绍了利用热处理加茎尖组织培养法获得马铃薯脱毒苗的具体技术方法，脱毒率可达1０0％。同时还对植物组织培养脱毒快繁技术的应用前景作了分析。 关键词：茎尖培养，组织培养，快繁脱毒技术，病毒检测，应用前景 1植物组织培养研究概况 1．1研究简史 自从1943年怀特(White）提出植物细胞“全能性”(Tｏtipoｔｅncy）学说及诸多后学者(Steward，1958，Guｈａ和Marteshwａｒｉ，196４）相继证实后，引发植物组织和细胞培养快繁技术的勃然兴起。我国的专家学者在20世纪７０年代后也在此领域做了大量的研究和开发工作,创造了很多新方法、新技术，提出不少新成果，开拓了植 物组织培养快繁技术的新局面[１] 。目前采用组织培养脱病毒快繁及离体快繁生产株 苗的技术已发展相当成熟[2] 。脱毒株苗具有无杂菌、适应能力较强、繁育较快、 质量优、抗性好、分蘖性强、繁殖系数高、大批量生产、周年供应、便于运输等优点，已得到有关专家的鉴定及高度评价和种植试验区、种植产区果农的认可。例如脱毒马铃薯、脱毒红薯、脱毒生姜、脱毒大蒜、脱毒草莓、脱毒苗木、脱毒花卉等等, 已成为现代农民致富的新宠[2] 。 １．2植物组织培养和脱毒快繁的定义 植物组织培养（Ｐlant tｉssue culture)是指在无菌的条件下，将离体的植物(根、茎、叶、花、果实、种子等)、组织（形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞)以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株。由于培养物是脱离植物母体,在玻璃瓶中进行培养，所以也叫做离