胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒使用说明
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胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒使用说明
产品编号：C7610
包装规格：50Assays
产品组成:
胞质提取Buffer55mL
线粒体溶解Buffer5mL
蛋白酶抑制剂60μL
磷酸酶抑制剂300μL
DTT60μL
产品简介
胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒提供独特的组份可以提取动物细胞及组织中的胞质蛋
白和线粒体蛋白。该方法先将完整的有活性的线粒体和胞质蛋白分离，再处理后获得高纯度
的有活性胞质蛋白和变性的线粒体蛋白，不需要超速度离心，方法简单，可靠，快速。可用
于1D，2D电泳，WesternBlot，Elisa等蛋白质实验。提取的完整线粒体也可以经过活性
溶解液处理，再用于免疫共沉淀，凋亡，细胞信号传导，能量代谢等生理学研究，或进行线
粒体DNA提取，用于基因组学后续研究。本试剂盒可以每次从1×107个培养细胞或200mg组
织中提取所需要的蛋白质，可以使用50次。
产品特点
1.整个实验过程大约只需要1小时左右。
2.可以从50×107个培养细胞或50×200mg组织中提取所需要的蛋白质或活性线粒体。
3.活性线粒体的提取量高，高效线粒体溶解Buffer提取的蛋白质，可以用于线粒体蛋白质
组学研究。
4.不需要超速度离心，可以同时处理多个样品。
http://www.solarbio.com运输和保存条件
常温下运输，收到后将线粒体溶解Buffer、DTT和蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂于-20℃保存，
胞质提取Buffer于2-8℃保存，保质期1年。
操作步骤
1.收集不少于1×107细胞，用冷PBS（pH7.4）洗涤细胞两次，每次3000rpm（800g）离心
5min；组织样本（200mg）尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，于冰上剪碎，再
用冷PBS（pH7.4）洗涤三次。
2.在上述细胞或组织样本中加入1mL胞质提取Buffer（使用前每mL胞质提取Buffer加入1
μL蛋白酶抑制剂，5μL磷酸酶抑制剂和1μLDTT），置玻璃匀浆器冰上均质30～50次，
置于冰上冷却。均质破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于90％。
不要过度匀浆，以免线粒体膜破裂，线粒体基粒和基质外流，使得胞质蛋白和线粒体蛋
白的分离变得困难。
3.将匀浆液转移至冷的离心管中，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上10～15min，于4℃，
3000rpm离心10min，弃沉淀。
沉淀中为未破碎的细胞，细胞核和一些细胞碎片。重复步骤3可以进一步去除上清中的
残余的细胞核，细胞碎片等杂质。
4.取上清转移至新冷离心管中，于4℃，12000rpm（12830g）离心30min以沉淀线粒体，
上清转至新管中，为胞浆蛋白，-80℃冷冻保存。
如果需要得到更为纯净的胞浆蛋白.可以将在步骤4中得到的胞浆蛋白在4℃，15000
rpm（20000g）离心30min。弃沉淀（可能含有溶酶体，过氧化氢体的杂质和少量线粒体），
保留上清。
5.取沉淀，加入0.1mL胞质提取Buffer（注：使用前，每mL胞质提取Buffer加入1μL蛋
白酶抑制剂，5μL磷酸酶抑制剂和1μLDTT），涡悬震荡洗涤30sec，4℃，13000rpm
（15000g）离心10min，去上清。
6.在沉淀中加入0.1mL的线粒体溶解Buffer(使用前，每mL线粒体溶解Buffer加入1μL
http://www.solarbio.com蛋白酶抑制剂，5μL磷酸酶抑制剂和1μLDTT)。冰上放置30min，再涡悬震荡30sec，
4℃，13000rpm（15000g）离心10min，得到的上清即为线粒体蛋白(为变性蛋白)。可用
于SDS-PAGE电泳。
如果需要完整的有活性的线粒体，请将线粒体沉淀用冷的胞质提取Buffer悬浮后2-80C
保存.如果用于线粒体活性蛋白研究，请将线粒体沉淀溶解于0.1mL预冷的活性溶解液（20
mmol/LTris-HClpH7.5、2mmol/LEGTA、2mmol/LEDTA、1%Tritonx-100），每1mL线
粒体活性溶解液加入1μL蛋白酶抑制剂和1μLDTT。冰上放置60min，再涡悬震荡30sec，
4℃，13000rpm（15000g）离心10min，取上清。
注意事项
1.所有的试剂及器具均需预冷后使用。以保证蛋白质的完整性和活性。
2.一般常规提取的蛋白样品，进行后续试验不需要透析，但如果需要较大量的提取蛋白或
后续试验结果不理想，则需要将提取的蛋白样品进行透析脱盐。
3.可以使用Sephadex重力型脱盐柱脱盐或将缓冲液替换为实验所需要的目的蛋白质的合
适缓冲液。
4.对于提取的蛋白质可以采用我公司生产的蛋白质浓度定量试剂盒对提取样品中的蛋白质
进行定量。
5.线粒体溶解Buffer-20℃保存时，若有沉淀析出，可置于30℃水浴中保温10min，并震荡
混匀，待沉淀完全溶解，冷却至室温后，即可使用。
核外p53通过AMPKmTOR信号抑制自噬并促进热打击诱导的血管内皮细胞损伤
核外p53通过AMPK/mTOR信号抑制自噬并促进热打击诱导的
血管内皮细胞损伤
李莉1，2，邹志敏1，2，李琴1，2，张堃1，2，苏磊3，古正涛1，21南方医科大学第三附属医院创伤救治中心，广东广州510630；2广东省骨科研究院//广东省骨科医院//广东省骨与关节退行性疾病重点实验室，广东广州510630；3中国人民解放军南部战区总医院重症医学科，广东广州510010
Extranuclearp53suppressesautophagythroughAMPK/mTORsignalingtopromoteheat
stress-inducedvascularendothelialcelldamage
LILi1,2,ZOUZhimin1,2,LIQin
1,2,ZHANGKun1,2,SULei3,GUZhengtao1,21TreatmentCenterforTraumaticInjuries,ThirdAffiliatedHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510630,China;2AcademyofOrthopedicsofGuangdongProvince//OrthopedicHospitalofGuangdongProvince//GuangdongProvincialKeyLaboratoryofBoneandJointDegenerativeDiseases,Guangzhou510630,China;3DepartmentofCriticalMedicine,GeneralHospitalofSouthernTheaterCommandofPLA,Guangzhou510010,China摘要：目的阐明核外p53通过调控蛋白激酶（AMPK）/雷帕霉素靶体（mTOR）信号通路介导自噬抑制在热打击后血管内皮细胞（VECs）损伤的分子机制。方法实验分为：对照组、热打击组、热打击组+CompoundC组、热打击组+rapamycin组、热打击组+PFT组，并分别使用AMPK抑制剂CompoundC、mTOR抑制剂（自噬激活剂）rapamycin、p53线粒体转位抑制剂PFT预处理细胞或C57BL/6小鼠，通过CCK8法检测细胞活力，Westernblot观察p53线粒体移位、自噬关键蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62以及AMPK/mTOR信号通路的激活情况，HE染色观察各组小鼠主动内皮血管病理改变，TUNEL染色观察各组小鼠动内皮血管凋亡情况。结果与对照组相比，热打击后主动脉内皮细胞（MAECs）活力显著下降（P<0.05），热打击后小鼠主动脉血管内皮细胞肿胀、脱落，内弹力膜断裂，平滑肌排列紊乱，可见大量凋亡细胞；热打击后随着复温时间（0、3、6、9h）延长，MAECs胞浆中p53表达逐渐减弱，而线粒体p53表达逐渐增强；热打击后（6h）LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达被抑制，p62蛋白表达增加（P<0.05）；热打击后（6h）AMPK的磷酸化被抑制，mTOR、4EBP1和p70S6K的磷酸化表达增加（P<0.05）。AMPK抑制剂CompoundC明显抑制了热打击后MAECs中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达，促进了p62蛋白表达，并加重了热打击后小鼠主动脉血管的损伤以及促进了凋亡的增加，而mTOR抑制剂rapamycin均呈现相反作用。p53线粒体转位抑制剂PFT促进了AMPK的磷酸化激活，并抑制mTOR、4EBP1和p70S6K的磷酸化（P<0.05）；使用PFT后促进了LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达，抑制了P62的表达（P<0.05）；使用PFT后明显提高了MAECs的细胞活力（P<0.05），也减轻了热打击后小鼠主动脉血管的损伤和凋亡的发生。结论核外p53主要通过抑制AMPK活性，激活mTOR信号，继而介导细胞自噬抑制，参与热打击诱导的MAECs损伤。关键词：热打击；核外p53；AMPK；mTOR；血管内皮细胞；自噬Abstract:ObjectiveToexploretheroleofextranuclearp53-mediatedautophagysuppressionbyregulatingAMPK/mTORsignalingpathwayinheatstress(HS)-inducedinjuryofmouseaorticendothelialcells(MAECs).MethodsPrimaryculturesofMAECswerepretreatedwithcompoundC(anAMPKinhibitor),rapamycin(amTORinhibitor)orpifithrin-α(PFT,aselectivep53inhibitor)for1hbeforeexposuretoHS(43℃)for2h.ThechangesincellviabilityatdifferenttimepointsafterHSwereexaminedusingCCK-8assay,andtheproteinexpressionsofP53,LC3-II,Beclin-1,p62andtheAMPK/mTORsignalingproteinsweredetectedusingWesternblotting.Intheanimalexperiment,C57micewerepretreatedwithcompoundC,rapamycinorPFTandexposedtoahightemperatureat40℃toinduceHS.ThepathologicalchangesintheaortaofthemicewereobservedwithHEstaining,andcellapoptosiswasdetectedusingTUNELstaining.ResultsInculturedMAECs,thecellviabilitywassignificantlyreduced(P<0.05)andthemitochondrialfractionofp53increasedwhileitscytoplasmicfractiondecreasedprogressivelyovertimefollowingHS.HSsignificantlyloweredtheexpressionsofLC3-IIandBeclin-1,increasedp62level,suppressedAMPKphosphorylation,andincreasedmTORphosphorylationandtheexpressionsofitsdownstreamproteinsat6haftertheexposure(P<0.05).PretreatmentwithcompoundCsignificantlyinhibitedLC3-IIandBeclin-1expression,enhancedp62expression,andaggravatedHS-inducedcellinjuryandapoptosisinMAECs;rapamycintreatmentproducedtheoppositeeffects(P<0.05).PFTtreatmentsignificantlyenhancedtheviabilityofMAECsandalleviatedHS-inducedinjuryandapoptosis;PFTalsosignificantlypromotedactivationofAMPKphosphorylation,inhibitedmTORphosphorylationanditsdownstreamproteins(P<0.05),enhancedtheexpressionsofLC3-IIandBeclin1,andinhibitedp62expressionintheMAECs(P<0.05).InC57mice,HSresultedinswelling,sheddingandapoptosisofaorticvascularendothelialcells.PretreatmentwithcompoundCobviouslyaggravatedHS-inducedvascularinjuryandendothelialcellapoptosis,whilepretreatmentwitheitherrapamycinorPFTsignificantlyalleviatedtheseinjuries.ConclusionAutophagyinhibitionmediatedbyextranuclearp53viainhibitingAMPKactivityandactivatingmTORsignalingparticipatesinHS-inducedinjuryofMAECs.Keywords:heatstress;extranuclearp53;AMPK;mTOR;vascularendothelialcells;autophagy收稿日期：2021-07-07基金项目：国家自然科学基金-青年科学基金（81901997）；广东省自然科学基金（2020A1515010092；2019A1515010295）；第65批中国博士后科学基金（2019M652960；2019M652965）；南方医科大学第三附属医院青年科研启动基金（2019Q006）SupportedbyNaturalScienceFoundationfortheYouth(NSFY)ofChina(81901997).作者简介：李莉，博士后，主治医师，E-mail:****************通信作者：古正涛，主任医师，E-mail:******************JSouthMedUniv,2021,41(11):1664-1671doi10.12122/j.issn.1673-4254.2021.11.10··1664
线粒体功能障碍是否调节ISR所需的胞质溶胶激酶
称为线粒体的细胞器负责以一种称为ATP的分子形式存储来自我们所吃食物的能量。尽管线粒体具有其自身的基因组，但该细胞器的蛋白质1的99%由核基因编码，并从胞质溶胶（细胞质的液体部分）导入线粒体。为了有效发挥作用，该过程需要协调和沟通，并且必须能够应对可能发生的任何线粒体功能障碍。环境毒素2和致病因子3以及各种与年龄相关的疾病，包括阿尔茨海默氏病4和帕金森氏病5与线粒体功能障碍有关。写在自然，郭等。6和FeSS1er箓7报道了一种先前未知的机制，线粒体利用该机制将功能障碍的信号发送至细胞质和细胞核，使细胞适应线粒体应激。对线虫秀丽隐杆线虫的研究装明,应激期间核与线粒体之间的协调受染色质重塑（核中DNA和蛋白质的复合物）的重塑以及对线粒体功能障碍作出反应的转录因子蛋白的活性共同调节8.9。哺乳动物的研究描绘了不同的情况，并暗示了一个称为综合应激反应（ISR）的过程，该过程导致蛋白质产量整体下降，但几种转录因子的产量增加。ISR被激活以响应多种细胞应激,包括那些不涉及线粒体的应激。在2002年，研究人员发现了10线粒体扰动驱动了ISR的一种成分-一种称为CHoP的转录因子的合成，并诱导了两种有助于ISR的线粒体蛋白的表达。它们是辅助蛋白质折叠的伴侣蛋白和蛋白酶，它们是裂解蛋白质的酷。一个长期的谜团是，线粒体功能障碍是否还直接调节了ISR所需的胞质溶胶激酶，并通过在蛋白质上添加磷酸基起作用。
ISR通过蛋白质eIF2α的磷酸化来调节（图1）,该磷酸化参与蛋白质合成过程中信使RNA的翻译。eIF2α的磷酸化由四种激酶（GCN2,PERK,PKR和HRD介导,它们分别响应不同的应激源而使eIF2α磷酸化。氨基酸消耗会刺激GCN2：PERK响应细胞质中称为内质网的未折叠蛋白的存在。在病毒感染过程中，当双链RNA在细胞质中积累时，PKR起作用。和HR1是士兵当分子血红素被耗尽“，12。eIF2α的磷酸化导致总蛋白质合成减少，但促进转录因子ATF4,ATF5和CHOP的产生。这些转录因子在海港及其mRNΛ的调控元件时eIF2a的磷酸化是促进翻译。
(完整版)线粒体膜电位检测(JC-1).
线粒体膜电位检测（JC-1)
大量的研究表明线粒体与细胞凋亡密切相关，其中线粒体跨膜电位（△的破坏，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。
JC-1(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)是一种阳离子脂质荧光染料，可作为检测线粒体跨膜电位指示剂。JC-1有单体和多聚体两种存在状态，在低浓度时以单体的形式存在，高浓度时以多聚体形式存在，两者的发射光谱不同，但均可在流式细胞仪绿色（FL-1）通道检测出绿色荧光，JC-1可透过正常细胞膜以单体状态聚集胞内，正常健康线粒体的膜电位（△）具有极性，JC-1依赖于△的极性被迅速摄入线粒体内，并因浓度增高而在线粒体内形成多聚体，多聚体发射光为红色荧光；可被流式细胞仪的红色（FL-2）通道检测到，而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，红光强度减弱，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。根椐这一特征检测线粒体膜电位的变化。
所需仪器或者试剂
流式细胞仪或荧光显微镜、高速离心机、CO2培养箱、微量移液器
1.5m L Microtube、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS、灭菌去离子水
使用注意事项
1． 微量试剂取用前请离心集液。
2． JC-1避光保存及使用。
3． 细胞培养的数量不宜超过1×106，否则细胞会产生自然凋亡影响检测。
4． 对PH变化过于敏感的细胞建议用胎牛血清取代Buffer孵育染色及洗涤，或延长观测时间
5． 流式细胞仪检测线粒体膜电位变化受到多种因素的影响，因诱导剂、细胞株类型，作用时间的不同而荧光强度比例都有不同，因此没有通用标准的补偿设门指南，因此每个试验需设阴性及阳性对照组进行荧光补偿及设门。
线粒体蛋白跨膜运送机制-概述说明以及解释
线粒体蛋白跨膜运送机制-概述说明以及解释
1.引言
1.1 概述
概述
线粒体是细胞内的一个重要细胞器，其功能涵盖能量产生、有氧呼吸、细胞代谢和细胞死亡等多个方面。线粒体内的蛋白质是线粒体正常功能的关键组成部分，而线粒体内蛋白的跨膜运送机制则是维持线粒体功能的基础。
线粒体蛋白的跨膜运送机制是指将蛋白从细胞质中运送到线粒体内的过程，以及在线粒体内蛋白跨过线粒体内、外膜的机制。这一过程涉及到多个参与者和分子机制的协同作用，确保线粒体蛋白的准确运送和定位。
线粒体蛋白的跨膜运送机制主要依赖于线粒体内膜上的跨膜转运蛋白和膜蛋白通道的作用。跨膜转运蛋白包括线粒体内膜通道蛋白和突破水泳移动蛋白等，它们在蛋白运送过程中起到了载体和引导作用。膜蛋白通道则是蛋白通过线粒体内、外膜的通道，确保蛋白在线粒体内膜间的准确定位。
线粒体蛋白跨膜运送机制的调控和功能也是非常复杂的。这一过程涉及到多个信号序列的识别和识别因子的参与，从而确保蛋白在运送过程中得到正确的定位和折叠。正常的线粒体蛋白跨膜运送机制对于线粒体功能的维持至关重要，而对此机制的深入理解有助于阐明线粒体相关疾病的发生机制，为相关疾病的治疗提供新的靶点。
本文将系统地介绍线粒体蛋白跨膜运送机制的基本概念和背景，主要参与者和过程，以及调控和功能的研究进展。通过对这些内容的总结和探讨，有助于更全面地理解线粒体蛋白跨膜运送机制的重要性和意义，并为未来的研究和应用提供展望。
1.2 文章结构
文章结构部分的内容可以描述一下整篇文章的组织和流程。以下是可能的写作内容：
文章结构部分：
文章将按照以下内容组织和论述线粒体蛋白跨膜运送机制的相关知识。
首先，在引言部分，对线粒体蛋白跨膜运送机制的概述进行介绍，强调其在细胞功能中的重要性，并简要介绍了文章的主要结构和内容。通过引言部分，读者可以迅速了解到本文的目的和内容。
接下来，在正文部分，将详细阐述线粒体蛋白跨膜运送机制的基本概念和背景。我们将解释该机制涉及的关键概念和术语，以及相关的背景知识。这部分内容将帮助读者建立对线粒体蛋白跨膜运送机制的整体认识。
生工2011蛋白促销产品名单zz
上海生工2011年促销产品
产品编号 产品名称 包装 折扣后价格 品牌
SK3031 Bradford Protein Assay Kit Bradford
蛋白质定量检测试剂盒 1000 Assays 75 生工
SK3041 Modified Bradford Protein Assay Kit
改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒 1000 Assays 180 生工
SK3051 Modified BCA Protein Assay Kit
改良型BCA蛋白浓度测定试剂盒 500 Assays 250 生工
SK4041 Modified Lowry Protein Assay Kit
改良型Lowry法蛋白浓度测定试剂盒 1000 Assays 90 生工
BSP013 Yeast Total Protein Extraction Kit
酵母蛋白提取试剂盒 50 Assays 100 生工
PL020 Bacterial Activity-Keeping Lysis Buffer
细菌活性化蛋白制备裂解液 10ml 80 生工
BSP053 植物蛋白提取试剂盒Plant Total Protein
Extraction Kit 50 Assays 150 生工
BSP051 Cytoplasmic and Mitochondrial Protein Extraction
Kit
胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒 50 Assays 190 生工
BSP009 细胞核蛋白质提取试剂盒Nucleoprotein
Extraction Kit 50 Assays 150 生工
BSP005 Membrane and Cytoplasmic Protein Extraction kit
膜蛋白和胞质蛋白提取试剂盒 50 Assays 320 生工
BSP001 Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit
EGR1基因在牛骨骼肌卫星细胞分化不同时期的表达及定位
ＥＧＲ１基因在牛骨骼肌卫星细胞分化不同时期的表达及定位
张伟伟１，２，邵淑丽１，２△，潘 阳１，李珊珊１
（１．齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，２．抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室，黑龙江齐齐哈尔１６１００６）
【摘要】 目的：研究ＥＧＲ１基因在牛骨骼肌卫星细胞（ＭＤＳＣｓ）分化过程的表达、定位及入核机制。方法：以牛的
ＭＤＳＣｓ为实验材料，在分化培养基中分别分化培养１ｄ、３ｄ和５ｄ，每组３个重复，检测不同分化时间的ＭＤＳＣｓ中
ＥＧＲ１基因的表达和ＥＧＲ１蛋白的定位情况；采用ＣＲＩＳＰＲｉ方法干扰内源ＥＧＲ１的表达，结合定点突变和激光共聚
焦方法初步探索了ＥＧＲ１蛋白入核的机制。结果：ｑＲＴＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测结果显示随着分化时间的进行，
ＥＧＲ１基因在转录水平和蛋白水平的表达都显著高于未分化的细胞，并随时间的延长而表达逐渐升高，分化第３日
时表达量最高，随后开始下降。免疫荧光检测到ＥＧＲ１蛋白主要在分化的ＭＤＳＣｓ中表达，并随肌管数量增多而表
达量增加。共聚焦结果显示随着细胞分化的进行，部分ＥＧＲ１蛋白转移进入细胞核。定点突变ＥＧＲ１蛋白Ｓ５３３Ａ
后，分化的ＭＤＳＣｓ细胞核内没有检测到ＥＧＲ１蛋白。结论：在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中，ＥＧＲ１基因转录表达
水平升高，部分ＥＧＲ１蛋白转移入细胞核，且ＥＧＲ１蛋白Ｃ端第５３３位丝氨酸磷酸化是入核所必需的。
【关键词】牛骨骼肌卫星细胞；分化；ＥＧＲ１基因；入核作用
【中图分类号】Ｑ２５４ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１０００６８３４（２０１９）０１００５００７
【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．５７０９．２０１９．００２
ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥＧＲ１ｇｅｎｅａｎｄｌｏｃａｔｉｏｎｏｆＥＧＲ１ｐｒｏｔｅｉｎｉｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｄｅｒｉｖｅｄｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｓ
线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1 )使用说明
线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）使用说明
货号：M8650
规格：100T
内容：产品名称包装JC-1（200×）100µL/管，共5管超纯90mLJC-1染缓冲液（5×）80mLCCCP（10mM）20µL
保存条件：
-20℃避光保存，尽量避免反复冻融，有效期一年。超纯水和JC-1染色缓冲液（5×）也可4℃保存。
产品简介：
线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）是一种以JC-1为荧光探针，快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化的试剂盒，可以用于早期的细胞凋亡检测。
JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位Ψm△的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。
JC-1单体的最大激发波长为515nm，最大发射波长为529nm；JC-1聚合物的最大激发波长为585nm，最大发射波长为590nm。实际观察时，使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。
本试剂盒提供了CCCP作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。对于六孔板中的样品，本试剂盒共可以检测100个样品；对于12孔中的样品，本试剂盒共可以检测200个样品。
操作步骤：
1、JC-1染色工作液的配制：
六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量为1mL，其他培养器皿的JC-1染色工作液的用量以此类推；对于细胞悬液每50～100万细胞需0.5mLJC-1染色工作液。取适量JC-1（200×），按照每50µLJC-1（200×）加入8mL超纯水的比例稀释JC-1。剧烈震荡充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2mLJC-1染色缓冲液（5×），混匀后即为JC-1染色工作液。
分离线粒体蛋白和胞质蛋白
线粒体分离试剂盒说明
PMSF一定要在线粒体分离试剂或线粒体裂解液加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。
分离线粒体的所有步骤均需在冰上或4℃进行，所用溶液需冰浴或4℃预冷。
1 准备溶液：室温融解试剂盒中的各种溶液，溶解后立即置于冰上并混匀。第一次使用时，把1.5ml PMSF(溶剂)加入到PMSF(晶体)中，溶解并混匀，即得到1.5ml 100mM PMSF。配制好的100mM PMSF溶液-20℃保存。如果最终目的是制备线粒体蛋白样品，根据样品数量，取适量线粒体分离试剂备用，在线粒体分离试剂加入到细胞样品中前数分钟内加入
PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。取适量线粒体裂解液备用，在线粒体裂解液加入到线粒体样品中前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
2 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用胰酶细胞消化液(Trypsin-EDTA Solution)消化细胞，离心收集细胞。
3 洗涤细胞：用冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞600g，4℃离心5分钟沉淀细胞。弃上清。
4 预处理：加入1-2.5ml临用前添加了PMSF的线粒体分离试剂至2000-5000万细胞中，轻轻悬浮细胞，冰浴放置10-15分钟。
5. 匀浆：把细胞悬液转移到一适当大小的玻璃匀浆器中，匀浆10-30下左右。
6 匀浆效果的鉴定：不同细胞不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。通常可以在匀浆10次后取约2微升细胞匀浆，加入30-50 微升台盼蓝染色液，混匀后显微镜下观察台盼蓝染色阳性( 蓝色) 细胞的比例。如果阳性细胞比例不足50%，增加5次匀浆。随后再同前取样进行台盼蓝染色鉴定。当阳性比例超过50%时即可停止匀浆进入下一步。请勿过度匀浆，过度匀浆会导致线粒体的机械损伤。同时记录对于该细胞的匀浆次数，通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。
线粒体提取试剂盒说明书
北京索莱宝科技有限公司
第1页共2页线粒体提取试剂盒说明书货号：SM0020规格：50T/100T保存：四周内使用可4℃储存，长期保存请置于-20℃。产品内容：组份SM0020-50TSM0020-100TLysisBuffer50mL100mLMito-WashBuffer25mL50mLStoreBuffer5mL10mL产品简介：线粒体提取试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于动物软组织（肝或脑组织）和硬组织（肌肉）以及培养细胞的线粒体的制备。其制备物产量高，可以被用于细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。操作步骤：1.样本处理a.组织匀浆：称取100~200mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.0mL冰预冷的LysisBuffer，0℃冰浴上下研磨组织20次；b.培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800g离心5~10min收集细胞，计数。每次提取需要5×107个细胞，加入1.0mL冰预冷的LysisBuffer重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨30~40次。2.将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，1000g离心5min。3.取上清，转移至新的离心管中，4℃，1000g再次离心5min。北京索莱宝科技有限公司
第2页共2页4.取上清，转移至新的离心管中，4℃，12,000g离心10min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底。5.往线粒体沉淀中加入0.5mLWashBuffer重悬线粒体沉淀，4℃，1000g离心5min。6.取上清，转移至新的离心管中，4℃，12,000g离心10min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底。7.用50-100μLStoreBuffer或合适的反应缓冲液重悬线粒体沉淀，立即使用或-70℃保存。注意事项：1.为保证获得完整的线粒体，务必做到：第一，全程低温操作；第二，快速；第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞，这是制备线粒体的最关键环节。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。2.以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。3.进行WesternBlot和2D-胶电泳，可直接加入上样缓冲液裂解线粒体。转速与离心力换算：G＝1.11×(10-5)×R×[rpm]２G为离心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍数来表示；[rpm]２即：转速的平方；R为半径，单位为厘米。
普利莱基因技术线粒体提取试剂盒说明书
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ApplygenTechnologiesInc.DocRev:201910Page1of2升级版线粒体提取试剂盒C0010
描述：线粒体制备试剂盒(MitochondriaIsolationKit)用于从组织或培养细胞中分离线粒体和细胞胞浆成分。加入分离溶液，匀浆破碎组织细胞，经过数次800g和12000g离心，在60分钟内即可分离出完整的线粒体和胞浆成分。制备的线粒体具有很高的生物学活性，可进行各种功能研究如酶学测定，更可用于WesternBlot、2D-胶、线粒体蛋白或DNA提取、蛋白质组学等研究。严格按照说明操作，总是能制备获得高纯度线粒体。一篇方法学研究论文发现，用普利莱试剂盒制备线粒体的得率、活性、纯度优于蔗糖密度梯度离心法和Invotrogen/Pierce线粒体提取试剂盒方法。适用：从组织、培养细胞制备高纯度线粒体，同时分离细胞胞浆成分。组成：MitoSolution100mlfor50次制备200mlfor100次制备储存：−20ºC12个月有效操作步骤：以下所有操作均在4ºC进行1.组织匀浆：100~200mg新鲜组织如肝、脑、肾、心肌等，剪为0.5cm2碎块放入小容量玻璃匀浆器内。估计组织块总体积。加入1.5ml冰预冷的MitoSolution。用间隙严紧的研杵上下研磨组织20次。培养细胞匀浆：800×g5min离心收集细胞。单次提取需2-5×107个细胞。加入1.5ml冰预冷MitoSolution重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，用间隙严密的研杵研磨细胞30次。2.将匀浆液转移到离心管中，800×g，4ºC离心5min。（胞核、膜碎片、未裂解细胞等在管底，弃去）3.收集上清液并转移到新的离心管。再次800×g离心5minat4ºC，弃沉淀。4.将上清液转移到新的离心管。10,000×g离心10min4ºC。线粒体沉淀在管底。离心后的上清含胞浆成分，可收集用于对照实验。5.洗涤线粒体：加入0.2mlMitoSolution，轻弹管底重悬线粒体沉淀；12,000×g离心10min4ºC。弃上清，线粒体沉淀在管底。6.重悬线粒体：可以用MitoSolution重悬线粒体沉淀，也可以用合适后续实验的自备缓冲液来裂解线粒体沉淀，具体用量是：约每100mg组织提取的线粒体用50µl，约每5×107个细胞提取的线粒体用100µl。用量请根据组织或细胞类型进行微调。7.裂解线粒体后，进行蛋白浓度测定。立即使用或−70ºC保存。说明：1.制备高质量线粒体的关键：第一，全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中；第二，快速，微量制备比大规模制备操作更快速，更容易获得完整的线粒体，且得率高；第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。破碎效果与组织细胞类型有关；与组织块相比，贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁。用1-3ml小容量玻璃匀浆器(而不是其它破碎装置)上下研磨培养细胞20-30次。玻璃匀浆器须配套选用间隙严密的研杵，其特征是将研杵插入匀浆器套管后，可提起研杵而套管不会脱落。正确的匀浆不是旋转研杵，而是上下缓慢推拉研杵，研杵推进和提升过程中细胞遭受压力的剧变而破碎。研磨程度可用相差显微镜进行检查当未裂解细胞在~50%即可。过度研磨会破坏线粒体，而研磨不足将降低线粒体得率。2.如果不得不用电动匀浆器(polytron)，可选用6500转，刀头上下进出4次共计10秒。不同的电动匀浆器性能差别甚大，除非步步监测，否则分离结果难以预料。3.不同的离心机必须跟据离心力g计算正确的离心转速(允许10%波动)，否则将导致不纯。4.进行WesternBlot可直接用RIPA裂解液或SDS-PAGE样品缓冲液裂解线粒体；也可先用MitoSolution重悬线粒体，再加入2xSDS-PAGE样品缓冲液。5.Cytochromeoxidase,Monoamineoxidase,Succinatedehydrogenas,Glutamatedehydrogenase可用作线粒体的标志酶。6.重悬线粒体：可以用MitoSolution重悬线粒体沉淀，也可以用合适后续实验的自备缓冲液来裂解线粒体沉淀62053186