基因工程实验报告的实验步骤.doc

实验一：大肠杆菌DH5α和 BL21 感受态细胞的制备

【实验步骤】

1 从 LB 平板上挑取新活化的大肠杆菌DH5α单菌落，接种到 5mL LB 培养基中， 37℃振荡培养过夜。

2 取 1mL培养物接种到 100mL LB 培养基（ 250mL三角瓶）中， 37℃振荡培养 2~3h。

3 将菌液转移到50mL离心管（ 2 管）中，冰上放置15min。

4 4 ℃ 4000 rpm 离心 5min，弃去上清液，倒置使培养液流尽。

5 用 20 mL 冷 CaCl2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4℃ 4000 rpm 离心 5min，弃去上清液。

6 用 10 mL 冷 CaCl2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30min。

7 4 ℃ 4000 rpm 离心 5min，弃去上清液，用 2 mL 的冷 CaCl2溶液悬浮。

8分装到数个 EP管中，每管 200 uL ，冷冻保存备用。

实验二：目的基因质粒（T-SOD或 T-IL218 ）

和表达载体质粒（ PET32或 PET30）的转化及大量提取

【实验步骤】

一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）

1、取 200 uL 新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒 DNA2 uL（ PET32a， IL-18 ），混匀，冰上放置 30min。

2、将 EP管放到 42℃保温 90s，冰浴 2min 。

3、加入 800uL LB 液体培养基， 37℃慢摇复苏 1 h 。

4、将 100 uL的复苏细胞涂布在含有Amp（ 100mg/mL）的 LB 培养皿中，正置平皿30min （使菌液被培养基吸收）。

5、倒置平皿37℃培养 16 h ，出现菌落。

二、质粒的提取

1挑取单菌落接种于 100 mL 加入 50uL Amp 的 LB 液体培养基中，振荡培养过夜。

2 过夜培养的菌液加入 mL 的小指管（ 20 个每组）中，每次 1 mL，4℃， 12000 rpm ，离

心 1min， 4 次，弃上清。

3 加入 150uL 溶液Ⅰ悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10min。

4 加入 350uL 溶液Ⅱ （新鲜配制），轻微颠倒混匀20 次，冰浴 5min。（不能再剧烈震荡）

5 加入 300uL 溶液Ⅲ（冰上预冷），颠倒混匀20 次，不能剧烈震荡，冰浴 10min。

6 4 ℃， 12000 rpm ，离心 10 min ，取上清转移至另一离心管中。

7 向上清中加入倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置20 min 。

8 4 ℃， 12000 rpm ，离心 10 min ，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。

9 用 1mL 70%乙醇洗涤质粒 DNA沉淀 2 次，每次 4℃， 12000 rpm ，离心 3min，吸去上清。

10 55℃烘干至无酒精，加入20uL TE，所有集成一管后加入RNase 1~2uL，37℃消化 1~2h，-20 ℃保存。

11 电泳分析。制胶：琼脂糖，20mL 1× TBE缓冲液，溶解后倒入制胶板，放入梳子，冷

却凝固待用。点样： 6uL 质粒 +1uL 上样缓冲液。电压： 180V，电泳至蓝色带距离点样孔3cm。

实验三目的基因质粒和表达载体质粒的酶切及其产物的分离纯化

【实验步骤】

1酶切

酶切体系

试剂

灭菌水5uL 小量酶切大量酶切

—

质粒10uL 88uL

EcoRⅠ1uL

HindⅢ1uL

10× Tango buffer 4uL 10uL

终体积20uL 100uL

按以上酶切体系加入mL EP 管中， 37℃放置 3h，电泳回收片段。

（点样：酶切体系100uL+上样缓冲液20uL。）

2酶切产物的回收

1)将单一的目的 DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分放入干净的离心管中，

称取重量。

2) 向胶块中加入 3 倍体积溶胶液（如果凝胶重为，其体积可视为100uL，则加入 300uL 溶

胶液），50-55 ℃水浴放置10min ，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶

解。

注意：溶胶时，如果溶胶液变为红色（正常情况下为淡黄色），可向含有DNA的胶溶液中加10-30uL 3N醋酸钠（）将溶液调为淡黄色，否则将会影响DNA与吸附柱的结合，影响回收

效果。

3) 将上一步所得的溶液加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），13，000rpm离心

30-60s ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合

DNA的能力较弱。

4) 向吸附柱中加入700uL 漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），13，000rpm离

心 30-60s ，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

5)向吸附柱中加入 500uL 漂洗液， 13，000rpm 离心 30-60s ，倒掉废液。

6)将离心吸附柱放回收集管中， 13，000rpm 离心 2min，尽量出去漂洗液，将吸附柱开盖于室

温 1-2min ，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

7) 将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65-70 ℃预热的洗

脱液，室温放置 2min。 13， 000rpm 离心 2min 收集 DNA溶液。

8) DNA产物 -20 ℃保存。

完毕后电泳检测回收与纯化效果：DNA回收纯化后，电泳检测应为单一的一条带，如果切胶

过程中不慎带上染带，回收后电泳结果可能会出现两条以上的带，这时应重复上述方法进行回收

与纯化。

实验四目的基因与表达载体的重组及重组子的筛选与鉴定

【实验步骤】

1载体与目的基因的连接

1)在一 EP 管中加入 2uL 酶切后的载体 DNA与 6uL 目的 DNA片段。

2) 添加 1uL 的 10× buffer以及1uL的T4DNA连接酶，总体积10uL。

3)16℃水浴条件下保温过夜连接。

2感受态细胞与连接产物的转化

1)取感受态细胞 BL21（实验一制备） 200uL ，加入 6uL 连接产物，轻轻用枪吹打混匀（不可

震荡）。

2)冰浴 30min。

3)热激： 42℃保温 90S，冰浴 2min 。

4)加入 800ul LB 培养基， 37℃慢慢复苏 30min。

5)将复苏菌液 4000r/min 离心 1min，先吸去 800μ L 上清，再将细胞吹散成细胞悬液，取

50μ L 细胞悬液直接涂布在含氨苄青霉素（Amp）100ug/ml、X-gal和IPTG的LB选择平板上。

6) 将平板正向放置30min 左右至液体被吸收，倒置平板37℃培养 16— 20h 出现菌落，其

中白色为重组质粒。

3重组子的鉴定（蓝白斑筛选，小提质粒比大小和酶切分析）

1）将白色单菌落接入3mL 含抗生素（ Amp）的 LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

2）按实验二的方法提取质粒DNA， 20uL RTE 溶解 DNA沉淀。

3）双酶切质粒DNA 20uL 体系，方法同上。

4） 1%琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒和它的酶切产物。

（酶切鉴定重组子可见重组成功的重组子有两个条带：一为切为线性的PET32a 质粒条带，一为目的基因条带。）

实验五目的基因在大肠杆菌中的诱导表达及表达产物的SDS-PAGE分析

实验 I、外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

【实验步骤】

1.分别挑取白斑菌落（重组菌株）、蓝斑菌落（非重组菌株）于5ml 含 AMP的 LB 液体培养基中， 37℃， 190r/min振荡培养过夜( 注意取菌株要在超静工作台上操作，一定注意无菌) 。

2. 分别取过夜培养菌 1ml 接种到 5ml 含 AMP的 LB 液体培养基中（蓝，白斑各 3 管，作好标

记），于 37℃摇床培养 4h 左右，达到 1 个 OD值。

3.因为诱导剂 IPTG 的量 , 诱导条件 , 诱导时间，培养基成分都可影响诱导表达，所以可按如

下 6 组设计培养

摇瓶时间（ t/h ）IPTG/ul 温度 T/℃样液

5 7 32 白

5 7 37 白

5 7 42 白

5 7 32 蓝

5 7 37 蓝

5 7 42 蓝

4.分别取 6 支试管按上述表格控制条件 , 摇瓶培养 5h。

5.取 1ml 摇瓶后菌液于离心管，共 6 支， 4℃低温离心， 12000 r/min ， 5 min ，收获菌体，弃上清，取沉淀（菌体可放 -20 ℃存放备用）。

6.向每支试管沉淀均加入 200μ L TE 液，将细胞悬浮。

7.每管加入200μ L 2 X SDS buffer。开水煮沸5min，再冰浴2min， 4℃,12000 r/min，5 min ，取上清液做凝胶电泳。

8. 观测结果及分析（实验Ⅱ）。

实验ⅡSDS-PAGE 检测表达蛋白

【实验步骤】

1．配制分离胶

分离胶配方

双蒸水分离胶缓冲30%胶贮液10%SDS TEMED10%AP 液

5ML8ML200μ L15μL150μ L

①按要求装好胶板

②按比例调好分离胶，混匀后加入两玻璃夹缝中，到上口约2cm处，并小心在胶面上加入蒸馏水，约 40 min ，等胶自然凝聚后倾斜倒，出蒸馏水，并在两玻璃板夹缝中水平插入1cm mm

的梳子( 在胶面上加入蒸馏水称水封，其目的是保持胶面平整和防止空气进入，影响凝胶) 。

2.按配方配制好浓缩胶

浓缩胶配方浓缩胶缓冲胶贮液10%SDS TEMED 10%AP

双蒸水液

100μ L 15μL 75μ L

混匀后加入到分离胶上，并没过梳子，待凝固后小心拨出梳子。

3．样品制备

菌体样品与 2 ×上样缓冲液l:1 混匀，并在100 C 沸水浴中保温3-5 min，取出待用。

4. 点样，电泳：开始电泳后，先恒压80V，样品进入分离胶后恒压120V，至电泳带跑到前沿

后停止电泳。

5.固定、染色、脱色：电泳完毕，将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下凝胶，将凝

胶浸泡于染色液中染色 30min左右，最后加脱色液放到脱色摇床上脱色至区带清晰为止。