流式细胞术常见实验分析
组织做流式细胞术实验步骤
组织做流式细胞术实验步骤流式细胞术，这名字听上去有点高大上，其实就是一种检测细胞的小工具，能帮我们数一数细胞的数量、类型，甚至能看看细胞里发生了什么“八卦”。
今天，我就给大家轻松聊聊怎么做这个实验，别担心，不会让你觉得像是在读教科书！1. 实验准备1.1 材料准备首先，咱们得准备好所有的材料，像做饭一样，先把菜都切好了。
你需要的有：流式细胞仪、细胞悬液、抗体、PBS（磷酸盐缓冲液）和一些其他的小玩意儿。
话说回来，细胞悬液就像是咱们的主菜，抗体呢，就像是调料，能帮我们把细胞“调”出不同的口味。
记得提前检查一下，别到时候缺了盐（抗体），结果菜就没法做了！1.2 设备调试设备调试这事儿，虽然听上去有点麻烦，但其实就像给车子加油一样。
把流式细胞仪打开，检查一下它的设置，看看有没有故障。
你可不能指望它像“超人”一样自动工作，得稍微照顾一下。
调整好激光和光电探测器，这可是流式细胞术的“面子工程”，咱们要让它看起来专业一点嘛！2. 实验步骤2.1 细胞制备准备好了材料后，就可以开始“烹饪”了。
首先，将细胞悬液取出，轻轻摇晃，让细胞均匀分布。
记得别用力过猛，像对待婴儿一样轻柔，不然细胞就容易“受伤”。
接下来，加入适量的抗体，确保每个细胞都能得到“调料”的滋润。
这一步就像是在给细胞穿衣服，让它们打扮得漂漂亮亮的。
2.2 孵育与洗涤完成了“穿衣”，咱们得给它们一点时间孵化，就像煮汤一样，让它们入味。
把细胞悬液放在37摄氏度的温箱里，大概30分钟到1小时，耐心点，别急！这时候可以做点其他的准备，省得等得无聊。
时间到了，记得把细胞拿出来，加入PBS洗涤，洗去多余的“调料”。
再用离心机把细胞沉淀下来，这个步骤可得小心翼翼，别让细胞“跑”了。
3. 数据采集3.1 设置流式细胞仪现在，我们终于可以进入大戏的最后一幕了！将洗涤好的细胞悬液放入流式细胞仪中，设置好参数。
这一步就像是给细胞上场前的最后准备，调好焦距，亮度，确保它们在仪器面前能“光芒四射”。
细胞亚群检测实验报告
1. 了解淋巴细胞亚群检测的基本原理和方法。
2. 掌握流式细胞术在淋巴细胞亚群检测中的应用。
3. 分析实验结果，了解淋巴细胞亚群在免疫调节中的作用。
二、实验原理淋巴细胞亚群检测是利用流式细胞术对淋巴细胞进行分类、计数和功能分析的一种技术。
通过特异性抗体标记，检测淋巴细胞表面标志物，实现对不同亚群的识别。
本实验主要检测T细胞、B细胞和NK细胞亚群。
三、实验材料1. 实验试剂：抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD19、抗CD16、抗CD56单克隆抗体。
2. 实验仪器：流式细胞仪、细胞培养箱、离心机、移液器等。
3. 实验样本：新鲜血液。
四、实验步骤1. 样本采集：采集受试者新鲜血液，分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
2. 抗体标记：将分离的PBMCs与抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD19、抗CD16、抗CD56单克隆抗体混合，室温孵育30分钟。
3. 洗涤：将标记好的细胞用磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）洗涤两次。
4. 流式细胞术检测：将洗涤后的细胞上流式细胞仪，进行检测和分析。
5. 数据分析：使用流式细胞术分析软件对实验数据进行处理，计算各亚群细胞比例。
五、实验结果1. T细胞亚群：CD3+T细胞占外周血淋巴细胞的50-70%，其中CD4+T细胞占CD3+T 细胞的30-45%，CD8+T细胞占CD3+T细胞的30-45%。
2. B细胞亚群：CD19+B细胞占外周血淋巴细胞的10-20%。
3. NK细胞亚群：CD16+/CD56+细胞占外周血淋巴细胞的5-15%。
1. 实验结果表明，本实验成功检测了T细胞、B细胞和NK细胞亚群，验证了流式细胞术在淋巴细胞亚群检测中的应用价值。
2. 淋巴细胞亚群在免疫调节中发挥重要作用。
CD4+T细胞具有辅助功能，参与细胞免疫和体液免疫；CD8+T细胞具有杀伤功能，直接杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞；B细胞产生抗体，参与体液免疫；NK细胞具有天然杀伤功能，对病毒感染细胞和肿瘤细胞具有杀伤作用。
2024流式细胞术临床检验图文报告书写专家共识要点(全文).docx
2024流式细胞术临床检脸图文报告书写专家共识要点(全文)摘要流式细胞术(FCM)是一种综合运用了光学、机械学、流体力学、免疫学等学科的实验技术，广泛用于临床检验。
FCM临床检验报告以文字描述和必要的图片呈现检验结果，并给出解释性注释，提出实验诊断及进一步检验建议。
然而，FCM检验结果的描述和报告书写规范尚未统一，致使不同医疗机构的FCM检验报告的可读性和严谦性参劳不齐。
为此，中国中西医结合学会检险医学专业委员会蛆织专家对FCM临床检酷图文报告中的必要信息和书写格式进行规范，以加强实验室和临床对FCM检验结果的正确解读。
流式细胞术(f1.owcytometry,FCM)是一种综合运用了光学、机械学、流体力学、免疫学等多学科方法，对细胞进行定性及定量检触的技术，已成为临床对淋巴造血系统肿瘤和非造血系统肿瘤进行诊断与鉴别诊断、微小残留病及疾病复发检验的重耍手段；并且通过评价免疫细胞亚群和功能,广泛应用于实体肿痛、自身免疫性疾病、感染性疾病、免疫缺陷型疾病和移植免疫等领域［1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12］。
不同领域FCM临床检验报告内容有所不同，如对免疫分型及微小残留病(minima1.residua1.disease,MRD)等临床诊断项目需使用文字及相关图片来描述检验结果，并给出FCM的分析诊断，必要时还需提出进一步检验建议；而免疫细胞亚群检测项H需评估目的细胞群的细胞水平。
然而，FCM临床检酷报告的书写尚未统一，临床检验报告内容的描述存在差异，这阻碍了FCM检验结果的规范化和标准化，甚至影响临床对检验结果真实性和可信度的判断，更不利于实验室间结果互认。
少砧指南共识对FCM临床检验报告的内容作出了推荐，但局限于少数检测项目和报告内容的极少部分指标[1,2,3,4]。
随着FCM检验技术的发展和临床应用需求的提高，对FCM临床检验报告的规范也提出了更高要求[13,14,15]O因此，中国中西医结合学会检验医学专业委员会组织专家制订该共识，对FCM临床检验报告提出「书写要求，规范r图文报告的表达方式，将在规范检险报告的必要信息及检验结果的正确解读。
医学免疫学实验五 流式细胞术检测免疫细胞表面标记
实验目的
1 了解BD FACS Verse的流式细胞术 2 学习并掌握FCM 的原理 3了解FCM 的运用 4 简单运用FCM检测免疫细胞特性
✓ Introduction FCM Principles FCM Applications
Introduction
BD是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于
BD Introduction FCM Principles ✓ FCM Applications
Flow Cytometry Applications Flow Cytometry Applications
• 细胞结构
• • 细胞大小 • • 细胞颗粒度 量与细 胞周 期
利用优化的缓冲液和抗体借 助 流式细胞仪检测转录因子 表达
用流式细胞仪分选细胞或 检测细胞表面蛋白表达
用 BD Phosflow 抗 体 检测关键蛋白的磷酸化水平
用 ELlSA或 ELISPOT方 法 检 测
分泌的细胞因子
..，.---\1 用 流 式 细 胞 仪 检 测 特 异 细 胞 胞内细胞因子表达
1897年在纽约创立的，总部设在新泽西州。
Maxwell W. Becton
Fairlegh S. Dickinson
经过一百多年的发展，BD已成为世界上最大的医疗技术及医
疗设备公司之一，它以领先的技术、卓越的产品质量和诚实可
信的服务赢得了全球用户及合作伙伴的广泛赞誉。
BD Introduction ✓ FCM Principles
Flow Cytometry Principles
某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比 照射光波长长的光线-即荧光。而这些受激发后能产生荧 光的物质称为荧光素
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞仪及流式细胞术
流式细胞仪及流式细胞术流式细胞仪技术流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。
它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。
其优点如下：1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。
2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。
3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。
基本流程原理：1、将待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定的角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
2、流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90度方向的光电倍增管接收。
散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，被称为细胞的物理参数或固有参数，散射光有包括前向角散射和侧向叫散射，前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信号。
荧光信号也有两种，一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。
流式细胞分析技术
ü 光电倍增管（PMT）：
检测散射光和荧光；同时将光学信号转换成 电脉 冲信号。
14
滤光片
分色反光镜
15
PMT 滤光片
荧光和散射光检 测系统
分色反光镜
激发光
激光聚光系统
16
数据处理系统
• 计算机及其软件组成 • 进行实验数据的分析、存储、显示
Photons/Detector (V)
光信号转化为电脉冲信号
特点：单细胞、快速、高通量、多参数、准确、灵敏
经典流式细胞仪（分析型和分选型） 量化成像分析流式细胞仪 质谱流式细胞仪
单激发光；4个 荧光检测通道
经典流式细胞仪
双激发光；6个 荧光检测通道
Coulter EPICS XL
6
量化成像分析流式细胞仪
美国merck millipore公司
质谱流式细胞仪
11
经典流式细胞仪
液流系统-液流聚焦原理
喷 嘴
鞘液(Sheath）
喷嘴
荧光信号或 侧向散射光
样本流
前向散射光 单个细胞流
12
液流系统形成单 个细胞流示意图
13
光路系统
ü 激发光：
常用的是空冷式的氩离子激光光源（488nm）；氦氖 激光光源（633nm)；紫外光源
ü 各种光学镜片：
分色反光镜 光束成形器；透镜 滤光片：长通滤片；短通滤片；带通滤片
(一）标本采集、运输、保存和操作 l标本来源
l几乎所有组织细胞均可用于FCM检测 l免疫标本主要来源于外周血、骨髓、 淋巴器官或组织等
l抗凝剂选择
l肝素钠(首选) lEDTA-Na2
l标本保存
标本制备
ü 外周血或骨髓样本
流式细胞术检测巨噬细胞吞噬功能的方法建立
Vo l. 20
NO . 5
2007
基础医学研究
流式细胞术检测巨噬细胞吞噬功能的方法建立
陈连山 张 洋 苏玉虹 ( 辽宁医学院
1ml FIT C( 0. 01mg FI T C/ 500ul 碳酸盐缓冲液 ) 37 收稿日期 : 2007 03 16 作者简介 : 陈连山 ( 1974 ) , 辽宁医学院讲师。
622
数理医药学杂志 大肠杆菌形态逐渐模糊 ) 。 2 2 小鼠巨噬细胞吞噬 F IT C 标记大肠埃希菌的动力学 特点 小鼠巨噬细胞与 FI T C 标记大肠埃 希菌在 37 作用 不同 分别为 0% 、 11. 20 54. 58 3. 5% 、 37. 22 1, 图 4) 。
参
考
文
献
1 2
张盈华 , 殷缨, 张莉 , 等 . 流式细胞仪测定 巨噬细胞吞噬率 方法的建 立及其应用 . 第四军医大学学报 . 2002, 23( 17) : 1559~ 1561. Wh it e Ow en C, A lexander JW , S ram koski R M , et al. Rapid w h ol e blood micr oassay usin g f low cyt ometr y f or measu ring neu t rophil phagocyt osis. J Clin M icrobi ol , 1992, 30( 8) : 2071~ 2076.
在020min内巨噬细胞吞噬大肠埃希菌的量逐渐增加巨噬细胞吞噬泡中大肠埃希菌的量增加30min左右时巨噬细胞吞噬量最高40min后巨噬细胞吞噬量有减少趋势吞噬泡中有明显的溶菌现象泡内大肠杆菌形态逐渐模糊22小鼠巨噬细胞吞噬fitc标记大肠埃希菌的动力学特点小鼠巨噬细胞与fitc标记大肠埃希菌在37作用不同时间后巨噬细胞的实际吞噬率在01020304050min时分别为0112020215721622250545835372241在30min左右即达到峰值表1图4
直接和间接流式细胞术实验方案
直接和间接流式细胞术实验方案请关注：↑Abcam 助您更快实现研究使命直接流式细胞术实验方案采用偶联一抗的流式细胞术的一般步骤。
收集、清洗细胞，并用冰冷的 PBS、10% FCS、1% 叠氮化钠调节细胞悬液浓度至 1-5 x 106 细胞/mL。
通常使用聚苯乙烯圆底 12 x 75 mm2 Falcon 管进行细胞染色。
但是，任何可用于离心的容器均可用于细胞染色，例如试管、eppendorf 管以及 96 孔圆底微量滴定板。
一般而言，细胞应进行充分离心，以除去上清液并保证细胞损失最小，同时细胞容易重悬。
我们建议使用冰冷的试剂/溶液进行染色，或在 4 °C 条件下操作，因为低温和叠氮化钠的存在可以防止表面抗原的调节和内化。
内化会导致荧光强度的损失。
添加 0.1-10 μg/mL 偶联一抗。
如有需要，可使用 3% BSA/PBS 稀释（也可在此时加入碘化丙啶以排除死细胞）。
在室温或 4°C 下避光培养 30 分钟。
此步骤需要进行优化。
清洗细胞三次，并在 400 g 离心力下离心五分钟，然后重悬于 500 µL 至 1 mL 冰冷的 PBS、10% FCS 及 1% 叠氮化钠中。
将细胞避光保存于冰上，或放入 4°C 冰箱中，待使用时再取出用于分析。
为获得最佳结果，应尽快使用流式细胞仪分析细胞。
abcam 2018-07-05abcam 此为临时链接，仅用于预览，将在短期内失效。
我们建议当天进行分析。
细胞的所需保存时间较长（16 小时）或需要配合细胞仪的分析计划时，可此为临时链接，仅用于预览，将在短期内失效。
以使用 1% 多聚甲醛重悬细胞，以防坏死。
固定：如果等待时间超过 1 个小时，可在步骤 3 后固定细胞。
这样，细胞可以保存数天。
（这可以使光散射更加稳定，并使大多数生物性危害因子失活）。
对照物也需采用相同步骤进行固定。
如果需要保持细胞活力，则不要进行固定。
固定方法有很多种，具体可参见间接染色实验方案的固定部分。
流式细胞术去除粘连的原理(一)
流式细胞术去除粘连的原理(一)流式细胞术去除粘连的原理介绍流式细胞术是一种广泛应用于生物学和医学研究中的技术，可以对单个细胞进行快速高效的分析。
然而，在进行流式细胞术时，细胞之间往往会产生粘连现象，这给准确分析带来了一定的困扰。
本文将深入探讨流式细胞术去除粘连的原理。
粘连现象的产生粘连是指在细胞处理过程中，细胞相互之间黏附在一起，形成团块或聚集体。
粘连的主要原因包括细胞表面分子的黏附能力、培养条件的影响以及细胞本身的特性。
粘连对流式细胞术的影响粘连严重影响流式细胞术的准确性和可靠性。
首先，粘连会导致细胞在流式细胞术中无法单个分散，从而无法进行准确的单个细胞分析。
此外，粘连还可能导致细胞在分析过程中损失，使结果产生偏差。
去除粘连的方法为了解决粘连问题，科学家们提出了多种方法来去除细胞的粘连性。
以下是一些常用方法的介绍：1.酶消化法：–使用酶溶解细胞间的黏附分子，从而实现细胞的分散。
–常用的酶包括胰蛋白酶、凝血酶等，具体选择酶的种类和浓度需根据实验需求进行优化。
–注意：酶的浓度过高可能造成细胞损伤，浓度过低可能无法完全去除粘连。
2.机械刮取法：–使用刮刀等器械对粘连的细胞进行轻微刮取，使其分离。
–此方法适用于粘连程度较轻的细胞，刮取力度要轻，避免对细胞造成损伤。
3.化学处理法：–使用表面活性剂或降解粘附分子的化学物质来破坏细胞的粘附。
–例如，使用含有非离子型表面活性剂的细胞培养液进行处理，可以减少细胞间的黏附现象。
4.低温处理法：–将细胞置于低温环境下，通过温度的影响使细胞黏附力减小，从而分散细胞。
–注意：温度过低可能影响细胞的生理状态，需谨慎操作。
结论粘连是流式细胞术中常见的问题，但通过合适的方法可以有效地去除细胞的粘连性。
鉴于实验需求和细胞特性，选择适当的去除粘连的方法非常重要。
方便、高效地去除细胞的粘连性将为流式细胞术的成功应用提供有力的保障。