曲药酯化酶活力测定方法的初步研究
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
年
第期总第期
酿
酒
科
技
摘
要
关键词曲药醋化酶活力测定方法的初步研究姚万春廖建民唐玉明任道群任玉茂陈同平樊林四川沪州市酿酒科学研究所四川庐州老窖股份有限公司应用正交对比试验对影响大曲醋化酶活力测定的诸因素中的个因素个水平进行了对比研究结果表明各处理间己酸乙醋含量差异明显分析了造成差异的原因为统一大曲醋化力,定标准提供依据大曲酉旨化
酶活力
测
定
随着酿酒业的不断发展大曲醋化酶的作用及其利用越来越受到人们重视窖泥中己酸菌的发现和利用使浓香型白酒技术发生了一革命性的变化可以预料大曲醋化酶的深入研究和广泛应用将给浓香型白酒生产技术带来再一次飞跃目前对大曲酣化酶活力测定方法的研究报道不多国内缺乏统一的标准为此我们开展了系列试验现将大曲醋化酶活力的几项影响因素的对比试验结果报道于后一试验材料醋化酶来源及种类①大曲取贮存一个月的浓香型大曲除去左右的曲皮后粉碎曲心作供试验大曲②红曲霉选用本所从大曲中分离的一红曲霉菌株在鼓皮上恒温培养天后烘干供试验用药品仪器己酸分析纯乳酸分析纯乙醇分析纯,三角瓶气相色谱仪医用离心机二试验方法试验设计选用”正交表将测定醋化酶活力的参数一一乙醇浓度酉旨化时间和温度进行固定而对重要参数酸的组成酶的种类和提取手段等个因素进行了个处理个水平次重复的正交对比试验各因素的水平设置见表正交表表头设计见表表试验因案及其水平乙醉溶液每个为一处理按‘”正交
试验
的
设
计要求加入己酸和乳酸接入红曲霉或大曲
恒温醋化天再分别加入无水乙醇摇匀后
静
置这时溶液中乙醇浓度在度左右
醋类物质
可以均匀地溶解在液体中再按设计要
求
的手段提
取
其中醋蒸馏是当蒸馏液达到时终止
离心条件
为转分分钟最后进行气相色谱分析
三
试验结果及分析
从己酸乙醋的测定结果
表看处理问差异较
明显处理的已酸乙醋含量分别
为
以处理最高即
的己酸接种红曲霉离心后测定己酸乙醋含量最高
以处理最低即
己
酸十乳酸
接种曲药
醋化离心后测定已酸乙醋含量最低处理间的差异
造成的原因从极差值看因素影响最大然
后
是因素和因素从各因素的不同水
平
看在
不
考
虑
各因素互作的情况下红曲霉的醋化能力
比
大
曲
强
倍多因素中
己酸与己
酸乳酸
这两个水平相比较也是倍多
而因
素中离心后
测
定
值比蒸馏大倍
表
正
交试验己酸乙醋测定
结果统计
黯
酸的组成酶的种类提取手
段
己酸红曲霉离
心
己酸
乳酸酸
大曲
蒸馏馏
’
号雪己酸
乙
醋
处
理
号
】
二
工
表
正
交表表头
设
计
认
穿
巡
竺
彗
雪
试验条件及
步
骤
在个三角瓶中分别加入的四讨论在测定大曲醋化酶活力过程中单一己酸与混合酸的作用效果不一样当单一己酸为时与混合酸已酸乳酸各相比己酸乙醋的含量不是随底物酸浓度减少而减少加入混合酸的处理中色谱分析过程中有异常峰出现但跟乳酸乙醋的出峰时间不一致无法定性和定量还有待于研究离心后直接测定醋的方法较简单己酸乙醋含量值比蒸馏大倍多但溶液中可溶性糖对气相色谱柱有
污
染
酶活力的测定130304
b、如果溶液已显色，则可通过改变比色皿的厚 度来调节吸光度大小
c、选择适当的参比溶液
4．制作标准曲线
OD
0.80
ODx
0.60
c1 c2 c3 c4
0.40
0.20
0.00
0
1.0 2.0
ODx cx cx
3.0 4.0 c(mmol/L)
2．配制系列浓度的酪氨酸标准溶液
管号
0 1 2 3 4 5 6
酪氨酸浓度 （μg/ml）
0 10 20 30 40 50 60
加 100μg/ml 酪氨酸的量 加蒸馏水的量
（ml）
（ml）
0
10
1
9
2
8
3
7
4
6
5
5
6
4
用 5 或 10ml 刻度移液管移取
操作解释
为什么酪氨酸要干燥至恒重？ 为什么酪氨酸要称准至0.1000g？ 为什么酪氨酸用盐酸溶解？
三、试剂
10﹪ CL3CCOOH溶液 0.55 mol/L 碳酸钠溶液 0.5 mol/L NaOH溶液 0.1 mol/L HCL溶液 缓冲溶液 福林试剂 显色剂 一种杂多酸
磷钼酸 H3[P(Mo3O10)4] 磷钨酸 H3[P(W3O10)4]
福林试剂的配制
Na2WO4·2H2O 100g
Na2MoO4·2H2O 25g
磷酸: pKa1 = 2.12 pKa2 =7.21 pKa3 = 12.67
Ka1 = 7.52×10-3 Ka2 = 6.23×10-8 Ka3 = 2.2×10-8
（3）硼砂—氢氧化钠缓冲溶液 （pH=10，2709酶）
酶活力测定讲解
2019/5/10
20
２.试剂 ? Folin- 酚试剂见“蛋白质含量测定”。 ? 0.4mol/L 碳酸钠溶液。 ? 0.4mol/L 三氯乙酸溶液。 ? 缓冲溶液
①PH7.5 磷酸缓冲液，适用于中性蛋白酶。 ②pH3.0 乳酸缓冲液，适用于酸性蛋白酶。 ③pH10.5 硼酸缓冲溶液，适用于碱性蛋白酶。
取两个100ml三角瓶分别于空白瓶和样品瓶中各加底物溶液4ml和磷酸缓冲液5ml于空白瓶加入95乙醇15ml40水浴预热5min然后在两瓶中各加待测酶液1ml立即混匀计时40水浴中准确反应15min在样品瓶中立即补加95乙醇15ml终止反应取出于空白瓶和样品瓶中各加酚酞指示液005mollnaoh标准溶液滴定直至微红并保持30s不退为其终点记录消耗005mollnaoh标准溶液的体积201951035计算酶活力定义
上述各种缓冲溶液，均须用 pH计校正。
2019/5/10
21
10g/L 酪蛋白溶液：称取酪蛋白 1.000g ，准确至 0.001g ，用少量 0.5mol/L NaOH 溶液（若酸性 蛋白酶则用浓乳酸 2～3滴）湿润后，加入适量 的各种适宜 pH 的缓冲溶液约 80mL ，在沸水浴 中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转 入100mL 容量瓶中，用适宜的 pH 缓冲溶液稀 释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为 3d 。
１.原理 α-淀粉酶水解淀粉为小相对分子质量的
糊精和少量的麦牙糖及葡萄糖，使淀粉 与碘呈蓝紫色反映逐渐变红棕色直至消 失，观察并测定颜色的消失速度可以衡 量酶活力的大小。
2019/5/10
8
２.试剂 原碘液：同“分光光度法”。 稀碘液：同“分光光度法”。
20g/L 可溶性淀粉溶液：同“分光光度法”
固体曲糖化酶活力的测定
固体曲糖化酶活力的测定实验原理：1.固体曲在酿造过程中将原料淀粉转化为可发酵糖类的重要酶源。
其中其主要作用的是糖化酶，它可将淀粉水解为葡萄糖供微生物发酵，生成酒精及其它各种相应的白酒成分。
固体曲质量好，糖化活力高，原料淀粉利用率高，出酒率也高。
故糖化酶活力的高低是衡量固体曲质量的重要指标。
2.固体曲糖化酶活力定义为：1g绝干固体曲，在30℃、PH=4.6条件下，1h内水解可溶性淀粉为葡萄糖的毫克数。
其测定的方法可用修正的蓝-艾农法.实验试剂：1. 斐林试剂2. 0.1%葡萄糖标准溶液（准确称取1g无水葡萄糖(预先烘干)，用水溶解，加5ml浓盐酸，用水稀释至1000ml3. 乙酸-乙酸钠缓冲溶液（PH=4.6）4. 0.01mol/L NaOH溶液称取4g NaOH ,用水溶解并稀释至1000ml5. 2%可溶性淀粉溶液准确称取2g可溶性淀粉（预先于100～105℃烘干），加少量水调匀，倾入80ml沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水稀释至100ml.实验步骤：1. 5%固体曲沁出液的提取 称取5.6702g 固体曲（以绝干曲计），置于250ml 烧杯中，加入90ml 水和10ml,PH=4.6的缓冲溶液，摇匀，于30℃水浴中保温沁取1h ，每隔15min 搅拌一次，有脱脂棉过滤，滤液为5%固体曲沁出液。
2. 固体曲糖化液的制备 吸取25ml 2%可溶性淀粉溶液，置于50ml 容量瓶中，于30℃水浴中预热10min.准确加入5ml 5%固体曲沁出液，摇匀，立即计时。
于30℃水浴中准确保温1h 。
迅速加入15ml 0.1mol/LNaOH 溶液，终止酶解反应。
冷却至室温，用水定容至刻度。
同时制作一空白液：准确吸取25ml 2%可溶性淀粉溶液，置于50ml 容量瓶中，先加入15ml 0.1mol/LNaOH 溶液，然后准确加入5ml 空白液，用水定容至刻度。
3. 测定 吸取斐林甲液、乙液各5ml ，置于锥形瓶中，准确加入5ml 空白液，并用滴定管预先加入适量的0.1%葡萄糖标准溶液（使后滴定时消耗0.1%葡萄糖标液在1ml 以内，且在1min 时间以内），摇匀，于电炉上加热至沸腾，立即用0.1%葡萄糖标准溶液滴定至蓝色消失，此次滴定操作需在1min 内完成。
酶活力测定
华南农业大学综合实验报告实验项目名称：食品发酵工业中常用系列酶活力测定实验项目性质：综合性实验计划学时：6所属课程名称：食品与发酵工业分析班级：09生物工程2班******学号：************实验课指导老师：沈玉栋摘要测定食品发酵工业中常用酶活力，对于选择酶种类，工艺条件的制定等有重要意义。
本次实验中对工业常用系列酶——糖化酶，淀粉酶，蛋白酶进行了酶活力测定。
其中，测定糖化酶采用直接滴定法，测定淀粉酶采用目测比色法，测定蛋白酶采用福林酚法。
关键词：酶活力糖化酶淀粉酶蛋白酶直接滴定法目测比色法福林酚法1 前言酶，从早期的酿造、发酵食品开始，至今已广泛应用到各种食品上。
随着生物科技进展，不断研究、开发出新的酶制剂，已成为当今新的食品原料开发、品质改良、工艺改造的重要环节。
目前已有几十种酶成功地用于食品工业。
例如，葡萄糖、饴糖、果葡糖浆的生产、蛋白质制品加工、果蔬加工、食品保鲜以及改善食品的品质与风味等。
应用的酶制剂主要有：淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶等。
酶作为生物体内的一种具有催化活性的蛋白质，生物体内几乎所有的反应都离不开没的催化。
作为生物体内的催化剂，催化效率——即酶的活力是酶的一个重要的的指标。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。
因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。
糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶、γ-淀粉酶。
它能把淀粉从非还原性未端水介a-1，4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1，6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。
酶活力测定的原理和方法
B 电化学法
• 很多不同类型的电化学法已用于酶反应测定中， 最重要之一是电位计技术。其基本原理是溶液 的电势取决于被测物的浓度和性质，采用这一 原理制成的离子选择性电极，如pH电极可测定 酶反应过程中反应液pH值的变化，从而得知参 与反应的酶的活力。
C 量气法
• 在酶反应中底物或产物之一为气体时，可以通 过测量反应系统中气相的体积或压力的改变， 计算出气体释放或吸收的量。根据气体变化和 时间的关系，即可求得酶反应速度。最常用的 气 体 测 量 仪 为 瓦 （ 勃 ） 氏 测 压 仪 （ Warburg manometric apparatus ）。用测压仪测定酶活 力的优点是可以连续取得读数，以了解整个酶 反应的过程，缺点是灵敏度低。准确程度都较 光谱吸收法低。
2、偶联的连续法
• 偶联的连续法就是将指示酶直接加到待 测酶反应系统中，将其产物直接或间接 转变成一个可用光谱吸收仪检测的化合 物。连续的偶联反应必须在酶反应相同 条件（ pH ，温度等）下进行，且加入的 指示酶，以及其他各种物质不能干扰原 来的酶活力。
四、酶分析的自动化
• 所谓酶分析的自动化是指从加样，启动 反应，检测、数据记录及结果处理等整 个过程都由仪器自动操作。自动分析技
D 量热法
• 由于在反应过程中有反应热的变化，用 非常灵敏的量热计可以测定酶反应速度。
该法灵敏，无干扰，且很通用，近年来
逐渐引起了人们的重视。
E 旋光法
• 在某些酶催化的反应中，底物和产物的旋光有 所不同，这时就可以根据旋光的变化来跟踪酶 反应过程。在某些情况下，可通过形成络合物 来提高旋光度。如乳酸与钼酸盐反应形成高比 旋络合物，故可用旋光计跟踪 LDH 催化的乳酸 和丙酸之间的转换。然而，在通常情况下，由 于该法与其它方法相比灵敏度低，因而很少采 用
第一节酶的制备及活力测定
第一节酶的制备及活力测定第一节酶的制备及活力测定【课标要求】研究酶的存在和简单制作方法，尝试利用酶活力测定的一般原理和方法。
【知识梳理】背景知识 1、酶在活细胞内合成，在细胞内起催化作用，称为________。
1、生物细胞产生的酶2、由细胞内产生然后分泌到细胞外发挥作用，称为________。
1、提取胞内酶，需要破碎________，可用破碎仪、研磨器或匀浆机2、提取酶的方法使酶从中释放出来，进入细胞外的溶液中，经过滤、离心制备成________。
2、提取胞外酶，可直接从________________________中提取。
在酶的提取过程中，________、________等多种环境条件都可能影响酶的空间结构导致酶变性直至丧失活力。
因而，提取出的酶首先需要检测酶的________。
（1）定义：通常以单位时间内________或者单位时间内________ 3、酶的活力（2）测定方法：________和________ 实践案例：植物淀粉酶的制备及活力测定材料器具：略活动程序：1、提取酶液2、滴加酶液：取4支试管编号后均加入ph=5.6的________________缓冲溶液。
向1、2试管中各加入未煮过的________ 1ml 向3、4试管中各加入已煮过的________ 1ml3、恒温处理：为什么要进行恒温40°c处理？答：保证酶在________温度下充分发生反应。
4、钝化处理：钝化处理的原因？答：使酶的活性________，从而使反应减慢或停止。
5、测定吸光值：用分光光度计在波长________处进行比色。
6、绘制标准曲线7、结果分析：（1）从标准曲线中查出________。
（2）计算淀粉酶的活力。
探究活动：1、制备过氧化氢酶粗酶液以新鲜________、________________为材料经过粉碎、研磨、离心，取________即可得到过氧化氢酶粗酶液。
2、用分光光度法测定过氧化氢酶的活力在过氧化氢酶存在时，过氧化氢将愈创木酚氧化生成________色产物，这种产物在波长470 nm处有最大吸收峰，通过测定________可以计算出过氧化氢酶的活力。
酶活力
1398酶活力的测定
实验目的
学习酶活力测定的原理
掌握1398酶活力测定的实验方法
酶活力
取1ml定容至50ml
过滤
40℃保温15分钟
实验方法
酶液 TCA 酪蛋白 TCA
1 1ml 2ml 1ml
2 1ml 1ml 40 ℃ ，pH7.5，10min 2ml 40 ℃ ，10min，过滤
3 1ml 1ml 2ml
滤液
Na2CO3 福林试剂
1ml
5ml 1ml
1ml
5ml 1ml
1ml
5ml 1ml
1 1ml 2ml 1ml
2 1ml 1ml 40 ℃ ，pH7.5，10min 2ml 40 ℃ ，10min，过滤
3 1ml 1ml 2ml
滤液
Na2CO3 福林试剂
1ml
5ml 1ml
1ml
5ml 1ml
1ml
5ml 1ml
40 ℃ ，20min，显色
OD650nm
实验方法
酶液的准备
称1398蛋白酶1g 倒入小烧杯中，加 入少量PBS缓冲液 用匀浆器磨碎
作用温度：35 - 45 ℃ 作用 PH：6.5 - 7.5
ห้องสมุดไป่ตู้
实验原理
1398酶活力越大，水解底物酪蛋白生成的产物酪氨酸 含量越多；
福林试剂内含有磷钼酸和磷钨酸，在碱性条件下不稳 定，可被水解出来的酪氨酸还原生成钼蓝和钨蓝的蓝色 物质，从蓝色的深浅通过比色可判断酪氨酸的多少，从 而推断酶活力的大小。
第6章酶化学 第五节 酶的活力测定
第六章 酶化学
• 第一节 概述 • 第二节 酶的命名和分类 • 第三节 酶催化反应的机理 • 第四节 影响酶促反应速率的因素——酶促反应动力学 • 第五节 酶的活力测定 • 第六节 食品工业中重要的酶及其应用
食品生物化学
学习目标
1.掌握酶的化学本质及作用特点。 2.了解酶的命名及分类。 3.掌握酶催化反应的机理。 4.掌握温度、pH、酶浓度、底物浓度、竞争性抑制、非竞 性抑制物及激活剂对酶促反应速率的影响。 5.掌握酶活力的概念及测定酶活力的方法。 6.熟悉食品工业中重要的酶及其应用，了解固定化酶。
食品生物化学
第五节 酶的活力测定
一、酶的活力和活力单位
1．酶活力
通常用单位时间内酶催化某一化学反应的能力来表示酶的 催化能力，即用酶活力大小来表示酶的催化能力。酶活力的大 小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表 示，两者呈线性关系。酶催化的反应速率愈大，酶的活力愈高； 反应速率愈小，酶的活力就愈低。所以测定酶的活力就是测定 酶促反应的速率。由于酶催化某一反应的速度受多种因素限制， 故一般规定在某一条件下(恒温、使用缓冲溶液)用反应速率的 初速率来表示酶活力。
60 20 2% 1 1000 4800单位/ 克酶制剂
10
0.5
2．测定一定时间内所起的化学反应量
这是酶活力测定的主要方式，用测定反应量来计算酶活力。 主要是根据在一定条件下，酶反应速率与酶浓度成正比，测定 反应速率就可求出酶的浓度。
食品生物化学
测定结果的正确与否，即能否真实地反映酶活力，是和酶 反应的条件是否适宜密切有关。适宜的条件是使所有的酶分子 都能正常地发挥作用，反应条件中应使酶浓度是影响反应速率 的唯一因素，而其他条件如pH和温度应保持最适水平。此外测 定用的底物应当使用足够高的浓度，使酶催化的反应速率不受 底物浓度的限制。为了测定简便，选用的底物最好在物理或化 学性质上和产物有所区别。
酶活力测定的原理和方法
• 3、甲醛滴定法：用蛋白酶水解蛋白质生 成氨基酸。再用甲醛固定氨基酸的氨基， 用0.1N NaOH滴定生成的氨基酸的量，从 而测定酶活力。
• 4、DHT—酪蛋白法：用5-氨基四唑重氮盐将酪 蛋白中部分组氨酸和酷氨酸重氮化，得到黄色 的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。以 DHT-酪蛋白为底物，在蛋白酶作用下，水解生 成DHT-肽。二价镍离子可与DHT-蛋白及DHT-肽 形成稳定的可溶性红色螯合物，而锌离子可迅 速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。选用合 适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂， 利用比色法可测定蛋白酶活力。
2、偶联的连续法
• 偶联的连续法就是将指示酶直接加到待 测酶反应系统中，将其产物直接或间接 转变成一个可用光谱吸收仪检测的化合 物。连续的偶联反应必须在酶反应相同 条件（ pH ，温度等）下进行，且加入的 指示酶，以及其他各种物质不能干扰原 来的酶活力。
四、酶分析的自动化
• 所谓酶分析的自动化是指从加样，启动 反应，检测、数据记录及结果处理等整 个过程都由仪器自动操作。自动分析技
十、胰蛋白酶的活力测定
• 测定时，取底物溶液3.0mL，加盐酸 （0.001mol/L）0.2mL混匀，作为空白。取供 试品溶液0.2mL与底物溶液（预热至25±0.5℃） 3.0mL，立即计时并摇匀，使比色池内的温度 保持在25±0.5℃，在253nm波长处，每隔30s 读吸收度，共5min。以吸收度为纵坐标，时间 为横坐标作图，取在3min内成直线部分的吸收 度计算分析。
• 1、福林—酚法：蛋白酶催化蛋白质水解 生成氨基酸。其中含酚基的氨基酸(酪氨 酸、色氨酸等)与福林—酚试剂反应，生
成蓝色复合物。蓝色深浅与含酚氨基酸
的量成正比，从而测定其活力。
各种酶活力测定方法及注意事项
各种酶活⼒测定⽅法及注意事项碱性蛋⽩酶及各种蛋⽩酶活⼒测定⽅法及测定有感因长期测定碱性蛋⽩酶酶活⼒与⾓蛋⽩酶活⼒与胶原酶活⼒和弹性蛋⽩酶活⼒，碱性蛋⽩酶活⼒测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可⼤⼤减少误差。
其余酶活⼒测定过程中因⽆统⼀标准且底物差异⼤，导致长期酶活⼒测定的混乱，各种酶活⼒测定⽅法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活⼒只能仅作参考。
以下是各种蛋⽩酶活⼒测定⽅法及标曲绘制：碱性蛋⽩酶测定⽅法根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋⽩酶活⼒测定福林法以下是⽅法碱性蛋⽩酶的测定⽅法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进⾏，即 1 个酶活⼒单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min ⽔解酪蛋⽩产⽣ 1 µg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。
2.2.6.1 标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。
表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form管号酪氨酸标准溶液的浓度/（µg/mL）取 100 µg/mL 酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取⽔的体积/（mL）0 0 0 101 10 1 92 20 2 83 30 3 74 40 4 65 50 5 5（2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使⽤液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃⽔浴锅中显⾊ 20 min，⽤分光光度计于波长 680 nm，10mm ⽐⾊⽫，以不含酪氨酸的反应管作为空⽩，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。
图 2-1 L-酪氨酸标准曲线Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve根据作图或⽤回归⽅程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（µg），既为吸光度常数 K 值。