管碟法测定抗生素效价演示文稿
抗生素效价的测定ppt课件
continue
依次求出6个不同浓度梯度的标准溶液对应 的校正后抑菌圈直径大小。 d1= d0.4-a1； d3= d0.8-a3 d5= d1.2-a5 d2= d0.6-a2 d4= d1.0-a4 d6= d1.4-a6
标准曲线
．
d6 抑菌圈直径d
抗 生 素 浓 度 C
C6
．
C5
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例如：6组中1U/mL标准品54个抑菌圈直 径总平均值为22.6mm，而0.4U/mL(第 一组）的一组中9个1U/mL标准品抑菌圈 直径的平均值为22.4mm，则第一组的矫 正值为22.6-22.4=0.2。 如果第一组9个0.4U/mL标准品抑菌圈直 径的平均值为18.6mm，则第一组抑菌圈 直径校正后为18.6+0.2=18.8mm。
抗生素效价：用抗生素效价单位表示，反映抗生 素的活性。 抗生素效价单位：每毫升或每毫克中含有某种抗 生素的有效成分的多少，用单位U或ug表示。
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一、微生物检定法
1、原理 以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为 指标来衡量抗生素效价的方法。 量反应平行原理： 在实验所用的剂量范围内，对数剂量和 反应呈直线关系，供试品和标准品的直 线应平行。
稀释法 比浊法 管碟琼脂扩散法（中国）
管碟琼脂扩散法
利用抗生素在涂布特定试验菌 的固定培养基内呈球形扩散，形成 含一定浓度的抗生素球形区，抑制 了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑 菌圈。 通过比较标准品与供试品产生 抑菌圈的大小来测定供试品的效价。
2、测 定 方 法
（1）青霉素发酵液样品溶液的制备
抗生素微生物检定管碟法在中国药典2005版的应用及操作要点
抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。
各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。
管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。
管碟法的操作步骤：1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。
2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。
4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。
5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。
6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。
7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。
8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。
微生物学实验七 链霉素发酵及管碟法测定生物效价微生物发酵
实验七 链霉素发酵及管碟法测定生物效价微生物发酵（一）目的要求了解抗生素发酵的基本过程。
了解管碟法测定抗生素生物效价的基本原理。
学会管碟法测定抗生素效价方法，并学习抗生素发酵过程一些重要生理生化指标分析。
（二）基本原理链霉素是由灰色链霉菌(放线菌的一种)产生的一种氨基糖苷类抗生素，它既含有氨基糖苷，也含有氨基环醇的结构，属抗革兰氏阴性菌的抗生素。
抗生素液体发酵共分三大工序：菌种、发酵、提炼。
配合三个工序还有分析化验和有关产物测定。
菌种种子质量指标：无杂菌，全部形成孢子，摇瓶发酵效价达35000U/ml 以上(30℃，48 h 培养)，方可用于生产。
发酵抗生素发酵过程除需经常镜检排除杂菌污染外，接种12h 后，每2h 进行一次pH 、生物量、总糖、还原糖、氨基氮及抗生素效价测定。
一级种子质量指标：无杂菌，全部放线菌，菌丝粗壮整齐，无断裂；pH7.0~7.2。
二级发酵质量指标：菌丝粗壮整齐，无断裂，菌丝成网状；pH7.2；链霉素效价10000～35000U/ml 。
提炼砂子孢子 (4℃±1℃冰箱保存) 第一代孢子(28℃高氏1号培养基，培养5d) 第二代孢子 (28℃高氏1号培养基，培养5d) 种子罐发酵(一级，种子培养基) 30℃±2℃培养12~16h 发酵罐发酵(二级，发酵培养基) 28~30℃，培养48h 放罐 中和、氧化、过滤 发酵液 草酸酸化 板框压滤 滤液 加NaOH 中和 板框压滤 中和滤液 上离子交换柱 板框压滤 饱和树脂 1 mol/L H 2SO 4 解 吸 解吸液 中和氧化滤液 加氨水沉淀 离心甩干，洗去氨 链霉素游离碱 (白色沉淀) 加6 mol/L H 2SO 4调pH 6.0~6.5，溶解 加NaOH 及KMnO 4 链霉素硫酸盐喷雾干燥 白色粉末(成品)衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。
抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。
生物效价测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。
抗生素效价
用管碟法（2.2）法，测定链霉素活菌剂的效价，估计效价为1 000 000 u/g，供试品最终浓度为1.4u/ml 及0.7u/ml。
链霉素的效价测定抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效性）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
第一法管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
菌悬液的制备枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液取枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85％以上。
用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)悬液取短小芽孢杆菌［CMCC(B)63202］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液取藤黄微球菌［CMCC（B）28001］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面,用培养基Ⅲ或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）悬液取大肠杆菌［CMCC（B）44103］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
管碟法
管碟法测定生物效价
衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。
抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。
抗生素生物检定法是利用抗生素对细菌（或真菌）的杀死或抑制的程度，作为客观指标来衡量维生素中有效成分的效力的一种方法。
此法检测灵敏性高，由微量抗生素即可检出（0.5u/ml）。
因此，微生物检定法被作测定抗生素效价的一种经典方法。
生物效价测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。
管碟法是扩散法的一种。
本实验采用管碟法测定抗生素的效价。
管碟法就是利用有一定体积的不锈钢制的小管（牛津杯），将抗生素溶液装满小杯，在含有敏感试验菌的琼脂培养基上进行扩散渗透，经过一定时间后，抗生素扩散到适当的范围，产生透明的抑菌圈。
抑菌圈的半径与抗生素在管中的总量(单位)、抗生素的扩散系数(cm2/h)、扩散时间(即抗生素溶液注入钢管至出现抑菌圈所需的时间)、培养基的厚度(mm)和最低抑菌浓度(u/ml)等因素有关。
抗生素总量的对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。
因此，抗生素效价可以由抑菌圈的大小来衡量。
将已知效价的土霉素标准液先制成标准曲线，比较已知效价标准液与未知效价的被检品溶液的抑菌圈的大小，就可算出样品中抗生素的效价。
抗生素效价的测定ppt课件22页文档
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
39、没有时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
抗生素的测定
抗生素效价的生物测定一、目的要求学习了解抗生素效价的生物测定（管碟法）的基本原理和方法。
二、基本原理某些微生物在代谢过程中所产生的次级代谢产物能在低浓度的情况下抑制或杀死某些微生物，这种物质称为抗生素。
抗生素效价的生物测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。
管碟法是扩散法中的一种，本法是利用抗生素在琼脂培养基的扩散渗透作用，将已知浓度的标准溶液与未知浓度的样品溶液在含有敏感性试验菌的琼脂表面进行扩散渗透，比较两者对被试菌的抑菌作用，求出抑菌圈的大小，以测定抗生素的浓度。
在一定范围内，浓度与抑菌圈直径在双周半对数表上（浓度为对数值，抑菌圈直径为数字值）成直线函数的关系，由此绘制成标准曲线，从样品的抑菌圈大小可在标准曲线上求得其效价。
由于本法是利用抗生素抑制敏感细菌的特点，所以符合临床使用的实际情况，而且灵敏度也很高，不需特殊设备，故一般实验室及生产上多采用此法。
但此法也有缺点，即操作步骤多，手续繁杂，培养时间长、得出结果慢。
尽管如此，由于它有上述的独特优点而被世界各国所公认，成为国际通用的方法被列入各国药典法规的范围内。
本实验以龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）产生的土霉素效价测定为例。
三、器材黄色八叠球菌（Sarcina flava）；（土霉素效价测定用）培养基，（供培养试验菌用）培养基Ⅰ，（供摊布双碟的上、下层用）培养基Ⅱ；培养皿，牛津杯（或不锈小钢管），陶瓦圆盖，50ml、250ml、1000ml容量瓶， 0．1mol/LHCl，土霉素标准品等。
四、操作步骤1．pH6．0磷酸缓冲液的配制准确称取KH2PO40．8g和K2HPO40．2g，置100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，灭菌备用。
2．标准土霉素溶液的配制精确称取20mg土霉素标准品，每毫克含880单位（880r/mg），先用0．1mol/LHCl溶解（按称量每10mg加酸1ml），然后加入无菌蒸馏水稀释成每毫升含1000单位（1000r/ml）的溶液，此液在5℃以下保存。
【抗生素精品课件】抗生素微生物检定法
悬液 的制
方法
备
⑤供试品溶 液的制备
④标准品溶 液的制备
学习目标 复习提问
类别 实验菌 培养基 PH
链、卡 枯草芽胞杆 Ⅰ
7.8-
庆、红 菌
8.0
新课大纲 新课内容 本课小结
四、土 滕黄八叠球 Ⅱ 氯、林 菌
6.56.6
课后习题
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容
牛肉浸 酵母浸 出粉 1.5g 出粉3g 胨5g
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
三、管碟法
T2
S1
S2
T1
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
1.理论依据：
• 扩散现象：由球面扩散动力学公式表 示
• 相当于直线方程：y=bX+c • 抗生素总量的对数值与所形成抑菌圈
直径的大小呈直线关系，来测定抗生 素抗菌活性。
2.影响因素?
学习目标
Ⅰ超净工作台
复习提问 Ⅱ抑菌圈测量仪
新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
Ⅲ双碟 Ⅳ陶瓦盖 Ⅴ钢管
Ⅻ试验菌
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
• 管碟法分为三种方法 一剂量法又称 标准曲线法，常用于原料生产的过程 监控、中间体或半成品检验；二剂量 法是抗生素质量检验的常规方法；三 剂量法主要用于标准品的标定。中国 兽药典（2005年版）收载了二剂量法 和三剂量法。
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题