[原创]水蛭素提取工艺

2014分离工程方向课程设计题目

水蛭素

水蛭素(hirudin)是水蛭(Leech)及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65—66个氨基酸组成的小分子蛋白质(多肽)。水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。

概述

作用

动物试验与临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现象。此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子;而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗凝血酶III往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭会有较好的效果。应用

水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗;也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成;改善体外血液循环和血液透析过程。在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。研究还表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。它能阻止肿瘤细胞的转移，已证明有疗效的肿瘤如纤维肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，

黑素瘤和白血病等。水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血流而增强疗效。

动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素均无明显毒副作用，无论急性、亚急性的毒性试验，对血压、心率、血相、出血时间和血液化学成分均不受影响，呼吸系统也没有影响，无过敏反应，一般无特异抗体发现。半致死剂量LD50>50mgAg，远大于治疗所用的剂量(1mgAg)。尤其值得指出的是，水蛭素可以口服，这给用药带来很大方便。水蛭素比较稳定，胰蛋白酶和糜蛋白酶并不破坏其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝

血酶的作用，这就可以解释为何口服中药水蛭提取液仍然有疗效的原理。

近年来在我国以水蛭素为主要成分的中成药已有许多种，如抗血栓片、活血通胶囊等，其年产值达数千万元。含水蛭的新药也在不断研究和推出。利用基因工程生产重组水蛭类多肽药物，以取代水蛭素或作为抗凝化瘀药的添加成分，这在近期内就可实现。作为注射剂用于心血管系统疾病和肿瘤治疗药物，则还需要进一步的临床研究。毋庸置疑，重组水蛭素类多肽药物的开发将会带来巨大的社会效益和经济效益。重组

由于水蛭素具有重要开发价值，而水蛭的来源有限，故国内外医药界均着重研究通过基因工程获得重组水蛭素。1986年后，重组水蛭素已在大肠杆菌和酶母中分别表达成功，与天然水蛭素相比，重组水蛭素在第63位氨基酸(酪氨酸)上未硫酸酪化，活性略低，其余性质基本相同。在治疗的剂量下静脉注射无毒副反应。现国外一些大的生物技术公司对水蛭素己进入多方面的临床研究。有关水蛭素类多肽的专利，每年公布的数量至少在十多项以上，包括水蛭素类似的多肽，研究论文每年总在数十篇以上。1998年底重组水蛭素药物在德国正式上市，1999年英国批准上市，己注册的国家有美国、欧洲、澳大利亚、新西兰、南非等I0多个国家。

水蛭素在使用过程中血清半衰期太短，难以发挥抗栓效果。美国一研究机构将水蛭素与PEG一起加工成为耦合体制剂后可大大延长水蛭素的血清半衰期从而提高其在体内的抗血栓生成效果。

研究

我们对重组水蛭素基因工程作了大量系统的研究，具有坚实的技术基础。我们从国内养殖的医用水蛭中克隆出水蛭素的cDNA进行测序，并合成了大肠杆菌偏爱密码子的水蛭素基因，构建了分泌型大肠杆菌表达载体，优化表达条件，获得高效表达，产物直接分泌至跑外，大大简化了下游工程。我们根据水蛭素的特性，设计了适合大规模生产的低成本的分离纯化新工艺，无需高效液相层析或反相层析，只经三步纯化，即获得电泳纯的产品。目前我们得到水蛭素的表达量、纯度和得率均达到国际先进水平。前景

心血管系统疾病和肿瘤是主要危害人类健康的两大类病害，防治这两大类疾病的药物是新药研制的重点。水蛭在破血、逐瘀、通经、消症等方面的疗效已为我国数千年中医实践所证明，重组水蛭素在抗凝消栓以及配合肿瘤化疗和放疗上的作用也为国外临床所证明。注射针剂的要求较高，目前在临床主要用于抗深静脉血栓。而作为口服药剂在短期内即可取得经济和社会效益。将重组水蛭素类多肽药物取代水蛭或作为中成药的添加成分，估计至少可获得上亿元的经济效益。随着临床试验的扩大，它将可以用于更多的疾病的防治，发展前景十分广阔。

比较

表达水平，纯化工艺，产品质量与国外水平相当，某些技术指标超过国外，成本比国外低。在美国，药用重组水蛭素每毫克6美元。我国生产的成本低，如果每毫克降至人民币6元，广大患者就有可能承受得起。国外重组水蛭素都采用针剂，我们正在研制口服剂型，口服无疑更易被病人接受，成本也可更多降低。尤其是它可以拓宽使用的范围，用于各种血栓病的防治，或作为有关药物的主要成分或添加成分，可开发更大的市场。分析

在医药市场上，抗栓药物的需求与日俱增，但由于天然水蛭来源有限，各国医药界都将注意力集中在重组水蛭素的开发上。美国、法国、瑞士、德国、英国、日本十多家生物技术公司

和医院都在临床应用或研究重组水蛭素类多肽抗栓药物治疗血栓疾病的范围和疗效。1998年底，德国首先上市重组水蛭素药物。1999年英国也获批准上市。目前己注册的国家有欧洲、美国、澳大利亚、新西兰、南非等十多个国家。中国具有心血管疾病药物和肿瘤药物的巨大市场，水蛭素又是传统中药，因此重组水蛭素开发前景十分看好。

据估计，我国目前血栓病人约有2000万人，如果其中l00万人采用水蛭素治疗，每年共需300—500公斤。

国际上常用肝素作为抗凝药物，这类抗凝药物的使用已有60多年历史，需用量逐年增加。美国70年代每年就有1000万病人使用肝素，大部分是手术后预防血栓的形成。仅美国肝素的年用量就超过9000亿单位，约相当于6吨。研究表明，水蛭素在许多性能上都优于肝素，它用药量小，不引起出血，也不依赖于内源性辅助因子。随着临床研究的广泛开展，重组水蛭素的应用范围不断拓宽，它的需求也会日益增大。

优点第一，水蛭素与水蛭肽抑制凝血酶的反应不需要抗凝血酶?(AT—?)作为辅助因子，使其抗凝作用与量效关系更吻合，而且可在缺乏抗凝血酶?的病人(如弥漫性血管内凝血)中使用。

第二，肝素不能灭活结和于血栓上的凝血酶。而水蛭素与水蛭肽则对循环中的和结合于血栓上的凝血酶都可以抑制。

第三，肝素会被激活的血小板释放的血小板因子4(PTF4)或富含组氨基酸的糖蛋白等结合，水蛭素与水蛭肽则不受这些因素的影响。

第四，水蛭素与水蛭肽用于抗血栓治疗，出血副作用较小，且无过敏反应和免疫原性无毒反应。

原理

天然水蛭素是由65或66个氨基酸残基组成的单链多肽,分子量约为7 000,能在极端的pH和热条件下稳定存在。水蛭素的形状类似蝌蚪,蝌蚪头部是多肽的N端,富含半胱氨酸(cys),

半胱氨酸间相互作用形成3个二硫键(Cys6-Cys14,Cys16-Cys28,Cys22-Cys39)。使N末端结构紧密;蝌蚪尾部是含有多个酸性氨基酸和一个被磺酸化的酪氨酸(Tyr63)的多肽C末端。凝血酶(thrombin)是血液凝固和止血过程中的中心酶,它不但能剪切纤维蛋白原,将纤维蛋白原转化为纤维蛋白;还能激活其它的凝固血液的酶类,如凝血因子?、?、??和抗凝血酶蛋白C(Fenton,1981)等。凝血酶与大分子底物的相互作用取决于三个不同的区域:催化反应位点的初级结合位C(Magnusen,1971),邻近催化位点的非极性结合位点AB(Brlinr and

Shen,1977;Sonder and Fenton,1984)和负责凝血酶与纤维蛋白原专一性作用的阴离子结合位点(识别位点)R(Fenton et al.1989;Henriksen and Mann,1988)。水蛭素的N端能封阻凝血酶的活性位点,其疏水结构域与凝血酶的非极性结合位点(AB)互补,该非极性结合位点靠近凝血酶的催化中心。水蛭素C末端有6个酸性氨酸,能与带正电的凝血酶识别位点形成许多离子键。N端、C端两个功能域以协同的方式结合到凝血酶上,在凝血酶的活性部位形成一个帽子,阻止底物的结合。

为了更好地了解水蛭素结构对性能的影响,人们对于水蛭素的N端、C端和各位点做了大量研究,得出许多结论,为水蛭肽的设计打了坚实的理论基础。各种研究表明水蛭素C末端的10个氨基酸是必需的最小结构,C末端的最佳大小至少是12个氨基酸(Hir54-65),在这一序列中每个氨基酸都非常重要。几个疏水残基和酸性残基对于维持水蛭素C末端的功能非常重要。

区别

1.水蛭素，主要是从吸血水蛭的唾液中分离提纯出来，具有抗凝,抗血栓功效的多肽物质,临床常用于多重血栓性疾病的治疗,可以消除血管阻塞,使血细胞解聚,血栓消散,促进微血管复通,改善微循环状态.目前,常用于调节血脂,消除脂肪肝,直接溶化血栓,消除动脉粥样硬化,防止中风和再次中风,激活人体自身的溶栓功能,避免再次产生溶栓等. 2.制水蛭是将水蛭洗干净,晾干,用滑石粉热炒,炒至水蛭鼓起,筛去滑石粉,粉碎,就得到水蛭药粉了,具有通经,破瘀消肿的功效,主要用于月经闭止,症瘕腹痛,蓄血,跌打损伤,淤血作痛,痈肿丹毒等症的治疗.

从上述水蛭素和水蛭的功效来看,显然水蛭素对中风的效果比制水蛭好.

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水蛭素的提取及含量测定

HEIL0NGJIANGMEDICINEANDPHARMACYAug.2010,Vo1.33No.4?87?

水蛭素的提取及含量测定

田丽华,刘娟,刘利成

(1.佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007;z.佳木斯大学生药学研究生,黑龙江佳木斯154007)

关键词:水蛭素;仿生诱导;凝血酶滴定

中图分类号;R284文献标识码:A文章编号:1008—0104(201O)04—0087—01

水蛭素是从水蛭中提取的一种酸性多肽,在临床上多用酶的分子表面有一个富含碱性氨基酸的纤维蛋白原识别位

于治疗不稳定性心绞痛(USA),急性心肌梗死(AM),血管形点(FRS).而水蛭索的C端含有较多的酸性氨基酸,可以结

成术,血液透析,体外循环,肾移植(CRRT),弥漫性血管内凝合在FRS上,阻止凝血酶与其底物血纤维蛋白原的相互作

血(DIC)等病症.用,从而达到抗凝血的目的.

天然水蛭索的分离与纯化主要包括从活体水蛭素和干2.2.2凝血酶滴定过程

水蛭中分离提取水蛭素.传统的水蛭素的获得是对水蛭的一

次性掠夺,而本实验采用诱导方法对活体水蛭素的提取,避

免了传统方法对水蛭的一次性掠夺,保护了水蛭的野生资

源,又带动了水蛭养殖业的发展.国内曾报道了一种能利用

水蛭反复吸血并用其嗉囊消化液为原料,既不杀死水蛭又能

提取批量水蛭素的方法.

水蛭素的含量测定方法有多种,如生物底色法,凝血酶

滴定法,光散射法,酶联免疫法吸附测定法,同位素标记示踪

法等.本实验采用凝血酶滴定法,1970年Markwardt报道了

凝血酶滴定法,其原理是根据水蛭素与凝血酶结合比例为1:

1(mol/mo1)和1:5(g/g).凝血酶的国际单位NIH,水蛭素的

活性以抗凝血酶活力单位ATU表示,一个AUT等于中和

一

个NIH凝血酶的水蛭索量.

1实验仪器,材料及试剂

本实验所用水蛭购于山东省济宁市,经佳木斯大学药学

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2014分离工程方向课程设计题目水蛭素水蛭素(hirudin)是水蛭（Leech）及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65—66个氨基酸组成的小分子蛋白质（多肽）。水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。概述

水蛭素(hirudin)是水蛭（Leech）及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著并且研

究得最多的一种成分，它是由65—66个氨基酸组成的小分子蛋白质（多肽）。水蛭素对

凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。

作用

动物试验与临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝

血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现象。此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞

的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依

赖于内源性辅助因子；而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗

凝血酶III往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭会有较好的效果。

应用

水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和

弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血

管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。在显微外科手术中常因为吻合

处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。研究还表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。它能阻止肿瘤细胞的转移，已证明有疗效的肿瘤如纤维肉瘤，骨肉瘤，血

管肉瘤，黑素瘤和白血病等。水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血

流而增强疗效。动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素均无明显毒副作用，无论急性、亚急性

的毒性试验，对血压、心率、血相、出血时间和血液化学成分均不受影响，呼吸系统也没

有影响，无过敏反应，一般无特异抗体发现。半致死剂量LD50>50mgAg，远大于治疗所

[原创]水蛭素提取工艺

2014分离工程方向课程设计题目

水蛭素

概述

作用

黑素瘤和白血病等。水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血流而增强疗效。

水蛭素的分离纯化研究进展

水蛭素（Hirudin）是水蛭唾液腺分泌物中的一种蛋白，是迄今为止发现的最强的天然凝血酶特效抑制剂，具有活血化淤的作用。但水蛭軀体中存在无抗凝活性的伪水蛭素组分和分泌物中大量成分复杂的物质，增加了水蛭素分离纯化难度；临床运用对生物制品的纯度要求高，世界各地很多科学家对水蛭素的提取和纯化做了许多相关的研究。本文对水蛭素分离纯化方法进行了综述，比较了多种方法的优势与不足，为其分离纯化工艺的进一步优化提供参考。

标签：水蛭素；分离；纯化；

水蛭是传统的中药材，早在《神农本草经》就有记载，具有破血、逐淤、通经的功效。水蛭中有效成分为水蛭素，是目前已知的一种高效的、特异的、最强的凝血酶抑制剂水蛭素具有抗凝血和溶解血栓的作用，在治疗心脑血管疾病、动脉粥样硬化、败血休克、高血压及缺少抗凝血酶Ⅲ因子的疾病等方面具有巨大的优越性和广阔的应用前景。

1水蛭素的理化性质

水蛭素干燥状态下稳定，室温下水中可稳定存在6个月，80℃下加热15min而不被破坏。PH值升高或降低均会导致稳定性下降，在0.1mol/L盐酸溶液或0.1mol/L氢氧化钠溶液中可稳定15min。水蛭素不能被胰蛋白酶水解，对α-糜蛋白酶也有一定的耐受性，其原因在于水蛭素存在一个由3个二硫键组成的不易被降解的N-端结构。但番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A则可使之失去活性。

2 水蛭素的分离与纯化

2.1. 天然水蛭素的分离与纯化。

天然水蛭素产生于水蛭的唾液里，水蛭吸血时被分泌出来。杨潼等使水蛭充分饥饿，采取一种特殊的技术从活体水蛭中提取唾液腺分泌物。黄仁槐等采取挤压的方法获取水蛭嗦囊内消化液。这些方式可以获得活性很高的粗体液，但是处理较为繁琐，效率很低。大多数研究均摘取水蛭头部进行匀浆处理，用丙酮、

乙醇或水提取。刘欣[1]等采用乙醇提取的方法，进行水蛭素提取，以水蛭素体积活力为指标，优化乙醇提取的条件。刘洋等利用丙酮对医用水蛭匀浆液进行提取水蛭素粗品[2]，张彬等采用盐浸提法、丙酮浸提法、醇浸提法进行粗提，结果表明，丙酮提取具有更高的得率[3]。丙酮沉淀法必须严格控制温度，否则很容易造成水蛭素失活。覃裕永[4]使用乙醇和丙酮分次提取，真空回收溶剂后合并滤液进行真空冷冻干燥，发明工艺简单、成本低廉，收率较高、产品质量好、保存期长。目前研究水蛭素分离纯化的方法很多，主要涉及到粗提纯和精制两个步骤。

水蛭素的制备工艺流程

答案：

水蛭素的制备工艺流程涉及多个步骤和技术，旨在从水蛭及其唾液腺中提取活性多肽，以及通过重组技术生产水蛭素。以下是水蛭素制备的主要工艺流程：

发现与分离：1884年，英国威尔士国家医学院的海克拉夫特博士首次发现医蛭咽部具有抗热的水溶性抗凝血物质。1904年，英国科学家雅各比成功地把这种抗凝血有效成分分离出来，并命名为“水蛭素”。

提取与纯化：水蛭素的提取和纯化过程包括使用特定的溶剂从水蛭及其唾液腺中提取水蛭素。这一过程可能涉及复杂的化学和生物化学方法，以确保提取的水蛭素保持其生物活性。

重组技术：随着生物技术的发展，重组水蛭素的制备成为可能。通过基因工程技术，可以在实验室中大量生产水蛭素。这种技术涉及将编码水蛭素的基因插入到适当的载体中，然后在适当的细胞系中进行表达，从而生产出水蛭素。

修饰与优化：为了延长半衰期、降低出血风险等，研究人员对水蛭素进行分子修饰。例如，通过特定的化学或酶法修饰水蛭素的某些部分，以改善其药理性质。

应用与临床：提取和重组的水蛭素被广泛应用于医药领域，特别是在心脑血管疾病的治疗中。它们作为凝血酶的天然特异抑制剂，具有抗凝、防栓的作用，且相比传统抗凝药物，水蛭素用量小、疗效高、不良反应少。

总之，水蛭素的制备工艺流程包括从自然来源中提取纯化、利用基因工程技术进行重组生产，以及对产品进行必要的修饰和优化，以满足医药领域的需求。

重组水蛭素

一、重组水蛭素的理化性质

1、天然水蛭素的结构

水蛭素是一种单链环肽化合物，由65个氨基酸残基组成，分子量7KD，N端有三个硫键，，分别在6～14位，16～28位和22～39位的半胱氨酸残基，使N端肽链绕迭成密集形核心环肽结构。N端的5个氨基酸残基为疏水基团，C端则为亲水基团，并游离在分子的表面。肽链中部还有一个特殊序列，不被蛋白酶所降解。素存在10种以上变异体，主要有3种变异体，简称为HVl、HV2和HV3。

2、重组水蛭素的结构

重组水蛭素除了63位Tyr残基上脱SO3－外，其他与天然水蛭素一样。

3、重组水蛭素的等电点：为3.9。

4、重组水蛭素的溶解性质

溶于水或吡啶，几乎不溶于醇、乙醚、丙酮或苯

5、重组水蛭素的稳定性

1）、水蛭素干燥状态下稳定；室温下水中可稳定存在6个月；80℃下加热15min不被破坏。

2）、pH值升高则稳定性下降，在0.1mol／L盐酸溶液或0.1m01／L氢氧化钠溶液中可稳定15min。

3）、水蛭素不被胰蛋白酶水解，对α－糜蛋白酶一定的耐受性；但番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A则可使之失去活性。

4）、描述了稳定的制剂处方重组水蛭素与二价金属离子(ca2+，zn2+或M矿+)形成性螯合物，在水中可稳定储存，用于静脉或皮下注射。

二、重组水蛭素的提取纯化工艺

1、发酵液经超滤、透析、离子交换层析，分离纯化目的蛋白

1.1 超滤与透析发酵液于5000rpm冷冻离心20min，离心上清液超滤(MWCO=30000)并收集透过液，加入蒸馏水重复超滤，合并透过液。透过液超滤浓缩（MWCO=3000），加入蒸馏水重复透析除盐，最终浓缩至所需体积，置于4℃冰箱保存备用。

1.2离子交换层析平衡缓冲液为PH3.0和PH5.0的甘氨酸缓冲液（50mmol/L），梯度洗脱缓

冲液为1/LNaCL(于50mmol/L的甘氨酸缓冲液中）。样品SP-Sepherose FF吸附并洗脱后，收集重组水蛭素活性峰，测定蛋白浓度和比活力。

星点设计—效应面优化法优选水蛭最佳提取工艺

目的：通过星点设计-效应面优化法优选水蛭最佳提取工艺，为提高水蛭有效成分提取提供实验依据。方法：通过文献检索、单因素试验确定水蛭提取工艺影响因素的考察范围，星点设计-效应面优化，确定最佳提取工艺参数。结果：最佳提取工艺参数为：提取时间为1.5h、加水量为10倍、醇沉浓度为50%、醇沉静置时间为20h。结论：通过星点设计-效应面优化法可以获取水提醇沉的最佳提取工艺。

标签：水蛭；提取；星点设计-效应面优化法

水蛭药用的临床需求不断增加，但天然水蛭素产量有限，遠不能满足需求。目前水蛭有效成分提取工艺多样，但易受多种因素影响，尚无一种理想的提取工艺。本文拟采用星点设计-效应面优化法探究该工艺的水蛭最佳提取条件，为研究和提纯水蛭抗凝血有效成分制剂的生产研究提供实验依据。

1 仪器与试药

PHS-25型pH计、分析天平、微量进样针、微量移液器、电热恒温水浴锅、旋转蒸发仪、100g手提式粉碎机、真空干燥箱、、凝血酶、纤维蛋白原三羟甲基氨基甲烷。

2 研究对象

生水蛭干燥全体（广东和翔制药有限公司），本文通过大量文献检索及预实验得出，将生水蛭用粉碎机打成粗粉，溶于蒸馏水，采用乙醇法提取的水蛭粗提物抗凝血酶效价最高。

3 试验方法

将优选的的水蛭粗提取物，通过文献调研、预实验等方法确定优选水蛭粗提取物的水提醇沉工艺的影响因素确定为：提取时间（h）、加水量（相当于药材倍数）、醇沉浓度（%）、醇沉静置时间（h）四个。

3.1单因素试验

分别精密称定优选水蛭粗粒五份，每份约10g，对提取时间（60min、90min、120min、150min、180min），加水量（6倍、8倍、10倍、12倍、14倍）、醇沉浓度（40%、50%、60%、70%、80%），醇沉静置时间（6h、12h、18h、24h、30h）进行单因素试验，结果各因素的考察范围为：提取时间0.5h～4h、加水量为4倍～12倍、醇沉浓度为40%～80%、醇沉静置时间为8h～24h。（见表1）

天然水蛭素的提取和纯化

陈曦;刘光明;胡强;钱旻

【期刊名称】《华东师范大学学报（自然科学版）》

【年(卷),期】2004(000)002

【摘要】水蛭素(hirudin)是存在于水蛭唾液中的一种酸性多肽类物质，是迄今为止世界上最强的凝血酶抑制剂．在治疗各种血栓性疾病及弥散性血管内凝血中均有很好的预防及治疗效果，并且没有副作用，因而它比肝素更有优越性。研究表明，水蛭素还能防止肿瘤细胞的转移，用水蛭素配合化疗和放疗，可促进肿瘤中的血流而增强疗效，因而具有宽阔的临床应用前景。

【总页数】3页(P104-106)

【作者】陈曦;刘光明;胡强;钱旻

【作者单位】华东师范大学,生命科学学院,上海,200062;华东师范大学,生命科学学院,上海,200062;华东师范大学,生命科学学院,上海,200062;华东师范大学,生命科学学院,上海,200062

【正文语种】中文

【中图分类】Q516

【相关文献】

1.水蛭素提取纯化研究进展 [J], 黄胜;熊伟;姚俊杰;李路;陈红雕;杨引欢;姚洪君

2.Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂对白术多糖提取液纯化效果的影响 [J], 陈程;罗国平;张存劳;闫梦茹 3.仿生诱导高效提取水蛭素及分离纯化的研究 [J], 段超;刘娟

4.我国天然水蛭素提取和应用申请发明专利 [J], 邓宏鹰

5.天然环烯醚萜类化合物提取及纯化技术研究新进展 [J], 谢玲;张学俊;陶菡;贺扬洁;张灵丽

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水蛭素

中文名称：水蛭素英文名称：hirudin

定义：

水蛭体内的一种蛋白质，含65个氨基酸残基和3对二硫键，具有高度特异的抗凝血酶活性，抑制凝血酶结合底物，故有抗凝血作用。

所属学科：

生物化学与分子生物学（一级学科）；氨基酸、多肽与蛋白质（二级学科）

本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布

百科名片

水蛭素(hirudin)是水蛭（Leech）及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65—66个氨基酸组成的小分子蛋白质(多肽)。水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。

1.作用

动物试验与临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现象。此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子；而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗凝血酶III往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭会有较好的效果。

编辑本段

2.应用

水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。研究还表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。它能阻止肿瘤细胞的转移，已证明有疗效的肿瘤如纤维肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，黑素瘤和白血病等。水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血流而增强疗效。

动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素均无明显毒副作用，无论急性、亚急性的毒性试验，对血压、心率、血相、出血时间和血液化学成分均不受影响，呼吸系统也没有影响，无过敏反应，一般无特异抗体发现。半致死剂量LD50＞50mgAg，远大于治疗所用的剂量(1mgAg)。尤其值得指出的是，水蛭素可以口服，这给用药带来很大方便。水蛭素比较稳定，胰蛋白酶和糜蛋白酶并不破坏其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝

前列宁胶囊中水蛭的提取工艺

表1因素水平因素水平123浸泡时间／h61224乙醇量／倍6812醇浓度／%607590渗漉速度／（min／mL）351前列宁胶囊由水蛭、黄芪等多味中药组成，具有清热解毒、活血化瘀、益气补肾的功效，用于治疗慢性前列腺增生及前列腺炎，疗效显著［1］。现代研究表明，水蛭主要成分为多肽类物质，含有抗凝血酶活性的有效成分，具有很强的抗凝和抗血栓活性，是目前已知最强的凝血酶抑制剂［2］。为优化前列宁胶囊中水蛭的提取工艺，我们采用正交试验法对复方中主药水蛭的提取工艺进行研究，以确定水蛭的最佳提取工艺。1仪器与试药1.1仪器SartoiousBT25S型电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；DFY-500型摇摆式高速中药粉碎机（浙江温岭市大海药材器械厂）；PHS-3C型精密pH计（上海精密科学仪器有限公司）；DZF—6050型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。1.2试药水蛭（产地江苏，安徽德昌药业饮片有限公司，批号：20080510），经药学院中药鉴定教研室卢伟副教授鉴定为水蛭科动物蚂蝗WhitmaniapigraWhitman；牛血纤维蛋白原（中国药品生物制品检定所，凝固物含量61%，批号：626-200207）；凝血酶（中国药品生物制品检定所，规格：580IU／支，批号：605-0123）；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（上海楷洋生物技术有限公司，含量≥99.5%）2方法与结果水蛭中主要抗凝血成分为水蛭素和其它抗凝血成分，多为水溶性多肽，在水煎煮过程中易被破坏，故采用渗漉法提取。2.1正交试验设计根据药典条件和文献［3-5］，以浸泡时间、乙醇用量、乙醇浓度、渗漉速度为考察因素，用抗凝血酶活性含量为评价指标，采用正交试验优选水蛭渗漉最佳条件。因素水平设计见表1。

2.2提取方法水蛭粉末过1号筛，称取30g，共9份，按表1条件进行正交试验提取，合并渗漉液。2.3抗凝血酶活性的含量测定根据2010年版《中国药典》收载的凝血酶滴定法［6］测定水蛭的抗凝血酶活性。2.3.1纤维蛋白原溶液制备取纤维蛋白原0.25g，溶于pH为7.85的50mL的Tris-HCI缓冲液中，得0.5%的纤维蛋白原溶液。2.3.2凝血酶的稀释精密称取凝血酶1.3mg，加0.9%氯化钠溶液定容至10mL，得4.68NIH／mL的凝血酶。2.3.3供试品的制备收集渗漉提取后全部的渗漉液，回收乙醇，蒸干，蒸馏水定容至90mL，精密吸取10mL，作为供试品溶液。2.3.4测定方法按照2010版《中国药典》抗凝血酶活性含量测定方法测定。取0.2mL纤维蛋白原溶液，加入50μL抗凝血酶活性提取液，并加入“2.3.2”项下稀释的凝血酶溶液至凝固，得抗凝血酶活性含量。前列宁胶囊中水蛭的提取工艺武一曼1，周建衡1，洪振丰1，徐伟2，郑海音1（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建福州350108；2.福建中医药大学药学院，福建福州350108）摘要：目的优化前列宁胶囊中水蛭的提取工艺。方法采用正交试验法，以抗凝血酶活性为指标确定提取参数。结果水蛭提取工艺为6倍量60%乙醇，浸泡24h，渗漉速度为1mL／min。结论渗漉提取工艺可用于前列宁胶囊中水蛭有效成分的提取。关键词：前列宁胶囊；水蛭；提取工艺；正交设计中图分类号：R284.2文献标志码：A文章编号：1004-5627（2010）05-0039－03

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