利奈唑胺主要降解产物的结构鉴定_曹海彦

利奈唑胺主要降解产物的结构鉴定

曹海彦1，祝艺娟2，桑志培1，晁若冰1*

（1．四川大学华西药学院，成都610041；2．广州市药品检验所，广州510160）

摘要目的：对利奈唑胺主要降解产物的结构进行鉴定。方法：对利奈唑胺原料药进行强力破坏试验，采用高效液相色谱法对降解产物进行分析，应用LC－MS对3个主要的降解产物进行结构鉴定，并利用合成所得杂质对照品对降解产物的结构进行了确证。结果：3个主要的降解产物分别为利奈唑胺的全水解物、开环水解物以及氨基物。结论：利奈唑胺在碱性和酸性条件下的降解产物不相同。在碱性条件下的降解产物主要为全水解物和开环水解物，而在酸性条件下的降解产物主要为氨基物。

关键词：利奈唑胺；降解产物；杂质结构鉴定；液相色谱－质谱联用

中图分类号：Ｒ917文献标识码：A文章编号：0254－1793（2013）08－1342－07

Structure identification of the main degradation products of linezolid CAO Hai－yan1，ZHU Yi－juan2，SANG Zhi－pei1，CHAOＲuo－bing1*

（1．West China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu610041，China；

2．Guangzhou Institute for Drug Control，Guangzhou510160，China）

Abstract Objective：To identify the structure of the main degradation products of linezolid．Methods：Stress de-struction testing was applied to the crude drug of linezolid，with an HPLC method to analyze the degradation prod-ucts．The three main degradation products were identified by LC－MS，and the structure of them were confirmed through comparison with synthetic impurities．Ｒesults：Three main degradation products are the full hydrolysate，the ring－opening hydrolysate and the amido substance of linezolid．Conclusion：The alkaline hydrolysis products of lin-ezolid are different from the acid hydrolysis product．The main alkaline hydrolysis products are the full hydrolysate and the ring－opening hydrolysate，while the acid hydrolysis product is the amido substance．

Key words：linezolid；degradation products；impurity structure identification；LC－MS

利奈唑胺（linezolid）为全合成的噁唑烷酮类抗菌药，化学名为（S）－N－｛［3－（3－氟－4－（4－吗啉基）苯基）－2－氧代－5－噁唑烷基］甲基｝乙酰胺，其结构见图1。利奈唑胺对革兰阳性球菌特别是多重耐药的革兰阳性球菌有良好的抗菌活性，对葡萄球菌、链球菌（包括肠球菌）敏感［1］。由于利奈唑胺具有独特的作用位点和方式，不易与其他抗菌药产生交叉耐药性，在临床上用于革兰阳性菌引起的肺炎、皮肤软组织感染、脑膜炎、心内膜炎、菌血症、骨髓炎和外科手术感染等的治疗［2］。本品疗效确切，应用广泛，但有不良反应的报道，主要表现为恶心、腹胀、腹泻、血小板减少等［3］。

利奈唑胺在存放过程中可能产生降解产物，为了分析利奈唑胺中的潜在杂质，保证药品的质量，对利奈唑进行了降解试验，分析鉴定了主要降解产物。有文献对利奈唑胺及其热降解产物进行核磁共振分析，但未介绍其他途径降解产物［4］。有文献报道采用TLC、HPTLC或HPLC法检查原料或制剂中的利奈唑胺及其降解产物［5－8］。另有对利奈唑胺合成过程中杂质进行分离鉴定的报道［9］。本文对利奈唑胺原料药进行水解、酸水解、碱水解、氧化、高温、强光破坏，取破坏试验样品进行HPLC分析，对主要的降解产物进行结构鉴定，并利用合成所得杂质对照品对降解产物进行了结构确证。本工作为利奈唑胺的稳定性和纯度控制提供了重要依据。

*通讯作者Tel：（028）85501454；E－mail：rbchao@scu．edu．cn

图1利奈唑胺的结构

Fig1Structure of linezolid

1仪器与试药

日本岛津LC－10AT分析型高效液相色谱仪，SPD－10A vp紫外检测器，Class－VP色谱工作站；Waters Acquity超高效液相色谱仪，Waters Quattro Premier XE质谱仪；美国Varian INOVA400MHz核磁共振仪。

利奈唑胺原料药、利奈唑胺杂质对照品（四川大学华西药学院药物化学系提供），乙腈、三氟乙酸、甲酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件采用HPLC法分析利奈唑胺强力破坏试验的样品。色谱条件如下：色谱柱为Gemini C

18

柱（150mm?4.6mm，5μm）；流动相：A相为0.1%三氟醋酸水溶液，B相为0.1%三氟醋酸乙腈溶液，按表1进行线性梯度洗脱；检测波长：254nm；流速：1.0mL·min－1。

表1梯度洗脱程序

Tab1Program of gradient elution

t/min A/%B/%

09010

188020

332575

349010

459010

2.2强力破坏试验

水解：取利奈唑胺原料药约25mg，置25mL量瓶中，加入水5mL，水浴加热1h，取出放冷，再加10%乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；酸水解：取利奈唑胺原料药约25mg，置25mL量瓶中，加入1 mol·L－1盐酸溶液5mL，放置过夜，加入1mol·L－1氢氧化钠溶液5mL中和，加10%乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；碱水解：取利奈唑胺原料药约25mg，置25mL量瓶中，加入1mol·L－1氢氧化钠溶液5mL，85?水浴加热5min，放冷，加入1mol·L－1盐酸溶液5mL中和，加10%乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；氧化破坏：取利奈唑胺原料药约25mg，置25mL量瓶中，加入30%H

2

O

2

溶液3mL，摇匀，放置过夜后，强烈振摇至无气泡产生，再加10%乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；高温破坏：取利奈唑胺原料药适量，置烘箱中，于130?加热3h 后，取出，放冷，称取25mg，置25mL量瓶中，加10%乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；强光破坏：取利奈唑胺原料药适量，用强光（4500lx?500lx）照射5d后，取出，称取25mg，置25mL量瓶中，加10%乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。

取以上强力破坏试验的样品溶液，用“2.1”项下的色谱条件进行分析。结果表明，利奈唑胺的降解产物主要有3个，按保留时间先后顺序将降解产物命名为杂质1、杂质2和杂质3，降解产物及主成分相对含量见表2。利奈唑胺原料及酸、碱破坏样品的色谱图见图2。

表2利奈唑胺强力破坏试验的结果

Tab2Ｒesults of stress destruction testing for linezolid

破坏条件

（destruction condition）

利奈唑胺含量

（content of linezolid）

/%

杂质含量

（content of impurity）/%

123

水解（hydrolysis）99.1800.700

酸（acid）94.9400 4.94

碱（base）10.96 5.0083.850

氧化（oxidation）97.22000.1

热（heat）99.91000.03

光解（photolysis）99.92000.02试验结果表明，水解、酸水解、碱水解、氧化等均可使有关物质的含量增加。其中酸水解和碱水解影响较为显著，在碱性条件下水解，利奈唑胺主要产生杂质1和杂质2，而在酸性条件下水解，则主要产生杂质3。利奈唑胺是噁唑烷酮类化合物，分子中有酯键和酰胺键，易发生水解反应，在不同的条件下，其水解产物不尽相同。为了进一步研究3个主要降解产物的结构，运用LC－MS对其结构进行了鉴定。

2.3杂质的鉴定

2.3.1LC－MS分析

供试溶液的制备：取“2.2”项下酸、碱破坏的样品溶液各适量，混合，即得。

色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH

C

18

柱（100mm?2.1mm，1.7μm）；流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈，按表3进行线性梯度洗脱；检测波长：254nm；流速0.25mL·min－1；进样：5μL。

Fig2Chromatograms of linezolid（A），alkaline hydrolysis products of linezolid（B）and acid hydrolysis products of linezolid（C）

表3

梯度洗脱程序

Tab 3

Program of gradient elution

t /min A /%B /%090101.5901012802018257520

90

10

质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI ）；扫描

方式：正离子扫描；扫描范围：m /z 200→800；毛细管电压：2.8kV ；锥孔电压：20V ；萃取锥孔电压：5V ；

干燥气流速：600L ·h －1；锥孔气流速：40L ·h －1

；离子源温度：100?；干燥气温度：250?。

将制备所得的供试溶液进行LC －MS 分析，总离子流图见图3，杂质1 3的质谱图见图4

。

图3利奈唑胺降解产物的总离子流图

Fig 3

Total ion chromatogram of linezolid degradation products

从图3可以看出，杂质1、杂质2和杂质3的保

留时间分别为1.72、

3.24和3.90min 。根据图4－A ，杂质1的准分子离子峰［M +

H ］+为m /z 270.15。结合利奈唑胺的结构及降解的途径，推测杂质1为利奈唑胺分子中2个酰胺键及1个酯键均断裂的降解产物（称为全水解物，分子式为C 13H 20FN 3O 2，准确质量为269.1540），其结构见图5。

根据图4－B ，杂质2的准分子离子峰［M +H ］+为m /z 312.17。结合利奈唑胺的结构及降解的途径，推测杂质2为利奈唑胺分子中噁唑烷环酰胺键和酯键断裂的产物（称为开环水解物，分子式为C 15H 22FN 3O 3，准确质量为311.1645），其结构见图6。

根据图4－C ，杂质3的准分子离子峰［M +H ］+为m /z 296.17。结合利奈唑胺的结构及降解的途径，推测杂质3为利奈唑胺链状酰胺键断裂形成

的产物（称为氨基物，

分子式为C 14H 18FN 3O 3，准确质量295.1332），氨基物也是利奈唑胺合成过程的

中间体，其结构见图7。2.3.2

与合成的杂质对照品比较为进一步确认以上的杂质，根据推断的结构，合

成了杂质1、

杂质2和杂质3。采用高效液相色谱法检查其纯度，均在98%以上

。

图4杂质1（A ）、杂质2（B ）、杂质3（C ）的质谱图

Fig 4

LC －MS spectra of impurity 1（A ），impurity 2（B ）and impurity 3（C ）

图5杂质1的结构Fig 5

Structure of impurity

1

图6杂质2的结构Fig 6

Structure of impurity

2

图7杂质3的结构Fig 7

Structure of impurity 3

以DMSO －d 6为溶剂，TMS 作内标，分别测定了

化学合成的杂质1、杂质2、杂质3的1H NMＲ和13

C NMＲ。

杂质1的1H NMＲ和13

C NMＲ的数据及信号归属如下：

1

H －NMＲ（DMSO －d 6，400MHz ）δ：6.81（t ，J =

9.6Hz ，1H ，Ar －H ），6.41（dd ，J =2.4、15.2Hz ，1H ，Ar －H ），6.34（dd ，J =2.4、8.8Hz ，1H ，Ar －H ），5.46（t ，J =5.2Hz ，1H ，Ar －NH ），4.72（brs ，1H ，－OH ），3.69（t ，J =4.4Hz ，4H ，2?－CH 2－O ），3.49（m ，1H ，－CH －OH ），3.03（m ，1H ，－CH 2－NHAr ），2.86（m ，1H ，－CH 2－NHAr ），2.81（t ，J =4.8Hz ，4H ，2?－CH 2－N ），2.59（dd ，J =4.8、12.8Hz ，1H ，－CH 2－NH 2），2.47（dd ，J =4.8、12.8Hz ，1H ，－CH 2－NH 2），1.55（brs ，1H ，－NH 2）。

13

C －NMＲ（DMSO －d 6，100MHz ）δ：156.73（d ，J =240.7Hz ，Ph －F ），146.30（d ，J =10.6Hz ，Ph ），129.05（d ，J =9.8Hz ，Ph ），120.72（Ph ），107.88（Ph ），100.40（d ，J =24.1Hz ，Ph ），70.66（－CH －O ），66.64（2?－CH 2－O ），51.85（t ，J =8.2Hz ，2?－CH 2－N ），47.66（t ，J =9.4Hz ，－CH 2－NPh ），46.08（－CH 2－NH 2）。

杂质2的1H NMＲ和13

C NMＲ的数据及信号归属如下：

1

H －NMＲ（DMSO －d 6，400MHz ）δ：7.86（t ，J =4.8Hz ，1H ，NHCO ），6.82（t ，J =9.6Hz ，1H ，Ar －

H ），6.41（dd ，J =2.4、15.2Hz ，1H ，Ar －H ），6.33（dd ，J =2.4、8.4Hz ，1H ，Ar －H ），5.47（t ，J =5.6Hz ，1H ，Ar －NH ），4.97（d ，J =5.2Hz ，1H ，－OH ），3.69（t ，J =4.8Hz ，4H ，2?－CH 2－O ），3.62（m ，1H ，－CH －OH ），3.15（m ，1H ，－CH 2－NHCO ），3.04（m ，1H ，－CH 2－NHCO ），2.98（m ，1H ，－CH 2－NHAr ），

2.87（m ，1H ，－CH 2－NHAr ），2.82（t ，J =4.8Hz ，4H ，2?－CH 2－N ），1.82（s ，3H ，－

CH 3）。

13

C －NMＲ（DMSO －d 6，100MHz ）δ：169.78（CO ），156.71（d ，J =240.7Hz ，Ph －F ），146.11（d ，J =10.5Hz ，Ph ），129.20（d ，J =9.8Hz ，Ph ），120.73（d ，J =4.5Hz ，Ph ），107.98（d ，J =2.3Hz ，Ph ），100.48（d ，J =4.2Hz ，Ph ），68.24（－CH －O ），66.63（2?－CH 2－O ），51.84（2?－CH 2－N ），47.70（－CH 2－NPh ），43.44（－CH 2－NH 2），22.81

（－CH 3）。

杂质3的1H NMＲ和13

C NMＲ的数据及信号归属如下：

1

H －NMＲ（DMSO －d 6，400MHz ）δ：7.51（dd ，J =2.4，15.2Hz ，1H ，Ar －H ），7.21（dd ，J =2.0、9.2Hz ，1H ，Ar －H ），7.06（t ，J =9.2Hz ，1H ，Ar －H ），4.59（m ，1H ，CH －O ），4.02（t ，J =8.8Hz ，1H ，ArN －CH 2－C ），3.82（dd ，J =6.4、8.4Hz ，1H ，ArN －CH 2－C ），3.74（t ，J =4.8Hz ，4H ，2?－CH 2－O ），

2.96（t ，J =4.8Hz ，4H ，2?－CH 2－N ），2.81（m ，2H ，CH 2NH 2），1.88（brs ，2H ，NH 2）。13

C －NMＲ（DMSO －d 6，100MHz ）δ：154.81（d ，J =242.2Hz ，Ph －F ），154.58（N －CO ），135.55（d ，J =8.7Hz ，Ph ），133.89（d ，J =10.5Hz ，Ph ），119.39（d ，J =4.2Hz ，Ph ），114.09（Ph ），106.67（d ，J =2.5Hz ，

Ph ），74.14（－CH －O ），66.37（2?－CH 2－O ），50.92（2?－CH 2－N ），47.24（－CH 2－NPh ），44.39（－CH 2－NH 2）。

根据核磁共振分析的结果，再结合质谱、红外光谱、紫外光谱的分析结果，确定化学合成的3个杂质确为推断的结构。

为了对3个降解产物的结构进行确证，将化学合成的3个杂质作为对照品，通过高效液相色谱的保留时间对降解产物的结构进行

确证。

杂质对照品溶液的配制：分别取杂质1、杂质2

和杂质3的对照品各约5mg ，精密称定，置10mL 量瓶中，加10%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；杂质加样溶液：取以上配制的3个杂质对照品溶液各

0.05mL ，与利奈唑胺降解产物溶液2mL 混合，即得杂质加样溶液。

分别取杂质对照品溶液、利奈唑胺降解产物溶液和杂质加样溶液各10μL ，注入液相色谱仪，记录色谱图（图8）

。

图8杂质1（A ），杂质2（B ），杂质3（C ），利奈唑胺降解产物（D ）和杂质加样（E ）的液相色谱图

Fig 8

HPLC chromatograms of impurity 1（A ），impurity 2（B ），impurity 3（C ），degradation products of linezolid （D ），and the mixture of degradation

product with impurity 1，

2，and 3（E ）由图8可知，化学合成的杂质1、杂质2、杂质3与利奈唑胺降解产物1、2、3的保留时间一致，且杂质加样溶液色谱图中三杂质处均为单一的峰，证明利奈唑胺降解产物的结构即为以上推断的结构。3

小结

本文通过对利奈唑胺中3个主要的降解产物进行LC －MS 分析，并通过化学合成杂质对照品对降解产物进行结构确证，得出利奈唑胺的碱降解产物主要为全水解物和开环水解物，酸降解产物主要为

氨基物。本文的研究结果可为利奈唑胺的生产及贮存条件的选择提供依据。

致谢：感谢四川大学华西药学院邓勇教授提供利奈唑胺及杂质1、2、3的对照品，感谢四川大学生物治疗国家重点实验室汤明海教授在质谱方面提供的帮助。参考文献

1

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（下转第1358页）

桂枝、白术挥发油的主要色谱峰均不明显。这与之前

对其他制剂品种的研究结果［9］

相符。究其原因，与药材的质量、贮藏时间及条件、制剂工艺等因素均有关。故中药制剂中挥发油的质量应引起足够的重视，质量标准的提升尤其重要。应从药材质量的源头开始，规

范使用和生产过程，

及时提高制剂工艺技术，如采用β－环糊精包合技术等

［10－12］

，及时提高药品质量标准

以确保中药制剂的疗效可靠。参考文献

1

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