高速逆流色谱
高速逆流色谱法快速分离制备雷帕霉素工艺研究

种 发 酵 水 平 低 下 和 生 产 提 取 路 线 复 杂 , 由于 雷 帕霉
经活 性炭 脱色 后 ,减压 浓缩 得 雷帕 霉素粗 提 取物 。
22 . HS C 分 离 雷帕霉 素粗提 物 C C
s p r t n a d p rf a i n o p my i o fr n a i nb oh i r e s a e e a a i n u i c t f a a cn f m e me tt r t l g — c l o i o r r o n a
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Ke r s H 曲一 edcu t - r n rmaorp y Sp rt nadp r ct n R p myi; cl ; u t ywod i s e ne c r t ho tgah ; e aao ui a o ; a a c My e a P ry p o ru e c i n i f i n i l
2L z o o a o a adt h ia cl g , uh u6 6 0 ) u h uv ct n ln c ncl ol eL z o 4 0 5 i e e
Ab ta t 0bet e T eq i p rt n to fh p my i o fr nai rt w s n et ae s c r jci h uc s aai h do e a a c f m me t o boh a v s g td v ke o me t r nr e tn i i
( C C tcn lg s mpo e ,n i ee tov n s m a a zdfrh i r uine ce c. s l HS C )eh oo ywa l d a ddf rn let yt w s n l e e s i t f i y Reut e y f s s e a y o t d tb o i n s
高速逆流色谱法分离望春花蕾中的木兰脂素

Se r ton o a no i r pa a i fm g ln f om o r b l f we uds o a no i nd iby h g — s e fm g Ha b o i i h pe d
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水溶性天然产物的提取分离技术

水溶性天然产物的提取分离技术制药工程专业王俊20085257指导教师赵莉摘要:水溶性天然产物是药物研发中极具潜力的原料资源,分离纯化水溶性天然产物中具有独特生物活性的物质是中药研究的重要基础工作。
水溶性天然产物有效成分复杂,含量低,难于富集用传统的分离方法不仅步骤繁琐,能源及材料消耗大,而且产率及纯度不高,尤其难以分离结构和性质相似的组分。
随着中药现代化的发展高新技术不断在水溶性天然药物中推广应用。
现将近年水溶性天然产物提取分离纯化新技术的进展作一综述。
关键词:水溶性提取技术天然产物1、传统的提取分离方法1.1 热水浸提法热水浸提法即是煎煮法,是中药有效成分提取最早、最常用的方法之一。
中国药典1990年版一部和卫生部《药品标准》中药成方制剂1~9 册,共收载中成药1945种,其中采用热水浸提工艺的多达826 种。
但是热水浸提法基本上仍停留在经验水平上,热水浸提法的工艺参数,如浸泡时间、煎煮时间、煎出量(药液得量) 等均无最佳量控标准,往往导致产品质量和疗效的显著性差异。
一定程度上,应当组织力量从多层次、全方位进行系统研究,选择出适合于各种成药品种的热水浸提工艺的最佳条件和质量控制标准。
1.2 乙醇提取法乙醇浸提法原理与热水浸提法基本相同,不同之处是用乙醇作溶剂浸出中药有效成分,该法可以有效减少药材中水溶性杂质的浸出,对于这类杂质较多的药材尤为适宜。
乙醇浸提法分为冷浸法(渗漏法) 和热提法(回流法) 两种。
由于采用乙醇作为溶剂进行提取,某些溶解于乙醇的杂质(如树脂、油脂、色素等) 也会被提取出来。
对于这些杂质,可从醇提取液中回收乙醇,加水搅拌,冷藏一段时间,待完全沉淀后过滤除去。
冷浸法一般用于提取热敏性成分,但乙醇用量多,回收溶剂量大,生产周期长。
热提生产周期短,但杂质含量相对较高,给后继的分离工序增加了成本2综合提取分离技术。
2.1膜分离技术膜分离技术以选择性透过膜为分离递质,当膜两侧存在某种推动力(如压力差、浓度差、电位差等)时,原料侧组分选择性的透过膜,以达到分离,提纯目的。
高速逆流色谱_HSCCC_在食品色素制备中的应用

tein) 、紫黄素 (V iolaxanthin) 、新黄素 (Neoxanthin) 、 β - 胡 萝卜 素 、玉米黄 素 、番茄 红素 和 辣 椒 红 素 等 [ 2 ] 。Vesper, H. , N itz, S. ( 1997 年 ) [ 3 ] 利 用 HPLC法配合个人数字监测仪 ( PDA detection) 对 红辣椒 ( Cap sicum annuum L. )中类胡萝卜素成分 进行分析和半定量测定 。根据它们的紫外可见光 光谱 , 检 测 成 分 可 分 为 玉 米 黄 素 类 ( zeaxanthin Ο like)和辣椒红类 ( cap santhinΟlike) 。基于色谱分析 结果 , 它们 可分 成未酯 化 ( unesterified ) 、单 酯 化 (monoesterified)和双酯化类胡萝卜素 ( diesterified carotenoids) 。运用 HSCCC 和不同柱色谱 ,从同一 红辣椒提取物中分离出 8种最主要的类胡萝卜素 。 用质谱 (mass spectrometry,M S)鉴定酯化的类胡萝 卜素 。DC I - M S 是最适合的分析技术 。经鉴定 , 类胡萝卜素酯 ( carotenoid esters) 为 , 被肉豆蔻酸 (myristic acid) 、月桂酸 ( lauric acid)和棕榈酸 ( pal2 m itic acid)酯化了的辣椒红 。
200mg样品洗脱出 3 个峰 ,分别为茶黄素 ( theafla2 分泌物称为紫胶 ,含有蒽醌类( theaflavin - 3) 、3, - 没食子酸盐 ( laccaic acid ) 。 H isao Oka . Yoichiro Ito ( 2000
84
Degenhardt, A. , Knapp , H. 等 ( 2000年 ) 建 [ 7 ] 立了从红葡萄酒中快速制备锦葵色素的方法 :红葡 萄酒先经 Amberlite离子交换树脂 (XAD - 7)柱的 清洗 ,以 TBM E - 正丁醇 - 乙腈 - 水 ( 2 ∶2 ∶1 ∶5,用 0. 1% TFA 进 行 酸 化 ) 作 为 流 动 相 , 再 经 HSC2 CC1000型 (美国马里兰州 PTR 公司产 )进行分离 锦葵色素 (malvidin 3 - glucoside) 。用 1998年产西 式窖藏加州红葡萄酒 (W estern Cellars Californian red w ine ) 和 1997 年 产 德 国 红 葡 萄 酒 ( Hex vom Dasenstein Spaetburgunder)进行试验 。 1 瓶葡萄酒 可分离提纯 65 mg锦葵色素 (malvidin 3 - gluco2 side) 。经 HPLC - DAD , ESI - M S /M S和 1H NMR 检测 ,该提取物足以作为参考样品 ( reference com2 pound) 。该方法为从葡萄酒和葡萄皮中 ,提取锦葵 色素提供了良好的借鉴 。
高速逆流色谱法分离纯化红曲色素组分

1922010, Vol. 31, No. 20食品科学※工艺技术高速逆流色谱法分离纯化红曲色素组分郑允权 1 ,李泳宁 1 ,王阿万 2 ,陈芬玲 2 ,石贤爱 2 ,郭养浩 1 , 2 , *(1.福州大学药物生物技术与工程研究所,福建 福州 2.福建省医疗器械与医药技术重点实验室,福建 福州 350002; 350002)摘 要:采用高速逆流色谱法(HSCCC)分离纯化红曲发酵产品中 6 种 Azaphilone 类色素组分。
筛选弱极性分离溶剂 系统正己烷 - 醋酸乙酯 - 甲醇 - 水,研究 6 种色素组分在不同溶剂体系中的分配系数,建立两步逆流萃取分离的技术 路线。
经过 HPCCC 分离纯化和丙酮结晶操作,得到 6 种高纯度的 Azaphilone 类色素组分,纯度均大于 98.5%,得 率达到 81.40%~84.78%,所得的 6 种色素组分的摩尔吸光系数分别为 13313、13877、9380、9360、25621、25849 L/(mol·cm)。
本研究可提供一种新型的制备高纯度红曲 Azaphilone 类色素组分的技术路线。
关键词:红曲色素;高速逆流色谱;分离纯化Separation and Purification of Monascus Pigments by High-speed Counter-current ChromatographyZHENG Yun-quan1,LI Yong-ning1,WANG A-wan2,CHEN Fen-ling2,SHI Xian-ai 2,GUO Yang-hao1,2,* (1. Institute of Pharmaceutical Biotechnology and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350002, China; 2. Fujian Key Laboratory of Medical Instrumentation and Pharmaceutical Technology, Fuzhou 350002, China) Abstract: azaphilone-type pigments were separated from Monascus-fermented solid medium and purified/fractionated by Six by high-speed counter-current chromatography (HSCCC). A solvent system with weak polarity involving four components nhexane, ethyl acetate, methanol and water was selected and used for HSCCC. Based on a comparative analysis of partition coefficients of target compounds in different solvent systems, a two-step HSCCC routine was developed. After separation by HSCCC and crystallization with acetone, six azaphilone-type pigments with high purity were obtained. The purity of each pigment was above 98.5% and their yields were between 81.40% and 84.78%. Their molar absorption coefficients were 13313, 13877, 9380, 9360, 25621 L/(mol·cm) and 25849 L/(mol·cm), separately. Key words:Monascus pigments;high-speed counter-current chromatography;separation and purification 中图分类号:TS202;Q819 文献标识码:A 文章编号:1002-6630(2010)20-0192-04红曲霉菌发酵产品的生产与应用在我国已有一千多 年历史,主要用于食品着色、酿酒和传统中药材。
高速逆流色谱技术在中药有效成分分离领域中的应用

积 雪草
2 4 葸醌类 .
皂角苷
蒽醌类化合物是广泛存在的重要天然色素 ,
氯仿: 甲醇: 异丁醇: (: 31 水 76 : : )
以葸 醌 及 其 衍 生物 最 为 重 要 , 有 泻 下 、 菌 、 癌 等 生理 具 抗 抗 活 性 。近 年 来 应用 H C C分 离 葸 醌 的 , 例 见 表 4 SC 举 。
正 丁 醇 : 醋 酸 : (: 5 】 冰 水 41 ) :
9 ・ 86
同分异构体
厚 朴 金 银 花
邻苯二酚和对苯 二酚
厚朴酚与和厚朴 酚 绿原酸
Ar e Si n t mi ni e de ya e nui pi 0x rt an n
>9 5 9・
青蒿 青蒿
龙胆
A r s f u U o u b u r tC ls s i
异辛烷: 乙酸 乙酯 (:) 甲醇: (: 73 水 64 ) 异辛烷 : 甲醇: (0 : 水 1: 3 7) 氯仿: 甲醇: (: : 水 91 8 2) 氯仿: 甲醇: (:3 ) 水 71 : 8
1个裂环烯醚 萜苷 4个甜味三萜苷
生物 碱 的 HC C 取 文献 报道 较 多 。 SC 提 生物 碱 是重 要 的天 然含 氮 化 合物 , 疾 病 治疗 和 药物 发 展 等具 有 重 要作 用 。生物 碱 对 在 植 物 中分 布 非 常广 泛 , 少 有 5 科 10属 植物 中含 有 至 O多 2 生物 碱 。 近年 来用 I C C已成 功分 离 了多 种生 物碱 ( 表 2。 t C S 见 ) 2 3 有 机 酸和 萜 类 . 道 ( 表3 。 见 ) 近 几 年 有 机 酸 和 萜类 的研 究 逐 渐 增 多 ,S C H C C分 离 纯 化 有 机 酸 和 萜 类 成 分 的 研 究 已被 广 泛 报
高速逆流色谱法分离纯化长春花中长春新碱
采 用 高速 逆流 色谱 仪 , 氯仿一 醇一. o ・ HC( 3: ) 甲 0 3m l L 1 4: 2溶剂 体 系, 上相 为 固定相 , 相 为流 动 相 , 下 流动 相 流 速 为 20m . L・ n , mi ~ 紫 外检 测 波 长 为 2 0n 主机 转速 为 8 0r 8 m, 0 ・mi_ , 温循 环 温 度 为 2 n 。恒 8℃ 。 结果 业 生产 高 纯 度 产 品 。 关键词 : 高速 逆 流 色谱 ; 春 花 ; 长 长春 新碱
s e dc u t r u rn h o tg a h su e i ho o o m meh n l . o . HC 4:3: )a h ov n y tm. p e o n e- re t r mao rp ywa s d w t c lr fr — ta o- 3 m 1 L c c h 0 l( 2 st es le t se s
西 北 药 学杂 志
21 0 1年 1 第 2 2月 6卷
第 6 期
35 9
高速 逆 流 色 谱 法分 离 纯化 长 春 花 中长春 新 碱
韩 艳 , 张 琰 , 新友 , 刘 覃 华 , 小燕( 杜 第四军医大学唐都医院药剂科, 陕西 西安 70 3) 108
高速逆流色谱法分离制备辛夷中的表木兰脂素A
声溶解后 得 到 1m / L的样 品溶液 , 0 gm 备用 。
1 4 H C C分离 纯 化方 法 . S C 将 两相 溶 剂 系统 中 已超 声 脱 气 的上相 ( 固定 相 ) 2 L mi 以 0m / n的速度泵 入 HS C C C分 离管 中 , 上相充 满整 个 分 离管 后 , 慢 调 节 主机 转 速 至 待 缓 8 0/ i , 时针旋 转 , 时以 1 2mL m n的速 度将 下 相 8 rm n 顺 同 . / i
安徽农学通报 , n u A r SiB l 2 1 1 (5 A h i gi c. u1 0 2,8 0 ) . .
高 速 逆 流 色 谱 法 分 离 制 备 辛 夷 中的表 木 兰脂 素 A
刘 宗红 于 波
162 ) 0 9 1 ( 辽宁师范大学 生命科学学院 , 辽宁大连
15 H L . P C条 件
色 谱柱 :tr 1 柱 。流动 相 : 为 Xe a 8 r C A相
1 实验 部分
11 实验材料 . Wa r公 司高 效 液 相 色 谱 仪 和 质 谱 仪 ; ts e 高 速逆 流色谱 仪 ( 海 同 田生 化 技 术 有 限公 司 ) 50 z 上 ; 0 H
炎 、 敏 和降压 等药理 作用 … 。表 木兰脂 素具 有杀 昆虫 抗过 作用, 当饲料 中含 本 品 >1 gm m / L时 , 著 抑 制 黄 猩猩 果 显 蝇 幼虫 的生长 。对于 木 脂 素成 分 的分 离 国内外 已有 很 多
报 道且采 用 的分离手 段也 多为硅胶 和凝 胶柱 层析 法 , 尚 而 缺 乏用 现代分 离技术 对辛夷 中木脂 素成 分 的分 离 。
高速逆流色谱在手性拆分中的应用
定相 的分离方 法 。 由于不需 要 固体 支撑体 , 物质 依 据其在两相 中分 配系数 的不 同而 分离 , 因而解
决 了 传 统 分 离 色 谱 因 不 可 逆 吸 附 而 引 起 的 样 品
损失 、 失活、 变 性等 问题 。由于这个 特点 , 高速逆 流色谱特别适合 于天然生物活性成分的分离 。而
速旋转和分离过程 中不易 出现渗漏现象 。 高速 逆流色谱 的 目的主要 是制备 型分离 , 目
前 已被 广 泛 应 用 于 植 物 中 生 物 碱 类 ,黄 酮 类 , 萜
修 回 日期 : 2 0 1 3 — 0 4 — 2 5 作者简介 : 黄林兵( 1 9 7 9 一 ) , 男, 浙 江 台州 人 , 工程师 , 浙 江 大 学 应 用 化 学专 业 硕 士 学 位 , 主要 从 事 化 工 、 医 药 方 面 的工 艺 设 计 。 电
的制备分离手段 。
1 HS CCC 技 术
1 . 1 H SCC C 发 展 过 程
上 世纪 5 O年 代 ,逆 流 分 溶 法 ( c o u n t e r c u r r e n t d i s t r i b u t i o n , C C D) 被 广 泛 应 用 于 天 然 产 物 的分 离 。 但 是 由 于装 置 固有 的 一 些 缺 陷 . 比 如设 备 庞 大 复
l 1 避 免 了样 品 在 分 离 过 程 的不 可 逆 吸 附 、 分 解 等 可 能 的样 品变 性 问题 。 2 1 滞 留在 柱 中 的 样 品可 以 通 过 多 种 洗 脱 方
杂, 易碎 , 溶剂体 系容易乳 化 , 溶剂消 耗量大 和分
离 时 间太 长 等 ,很 快 在 2 O世 纪 6 0年 代 被 液相 色 谱淘汰 。 在2 0世 纪 7 0年代 .一 种 结 合 了逆 流分 溶 和 液 相 色谱 的 优 点 的 方 法 , 逆 流色谱 ( c o u n t e r c u r r e n t c h r o ma t o g r a p h y 。 C C C)法 被 用 来 进 行 连 续 的 逆 流 分 离 。基 于 这 种 方 法 的 液 滴 逆 流 色 谱 在 1 9 7 2年 被 商 业 化 ,并 在 2 0世 纪 七 八 十 年 代 被 广 泛 用 于 天然 产 物 的 分 离 。但 是 这 种 装 置 所 需 分 离 时 间较 长. 通 常要 2 ~ 3 d 。 并 且 仅 有 有 限 的 溶 剂 体 系 可 以
高速逆流色谱分离制备栀子苷
: 3 ) 和 B: 正丁 醇: 水( 1 : 1 ) , 上相 为 固定相 , 下相 为流 动相 , 流速 为 2 . 0 ml Jm i n ,转速 为 8 5 0 r / a r i n , 温度 控制 在
2 5 ℃, 纯度 用 H P L C测定。结果表 明, 利 用溶 剂 系统 A和 B进行 HS C C C制备 栀子 苷, 使 栀子 苷含 量从 5 0 . 7 5 %
: w a t e r ( 1 : 1 ) b y e l u t i n g t h e l o w e r a q u e o u s p h a s e a t a l f o w r a t e o f 2 . 0 m L / m i n a n d a r e v o l u t i o n s p e e d o f 8 5 0 r / m i n .a t 2 5 ℃. A f t e r t h e p r o c e e d i n g o f s e p a r a t i o n i n s o l v e n t s y s t e m A a n d B, 1 6 0 . 0 m g( H P L C a r e - a s g i v i n g a p u i r t y o f 8 6 . 6 %, t h e r a t e o f r e c o v e r y o f HS C C C i s 8 1 . 3 6 % )a n d 2 0 5 . 0 m g ( a p u i r t y o f
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高速逆流色谱属于逆流色谱的范畴,逆流色谱是一种新型的分离手段,它的主要分离原理是利用样品在固定相和流动相之间的差异也就是分配比不同而进行分离的,值得注意的是逆流色谱的固定相和流动相都是液体,其主要优点是没有传统色谱的死吸附,样品的回收率高等特点。
逆流色谱源于逆流分溶法,也就是用实验室经常使用的分液漏斗进行连续的液液萃取,根据样品在两种互不相溶的溶剂中分配比不同而进行分离。
逆流色谱早期发展的方法有液滴逆流色谱,旋转小室逆流色谱等。
但是作为一种分离手段,早期发展的逆流色谱不能满足高效快速的分离,分离的周期很长,效率很低。
在70年代,Ito 博士成功开发了一种能够高效快速分离的逆流色谱-高速逆流色谱。
但高速逆流色谱也有很多种设计,经过几十年的发展,现在的高速逆流色谱一般是采用同步行星式的设计,其主要是利用在高速旋转状态产生的二维离心力场的作用下使两种互不相溶的溶剂快速有效的对流或分割----或者说混合或分层,从而使样品能够在短时间内进行成千上万次萃取,根据样品中的物质分配系数的不同而进行分离的一种方法。
HSCCC 有几个突出优点:(1)无不可逆吸附。
聚四氟乙烯管中的固定相无需载体液-液色谱系统,故而消除了气- 液和固- 液色谱中因使用载体而带来的吸附现象,特别适于分离极性物质和生物活性物质;(2)高回收率。
由于流动相和固定相均为液体,样品可全部回收,分离纯化与制备可同步完成,故特别适于制备性分离;(3 )操作简便。
因固定相为液体,体系更换与平衡方便、快捷。
与HPLC 相比,HSCCC 进样量较大,最多可达数克,是HPLC 的数百倍;与常压、低压色谱相比,HSCCC 的分离能力强,有些样品经一次分离即得到1个甚至多个单体,且分离时间短,数小时即可完成,纯度多在98%以上。
高速逆流色谱作为一种比较新颖的分离方法,影响因素主要有溶剂体系的选择,旋转速度,流动相的流速,温度等影响。
溶剂体系选择即条件的摸索,相当于传统色谱摸流动相的条件,不同的是高速逆流色谱条件的摸索主要是指样品在固定相和流动相两者之间的分配的比值,待分离的样品的K值最好在0.6-1.5范围之内,这样才会有一个好分离效果。
转速主要体现在固定相的保留率上,一般转速越高固定相保留率也比较高,分离效果也相对的好一些。
流速要适中,太大会降低固定相保留率,太低会容易拖尾。
温度是一个非常重要的参数,温度恒定对体系得重复性有着决定性的影响,比如说冬天,夏天可能同一个溶剂体系就会有着不同的分离效果。
高速逆流色谱在药物领域主要应用在中草药,合成药物,抗生素以及蛋白等领域。
在天然产物中应用的更广泛一些,比如生物碱、黄酮、香豆素,蒽醌,皂苷,萜类等都有相应的研究。
对于每一类的化合物一般都有一些经典的体系,比如说生物碱用氯仿:甲醇:水(酸水),或者用正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水。
在低极性的化合物象挥发油,萜类可以用正己烷:甲醇:水,石油醚:甲醇:水等体系,皂苷一般用乙酸乙酯:正丁醇:水体系。
以上介绍了选择溶剂系统的一般步骤,主要是查文献-摸条件-上高速逆流主机-筛选优化体系这几个步骤。
摸条件和上机作实验是最关键的。
其实每一类型化合物都有一些比较固定的体系,比如说生物碱类化合物你可以用氯仿:甲醇:酸水的体系,也可以用正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水的体系,还有人用正己烷:正丁醇:水的体系成功分离了石杉碱甲。
具体哪个体系适合,就要看你样品的具体性质来判定。
摸索体系对于初学者可能会比较慢,我觉得慢也不是一件坏事,毕竟是一个经验积累的过程。
摸索条件主要是判断要的组分的分配系数如何,一般会选在一个比较合适的位置,我们可以通过把体系
加入试管当中,然后加入样品,观察上下相的颜色,最好在通过薄层看一下斑点大小(取等量的上下相点板)。
值得注意的事,选择体系的时候一般要注意最好先选择比较经典的体系或者固定相的保留率高的体系。
(判断的一个标准就是上下两相的比重相差越大,保留一般就会高,最好拿个试管看所选体系的分相时间,最好是小于30秒)比如说氯仿:甲醇:水=4:3:2,正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水=1:1:1:1,乙酸乙酯:正丁醇:水=4:1:5体系。
氯仿:甲醇:水系统比较适合中等以上极性物质的分离,如果是酸水的话还可以用来生物碱的分离。
正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水适合分离低,中等极性的物质,根据化合物不同极性作比例的调整。
乙酸乙酯:正丁醇:水主要用一些极性比较大化合物的分离。
在选择体系的时候也要注意上下相的比例,一般都是采用轻相做固定相,如果所选择体系上相很多,下相较少的话,就会比较浪费。
关于体系的优化就是为了寻求一个更好的分离效果,这个相对来说比较容易些,可以根据选择的体系进行比例的调整或者在加入少量的其他溶剂,主要手段就是为了寻求一个更合适的分配系数。
除了体系的调整以外还可以进行流速和温度的调整来选择一个比较合适的溶剂系统。