诱导人孤雌胚胎干细胞分化为胰岛样细胞团

中旧组织工程研究与临床康复　‘７４誊彩’２７　２０１０—０７—０２出版　ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＲｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｖｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇｍｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｊｕｌｙ　２，２０１０　Ｖｏ１．１４，Ｎｏ．２７　

诱导人孤雌胚胎干细胞分化为胰岛样细胞团术术术☆　周静’－一，李进’－一，林戈’－一，卢光砺’・　Ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｔｏ　ｉｓｌｅｔ－ｌｉｋｅ　ｃｌｕｓｔｅｒｓ　Ｚｈｏｕ　Ｊｉｎｇ’一，Ｌｉ　Ｊｉｎ　一，Ｌｉｎ　Ｇｅ’ｌ＿，Ｌｕ　Ｇｕａｎｇ．ｘｉｕ’【２　Ａｂｓｔｒａｃｔ　ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ：Ｆｏｌｌｏｗｉｎｑ　ｔｈｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕＩ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐａ￣ｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ（ｈｐＥＳ）ｃｅｌｌＩｉｎｅｓ，ｔｈｅ　ｆｕｒｔ：ｈｅｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｓｔｕｄｙ　ｂｅｃｏｍｅｓ　ｈｏｔ　ｓｐｏｔ．　ＯＢＪＥＣＴｌＶＥ：Ｔ０　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ｊｓｌｅｔ・ｌｉｋｅ　ｃｌｕｓｔｅｒｓ　ｆｒｏｍ　ｈｐＥＳ　ｃｅｌｌｌｉｎｅｓ．　ＭＥＴＨ０ＤＳ：ＯＲｅ　ｓｅｌｆ－ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｈｐＥＳ　ｃｅｌｌｌｉｎｅ　ａｎｄ　ｏｎｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｈｐＥＳ　ｃｅｌｌｌｉｎｅ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｗｅ　ａｄｏｐｔｅｄ　ａ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　５－ｓｔａｇｅｓ　

ｐｒｏｔｏｃｏ１　ｗｈｉｃｈ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｒｕｌｅ　ｏｆ　ｐａｎｃｒｅａｓ　ｔｏ　Ｉｎｄｕｃｅ　ｈｐＥＳ　ｃｅｌｌｓ　ｊｎｔｏ　ｉｓｌｅｔ—ｌｉｋｅ　ｃｌｕｓｔｅｒｓ．　ＲＥＳＵＬＴＳ　ＡＮＤ　ＣＯＮＣＬＵＳｌ０Ｎ：Ｔｈｅ　ｔｅｒｒｎｉｎａＩ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｇａｔｈｅｒｅｄ　ｊｎｔｏ　ｉｓｌｅｔ－ｌｉｋｅ　ｃｌｕｓｔｅｒｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｆｒｏｍ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍＩｓｔｒｙ　ａｎｄ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　Ｉｓｌｅｔ—ｌｉｋｅ　ｃｌｕｓｔｅｒｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｔｈｅ　ｉｓｌｅｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａＩ　ｍａｒｋｅｒｓ．Ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｔｅｓｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｄｕｓｔｅｒｓ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｓｌｅｔ．Ｔｈｅ　ｉｓｌｅｔ—ｌｉｋｅ　ｃｌｕｓｔｅｒｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｐｈＥＳ　ｃｅｌｌｓ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｉｓｌｅｔ．ｗｈｉｃｈ　ｗｏｕｌｄ　ｂｅ　ａ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ｍａｔｅｒｉａＩ　ｔｏ　ｔｒｅａｔ　ｔｙｐｅ　ｌ　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ．　

Ｚｈｏｕ　Ｊ，Ｌｉ　Ｊ，Ｌｉｎ　Ｇ，Ｌｕ　ＧＸ．Ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｔｏ　ｉｓｌｅｔ—ｌｉｋｅ　ｃｌｕｓｔｅｒｓ．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ　Ｚｕｚｈｉ　Ｇｏｎｇｃｈｅｎｇ　Ｙａｎｊｉｕ　ｙｕ　Ｌｉｎｃｈｕａｎｇ　Ｋａｎｇｆｕ．２０１０；１４（２７）：５００１—５００５．　【ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｔｅｒ．ｃｎ　ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ】　

摘要　背景：随着人类孤雌胚胎干细胞系的成功建立，对该细胞的进一步分化功能研究成为新的研究热点。　目的：研究体外培养的人类孤雌胚胎干细胞诱导分化为胰岛样细胞团的潜能。　方法：自主建系孤雌来源人胚胎干细胞和正常来源人胚胎干细胞各１株，运用基于胰腺体内发育规律的改良５阶段诱导法　诱导人孤雌胚胎干细胞为胰岛样细胞团，加入不同生长因子及诱导试剂对人胚胎干细胞分５阶段序贯培养。　结果与结论：终末分化细胞光镜下呈团状聚集，ＲＴ．ＰＣＲ、免疫荧光染色检测分化细胞表达胰岛细胞特征性的基因与蛋白　胰岛素释放实验提示获得的细胞具有胰岛样生化功能　由人类孤雌胚胎干细胞来源的胰岛样细胞团具备胰岛的基本特征，　是未来治疗１型糖尿病的可用材料。　关键词：人类孤雌胚胎干细胞：胰岛样细胞团；诱导分化；糖尿病；干细胞　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－８２２５．２０１０．２７．０１４　

周静，李进，林戈，卢光聩．诱导人孤雌胚胎干细胞分化为胰岛样细胞团【Ｊ】．中国组织工程研究与临床康复，２０１０　１４（２７）：５００１—５００５．　【ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｔｅｒ．ｏｒｇ　ｈｔｔｐ：／／ｃｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ】　

孤雌生殖是单个卵子在没有精子的作用　下发育而成个体的过　’　Ｊ。在很多物种如爬行　类动物、鱼类动物、鸟类动物中存在，但哺乳　动物中不会自发产生这种生殖方式。目前，哺　乳动物卵子已经被成功的在体外激活　Ｊ，利用　孤雌激活的卵母细胞发育至囊胚阶段的内细　胞团（ｉｎｎｅｒ　ｍａｓｓ　ｃｅｌｌｓ，ＩＣＭ）建立起来的干细　胞称为孤雌胚胎干细胞　圳。本科室已经成功建　立人孤雌胚胎干细胞系　Ｊ。　研究证实啮齿类和非人灵长类动物的孤雌　胚胎干细胞能够分化为中脑多巴胺神经元　Ｊ；　肝脏内胚层　Ｊ；ＣＤ４５　细胞，淋巴细胞，单核　细胞和红细胞形态的细胞Ｉ　Ｊ；白发跳动的心肌　细胞、脂肪细胞、上皮细胞等多种不同类型的　细胞ｌ１　。提示孤雌胚胎干细胞具有与正常胚胎　ｔｓＳＮ　１６７３．８２２５　ＣＮ　２１—１　５３９，Ｒ　ｃｏＤＥＮ：ｚＬＫＨＡＨ　干细胞一样具有分化的多潜能性　。但目前人　孤雌胚胎干细胞向胰岛样细胞的分化还未有报　道。　课题组基于体内胰腺发育规律，分为未分化　胚胎干细胞阶段、限定性内胚层阶段、原始肠管　阶段、胰腺前体细胞阶段、胰岛样细胞的成熟阶　段对人孤雌胚胎干细胞进行诱导，对经诱导后产　生的胰岛样细胞团，进行胰岛相关标志基因和蛋　白的检测。　

１材料和方法　设计：观察性实验。　时间及地点：实验于２００７—０７１２００９－０９在中　南大学生殖与干细胞工程研究所实验室完成。　材料：　胚胎干细胞来源与培养：人类孤雌胚胎干细胞　系ｃｈＨＥＳ６９，以及正常来源人类胚胎干细胞　

’Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｓｏｇｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１００７８。Ｈｕｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｃｈｉｎａ；　ＮａｔｉｏｎａＩ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．　Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１００７８，Ｈｕｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｃｈｉｎａ　

Ｚｈｏｕ　Ｊｉｎｇ☆．　Ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｆｏｒ　ｄｏｃｔｏｒａｔｅ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ。Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｓｏｕｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１００７８．Ｈｕｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｃｈｉｎａ；　ＮａＵｏｎａＩ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃｅｎｔｅｒ　０ｆ　Ｈｕｍａｎ　ＳｔｅｍＣｅｌＩｓ，　

Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１００７８．Ｈｕｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｃｈｉｎａ　ｚｈｏｕｊｉｎｇ１２　＠ｇｍａｉｌ．ｃａｍ　

ＣｏＥｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ　ｔｏ：　Ｌｕ　Ｇｕａｎｇ—ｘｉｕ．　Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　ＲｅｐｒｏｄｕｃＳｖｅ　ａｎｄ　ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｎｎｇ．Ｃｅｎｔｍｌ　Ｓｏｕｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１００７８．Ｈｕｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ；　ＮａｔｉｏｎａＩ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｎｎｇ　Ｃｅｎｔｅｒ　０ｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，　Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１０Ｏ７８．Ｈｕｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ。Ｃｈｉｎａ　ｌｕｇｘｄｉｒｅｃｔｏｒ＠ｙａｈｏｏ．　ｃｏｍ　

Ｓｕｐｐｏｄｅｄ　ｂｙ：ｔｈｅ　Ｈｉ－Ｔｅｃｈ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　

Ｃｈｉｎａ（８６３　ｐｒｏｇｒａｍ）．　Ｎｏ．２００６ＡＡ０２Ａ１０２　：　ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａＩ　Ｂａｓｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｇｒａｍ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ（９７３　ｐｒｏｇｒａｍ），　Ｎｏ　２ＯＯ５ＣＢ５２２７０５　：　ｔｈｅ　ＮａＵｏｎａＩ　ＮａｔｕｒａＩ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａ￣ｏｎ　ＤｆＣｈｉｎａ　Ｎｏ．　３０８００６５９＊：　

Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：２０１０４）１－１４　Ａｃｃｅｐｔｅｄ：２０１０－０２－２７　

５００１　蜀静．等．诱导人孤雌珏眙干细胞分化为辕岛样细胞圃　’中南大学生殖与　干细胞研究所，湖　

南氅畏沙审　４１００７８；　国家千　细胞工程研究中　心，湖南省长沙市　４１００７８　

周　静☆，女，　１９８２年生，江西　省鹰潭市人，汉　族，中南大学生殖　与干细胞研究所　在读博士，主要从　事人胚胎干细胞　工程研究　ｚｈｏｕｊｉｎｇｌ２　＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ　

通讯作者：卢光　磅，中南大学生殖　与千细胞研究所，　湖南省长沙市　４１００７８：国家干　细胞工程研究中　心，湖南省长沙市　４１００７８　中图分类号：Ｒ３９４　２　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７３—８２２５　（２０１Ｏ）２７－０５００１－０５　ｃｈＨＥＳｌ　３７均为本实验室自主建系　侧。胚胎干细　胞乍长在人饲养层细胞上，每天观察和换液，　５－７　ｄ传代１次。将准备用于诱导实验的人胚胎　干细胞传代至用Ｍａｔｒｉｇｅｌ预铺皿的培养板上，在　３７℃、体积分数为５％ＣＯ２、饱和湿度培养箱内　继续培养。　试剂与仪器：　试剂与仪器　来源　ＲＰＭＩ１６４０　Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ　人血清白蛋白（ＨＡＳ）　全反视黄酸（ＲＡ）　Ｅｘｅｘｄｉｎ－４　Ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ　ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ－ＫＡＡＤ　ＫＧＦ（ＦＧＦ７）　Ｎｏｇｇｉｎ　烟碱　Ｍａｔｒｉｇｅｌ　ＰＤＸ１多克隆抗体　Ｓｏｘｌ７单克隆抗体　Ｉｎｓｕｌｉｎ单克隆抗体　Ｒｏｄａｍｉｎ荧光二抗（ｄｕｎｋｅｙ　ａｎｔｉ　Ｇｏａｔ）　美国Ｇｉｂｃｏ公司　美国Ｓ．目ｍａ公司　美国Ｓ　ｍａ公司　美国Ｓｉｇｍａ公司　美国Ｓｉｇｍａ公司　

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