大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
实验五、大肠杆菌感受态细胞制备
实验五、 实验五、大肠杆菌感受态细胞制备和转化 试剂 1、LB液体培养基及不含Amp的LB平板 Amp的LB平板 平板： 2、含Amp的LB平板：熔化的LB固体培养基在 600C左右时加Amp至50-100µg/ml. 混匀后 铺板。 50mmol/L 溶液: 3、50mmol/L CaCl2溶液: 0.28g CaCl2的定容 于1000ml蒸馏水，灭菌。 15%甘油的 甘油的50mmol/L 溶液: 4、含15%甘油的50mmol/L CaCl2溶液: 0.28g CaCl2，加50ml蒸馏水,加15ml甘油，定容于 1000ml蒸馏水，灭菌。
实验五、 实验五、大肠杆菌感受态细胞制备和转化
实验五、 实验五、大肠杆菌感受态细胞制备和转化 一、 概述
在自然界条件下，很多质粒都可通过细菌结合作用 转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体上，一 般缺乏转移所必须的mob基因，因此不能自行完成从一 个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转 移进受体细胞，需诱导受体细胞产生一种短暂的感受 态以摄取外源DNA. 转化（transformation） 转化（transformation）是将外源DNA分子引入受 体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统 缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突 变体，它可以容忍外源DNA分子进入细胞体内并稳定地 遗传给后代。常用的细菌菌株如：DH5α, JM109等。
大肠杆菌感受态制备与转化实验
从平板上挑取 1 个单菌落，接种于 大肠杆菌单菌落、 平板、恒温摇 过 夜 或
10ml LB 液体培养基中，在 37℃的 摇床中振摇过夜培养
LB 液体培养基
床、接种环 12-16h
说明：（1） 一般高校实验室保存有大肠杆菌菌种，此步骤可省略。 （2）目的为大肠杆菌的分离。鉴定方法：培养后，见划线末端出现不连续的单个菌落时，表明 菌已被分离。分离后的平板可放至冰箱 4℃短期保存，供一周内使用。若需长期保存，可将甘油与 菌体的混合物放于离心管中在-20℃冷冻保存。 （3）目的为单菌落细菌的扩增。此步培养基的量可自定，适宜摇菌即可。由于学生经验不足可 能导致过夜培养效果不佳，教师应提前检查菌种培养情况以保证实验成功率，教师也可自己准备。
每 100μL 一份保存
移液枪
移液枪、离心 管
10min
说明：（1）此步骤液体培养基的量可根据具体人数而自定。公式：1.5mL（人均）×人数；对数 生长期是制备感受态细胞和进行成功转化的关键，此步即为本实验的关键。
（2）冰浴目的即让菌在最佳时期在停止生长，若实验时间有限，在能保证 OD600≤0.4~0.5， 细胞数务必＜108/mL 的前提下，此步骤可免；注意：实验所有操作都需在冰上或低温条件下进行， 否则细胞转化率会降低。
60min
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用移液枪吸取细菌的悬浮液，放到制好的平板上，用涂 移液枪、固体
（6） 布棒将细菌悬浮液涂布均匀，盖上平板，放置 10min 吸 培养基、涂布 10min
干菌液
棒
用与上两步相同的方法将未加入质粒的感受态大肠杆
（7） 菌涂布在另一块平板上，并标记两块平板
上两步总和
（8） 待溶液吸干后倒置培养基板，在 37℃下过夜培养
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
RbCl(KCl)法， CaCl2法，电击感受态制备等 RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但制备较复杂 电击感受态细胞转化效率高,但需电击仪 CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛.
一. 实验原理
1. 概念
感 受 态 细 胞
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转 化
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。 进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
4. CaCl 2 法制备感受态细胞原理
1） 感受态细胞的状态： 制备感受态细胞时不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化道理及留意事项之杨若古兰创作1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后必须导入特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操纵统称为重组DNA分子的转化.在原核生物中，转化是一个较普遍的景象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受形态有着很大的关系. 所谓的感受态：即指受体或者宿主最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理形态，是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响.cAMP 可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的感化.细胞的感受态普通出此刻对数生持久新颖幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键.制备出的感受态细胞临时不必时可加入占整体积15%的无菌甘油或-70℃保管无效期6个月.2、转化的概念及道理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法.它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研讨领域的基本实验技术之一.受体细胞经过一些特殊方法，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜的通透性发生变更，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞.进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状.大肠杆菌的转化经常使用化学法CaCl2法该法最早是由Cohen于1972年发现的.其道理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA构成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞概况，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞接收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上可选出所需的转化子.Ca2+处理的感受态细胞其转化率普通能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA可以满足普通的基因克隆试验.如在Ca2+的基础上联合其它的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO或还原剂等物资处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍.化学法简单、快速、波动、反复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保管，是以被广泛用于外源基因的转化.除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不须要事后引诱细菌的感受态，依附短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA.因操纵简便越来越为人们所接受.3、感受态细胞制备及转化中的影响身分⑴、细胞的生长形态和密度最好从-70℃或-20℃甘油保管的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液.不要用曾经过多次转接及储存在4℃的培养菌液.细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个摆布为佳.即利用对数期或对数生长前期的细菌,可通过测定培养液的OD600控制.对TG1菌株OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml摆布.应留意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的分歧而分歧.密度过高或缺乏均会使转化率降低.此外受体细胞普通应是限制-润色零碎缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株.而且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配.⑵、质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主如果超螺旋态的转化率与外源DNA的浓度在必定范围内成反比但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时则会使转化率降低.普通地，DNA溶液的体积不该超出感受态细胞体积的5%1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和.对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效力低，实验证实大于30kb的重组质粒将很难进行转化.此外重组DNA分子的构型与转化效力也密切相干，环状重组质粒的转化率较分子量不异的线性重组质粒高10~100倍，是以重组DNA大都构成环状双螺旋分子.⑶、试剂的质量所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保管于4℃.⑷、防止杂菌和杂DNA的净化全部操纵过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理.所有的试剂都要灭菌，且留意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所净化否则均会影响转化效力或杂DNA的转入.⑸、全部操纵均需在冰上进行不克不及离开冰浴否则细胞转化率将会降低.。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
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四. 问题与讨论
1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？
2.如阴性对照中长出菌，原因？
3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细 胞？各有什么优缺点？
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的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或
杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的
转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
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二. 材料，设备及试剂
1）材料 E. coli DH5α菌株； 质粒、 1.5ml 离心管（又称eppendorf管） 卡那霉素；
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注意：
1、含卡那霉素的LB固体培养基的配制:将灭菌的 LB固体培养基水浴溶解后冷却至60℃左右,加入 Kana储存液,使终浓度为100ug/ml,摇匀后到平板；
2、1小时空间：转化后温浴45min左右，让抗性基 因得以表达，再涂抗性平板
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CaCl2 (0.lmol/L)使细胞悬浮；
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5) 4℃ ,8000 rpm离心4min，弃上清液;
6) 用100μl预冷的无菌CaC12 (0.lmol/L) 重新悬 浮细胞，冰上备用；
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2. 转化
(完整版)大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(JinLab)
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin Quan-Wen Lab at XMU)一、大肠杆菌电转化感受态细胞制备：第一天：1. 用枪头或接种环挑取单克隆菌落，接种入盛有5ml LB液体培养基的培养管中，可以准备两管。
37︒C，220rpm，培养过夜（14-16个小时）。
2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）和几个50ml离心管，以备第二天离心收集细菌用。
3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细菌细胞用。
第二天：1．取2-5ml过夜培养液，接入500ml LB (或2XTY)液体培养基中, 控制起始OD600 = 0,03-0,05。
37︒C，220rpm，振摇2-4小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.4时，停止培养。
2．将菌液在冰上预冷30分钟。
同时，开启离心机，预冷至4︒C。
3．随后将菌液分装到250ml或500ml 预冷的离心瓶中，4︒C，4000rpm离心15分钟。
4．弃上清液，先用少量（如20-50ml）灭菌的冰水重悬沉淀的细胞团，然后加水稀释至离心瓶的2/3体积，充分悬起细胞（可以用手握住瓶体上部震荡！）。
4︒C，4000rpm离心15分钟。
5．弃上清液，加少量灭菌水，重悬菌体，再加水至所有细胞悬浮约500ml冰水中。
4︒C，4000rpm，离心15分钟。
6．弃上清，往离心管中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加10%甘油至终体积约为20ml。
4︒C, 4000rpm, 离心10min。
7．小心弃去上清（沉淀可能会很松散!），加入2ml 10%甘油(灭菌，预冷)重悬浮细胞。
8．将悬浮菌液以200ul/管分装于1.5ml的Ep离心管中，在液氮中快速冷冻后，于-70︒C冰箱中保存。
9．检测转化效率：取100μl新鲜制备的感受态细胞，加入0.01ng已知浓度的plasmid DNA，电转化后，将重悬在1ml SOC培养液并复苏的细胞分别取10μl (1%)和100μl (10%)涂板，估测转化效率。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
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三、试剂
1. LB固体和液体培养基 2. Amp母液 3. 含Amp的LB固体培养基 4. SOC液体培养基 5. 0.1mol/L CaCl2溶液
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【实验步骤】
一、 受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α
单菌落,接种于20 ml LB液体培养基中,37℃ 下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。 将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养1-2小时至 OD600 ＝0.5左右。
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二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10-30分 钟，然后于4℃下5000 rpm离心10分钟。
2、 弃上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶 液30ml轻轻悬浮细胞，冰上放置10分钟后， 4℃下5000 rpm离心10分钟，弃去上清。
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【思考题】
1、如何正确地设置连接和转化的各种对照？ 其意义何在？
2、如何提高连接和转编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
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实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备 与转化
【实验目的】
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原 理与技术。
学习大肠杆菌转化的原理与技术。
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【实验原理】
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转 移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般 缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完 成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
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大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化
【实验目的】
熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。
【实验原理】当大肠杆菌生长到OD600约为0.2~0.4时，用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞，细胞膨胀成球形，可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态（感受态），处于此状态的细胞称为感受态细胞（competent cells）。
此时，若在感受态细胞中加入质粒，则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面，经过42℃短暂的热激处理后，DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞，(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费送)在不含抗生素的培养基中短暂培养，使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达，在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌（含质粒）与未转化细菌分开，转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落，而未转化的细菌则不能。
(你提供质粒和细胞，我给你免费构建稳定表达细胞系Q往圣科技3452125268)【器材与试剂】(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装)1．实验仪器培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯 (标本检测，你提供标本，我免费给你做实验，成果归你享有Q往圣科技3452125268)2．实验试剂氯化钠（AR），无水氯化钙（AR），蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，800 mL蒸馏水溶解后，(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费基因慢病毒包装)。
用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min；
LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。
若配制选择性培养基，当温度降至60℃左右时，加入1 mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min，4℃保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素钠0.5 g，用蒸馏水溶解并定容至5 mL，用微孔滤器过滤除菌后，分装于Eppendorf管中，-20℃保存。
(Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒加慢病毒包装)3.实验材料E.coli DH5α, pUC18质粒
【实验步骤】
1．接种大肠杆菌单菌落于2 mL LB液体培养基中，37℃振荡（约250r/min）培养过夜。
2. 将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37℃继续振荡培养至OD600约为0.2~0.4（约2 h）。
3．取1 mL培养物于一灭菌的Eppendorf 管中，冰浴放置10～30 min，4℃，1 500×g离心5 min，弃上清。
(你提供质粒和细胞，我给你免费构建稳定表达细胞系Q往圣科技3452125268)4．沉淀用0.2 mL冰冷氯化钙溶液轻轻悬浮，冰浴放置15 min，4℃，1 500×g离心5 min，弃上清。
5．沉淀再用0.2 mL氯化钙溶液轻轻悬浮，放置在冰浴中，制成大肠杆菌感受态细胞。
6. 取5 µL pUC18质粒(不超过10 ng)，加入制好的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min。
7. 42℃热激90 s后，迅速置于冰浴5 min。
8. 加入800 µL培养基，37℃振荡（100 r/min）温育1 h，使pUC18上的氨苄青霉素抗性基因得以表达。
9. 取200 µL涂布于含氨苄青霉素钠(100 µg/mL)的LB固体培养基上, 正向放入37℃培养箱中培养1 h，再倒置培养过夜至菌落清晰，统计菌落数量。
【注意事项】(标本检测，你提供标本，我免费给你做实验，成果归你享有Q往圣科技3452125268)
1．应使用处于对数生长期的大肠杆菌细胞，OD600最好不超过0.4。
2．整个实验最好在低温环境下进行，以获得较高的转化效率。
3．每次悬浮沉淀细胞要轻缓，避免剧烈振荡。