关于重组酶Cre的逆转录病毒载体的构建及鉴定

关于重组酶Cre的逆转录病毒载体的

构建及鉴定

【关键词】逆转录病毒

关键词: 重组，遗传;基因剔除;逆转录病毒;遗传载体

摘要:目的构建表达重组酶Cre的逆转录病毒载体并进行初步的体外感染研究. 方法将Cre基因片段插入到逆转录病毒载体pMx-IRES-GFP中，转染包装细胞系获得表达Cre的病毒颗粒，体外感染NIH-3T3细胞，通过绿色荧光蛋白GFP测定病毒滴度. 结果构建了表达Cre的逆转录病毒载体pMx-IRES-GFP-Cre.通过包装

细胞系得到的含有病毒颗粒的培养上清，这种培养上清具有体外感染细胞的能力，病毒滴度为105 cfu mL-1 . 结论用逆转录病毒体系表达重组酶Cre并能有效地

进行体外感染.为用这一方法在体外研究特异基因对细胞生物学行为的影响奠定基础.

Keywords:recombination，genetic;gene knockout;retro-virus;genetic vector

Abstract:AIM To construct recombinase Cre expressing retrovirus expression vector and infect the mouse host cell in vitro.METHODS Cre gene was inserted into retrovirus expression vector pMx-IRES-GFP and the packing cell line was transfected to produce retrovirus

particles.Retrovirus particles infected NIH-3T3cells in vitro，and the virus titer was determined by green lusaferase protein.RESULTS Re-combinase Cre expressing retrovirus expression vector pMx-IRES-GFP-Cre was constructed successfully，and the packing cell line was able to produce retrovirus particles.The virus titer was105 cfu mL-1 .CONCLUSION Recombinase Cre would be expressed by retrovirus expression system，and the retrovirus particles can infect the host cells effectively.This system will be helpful in studying the function of specific gene.

0 引言

Cre是P1噬菌体表达的重组酶，可以特异地识别基因组上的LoxP位点并对之进行切割和重组.任何基因的两侧含有LoxP位点（floxed基因），都可以被Cre

重组酶剪切［1］ .因此Cre-LoxP系统目前成为一种普遍应用的条件性剔除基因的方法;为了研究Cre重组酶在体外细胞水平对LoxP位点的识别和剪切的能力，我们利用逆转录病毒载体pMx-IRES-GFP表达Cre重组酶，用重组的逆转录病毒感染体外培养的细胞，从而达到携带Cre进入体外培养的细胞.

1 材料和方法

1.1 材料①细菌与质粒:大肠杆菌XL-10，质粒pSP72（Promega公司），逆转录病毒载体pMx-IRES-GFP.细胞系NIH3T3和PLAT-E（均由第四军医大学医学遗传学与发育生物学教研室韩骅教授惠赠）.②试剂:限制性核酸内切酶和修饰酶（TaKaRa公司和Gibicol公司）细菌LB培养基（Promega公司），小提质粒提取试剂盒和核酸凝胶回收试剂盒（上海华舜生物技术公司），磷酸钙共沉淀细胞转染试剂盒cellphect transfention kit（Pharmacia公司）.③仪器:37℃和30℃普通培养箱（重庆四达公司）.30℃摇床（哈尔滨东联电子技术有限公司），DNA电泳仪（北京东方仪器公司），凝胶成相系统（Alpha innate-ch公司），低温冷冻离心机（Beckman公司），倒置显微镜（Laika公司），荧光显微镜（Olympus公司）.CO2 恒温孵箱（Nuaire公司），超净工作台（Super公司）.

1.2 方法

1.2.1 构建表达Cre逆转录病毒重组DNA 用BglⅡ，SalⅠ双酶切pSP72质粒，凝胶电泳，小量胶回收以获得Cre基因片段，将其顺式插入逆转录病毒载体pMx-IRES-GFP的BamHⅠ，XhoⅠ酶切位点.转化感受态细胞扩增，小量质粒快速抽提纯化得到pMx-IRES-GFP-CreN.

1.2.2 鉴定pMx-IRES-GFP-Cre重组质粒根据质粒图谱，选用4种酶以4种方式切开pMx-IRES-GFP-Cre重组质粒，NotⅠ，BamHⅠ，NotⅠ和BglⅡ双酶

切;ClaⅠ和BglⅡ双酶切.

1.2.3 转染逆转录病毒包装细胞系包装细胞PLAT-E培养于DMEM培养液（添加有100mL L-1 胎牛血清，2mol L-1 L-谷氨酰胺及青、链霉素）中.

用Pharmacia公司的磷酸钙共沉淀法转染试剂盒（cellphect transfection kit）进行细胞转染.转染前，将1×105 细胞接种于6孔培养板中过夜培养，使细胞生长到汇合率为40%～60%.取1μg待转染DNA与试剂盒提供的CaCl2 溶液（缓冲液A）混合，室温孵育10min后，加入试剂盒提供的磷酸缓冲液（缓冲液B），立即混合后放于室温15min使沉淀形成.将形成的DNA-磷酸钙沉淀加入细胞培养液，培养12h后用培养液洗细胞，用150mL L-1 等渗甘油溶液处理细胞3min，再更换成普通培养液.继续培养48h后，收集培养上清-70℃保存.

1.2.4 体外用逆转录病毒颗粒感染细胞逆转录载体转染包装细胞系PLAT-E，收集培养上清直接加入到NIH3T3细胞的培养上清中，培养3d，用40mL L-1 多聚甲醛固定，荧光显微镜下观察并照相.

2 结果

2.1 重组质粒构建及初步鉴定将Cre基因插入到逆转录病毒载体pMx-IRES-