关于重组酶Cre的逆转录病毒载体的构建及鉴定

关于重组酶Cre的逆转录病毒载体的构建及鉴定【关键词】逆转录病毒关键词: 重组，遗传;基因剔除;逆转录病毒;遗传载体摘要:目的构建表达重组酶Cre的逆转录病毒载体并进行初步的体外感染研究. 方法将Cre基因片段插入到逆转录病毒载体pMx-IRES-GFP中，转染包装细胞系获得表达Cre的病毒颗粒，体外感染NIH-3T3细胞，通过绿色荧光蛋白GFP测定病毒滴度. 结果构建了表达Cre的逆转录病毒载体pMx-IRES-GFP-Cre.通过包装细胞系得到的含有病毒颗粒的培养上清，这种培养上清具有体外感染细胞的能力，病毒滴度为105 cfu mL-1 . 结论用逆转录病毒体系表达重组酶Cre并能有效地进行体外感染.为用这一方法在体外研究特异基因对细胞生物学行为的影响奠定基础.Keywords:recombination，genetic;gene knockout;retro-virus;genetic vectorAbstract:AIM To construct recombinase Cre expressing retrovirus expression vector and infect the mouse host cell in vitro.METHODS Cre gene was inserted into retrovirus expression vector pMx-IRES-GFP and the packing cell line was transfected to produce retrovirusparticles.Retrovirus particles infected NIH-3T3cells in vitro，and the virus titer was determined by green lusaferase protein.RESULTS Re-combinase Cre expressing retrovirus expression vector pMx-IRES-GFP-Cre was constructed successfully，and the packing cell line was able to produce retrovirus particles.The virus titer was105 cfu mL-1 .CONCLUSION Recombinase Cre would be expressed by retrovirus expression system，and the retrovirus particles can infect the host cells effectively.This system will be helpful in studying the function of specific gene.0 引言Cre是P1噬菌体表达的重组酶，可以特异地识别基因组上的LoxP位点并对之进行切割和重组.任何基因的两侧含有LoxP位点（floxed基因），都可以被Cre重组酶剪切［1］ .因此Cre-LoxP系统目前成为一种普遍应用的条件性剔除基因的方法;为了研究Cre重组酶在体外细胞水平对LoxP位点的识别和剪切的能力，我们利用逆转录病毒载体pMx-IRES-GFP表达Cre重组酶，用重组的逆转录病毒感染体外培养的细胞，从而达到携带Cre进入体外培养的细胞.1 材料和方法1.1 材料①细菌与质粒:大肠杆菌XL-10，质粒pSP72（Promega公司），逆转录病毒载体pMx-IRES-GFP.细胞系NIH3T3和PLAT-E（均由第四军医大学医学遗传学与发育生物学教研室韩骅教授惠赠）.②试剂:限制性核酸内切酶和修饰酶（TaKaRa公司和Gibicol公司）细菌LB培养基（Promega公司），小提质粒提取试剂盒和核酸凝胶回收试剂盒（上海华舜生物技术公司），磷酸钙共沉淀细胞转染试剂盒cellphect transfention kit（Pharmacia公司）.③仪器:37℃和30℃普通培养箱（重庆四达公司）.30℃摇床（哈尔滨东联电子技术有限公司），DNA电泳仪（北京东方仪器公司），凝胶成相系统（Alpha innate-ch公司），低温冷冻离心机（Beckman公司），倒置显微镜（Laika公司），荧光显微镜（Olympus公司）.CO2 恒温孵箱（Nuaire公司），超净工作台（Super公司）.1.2 方法1.2.1 构建表达Cre逆转录病毒重组DNA 用BglⅡ，SalⅠ双酶切pSP72质粒，凝胶电泳，小量胶回收以获得Cre基因片段，将其顺式插入逆转录病毒载体pMx-IRES-GFP的BamHⅠ，XhoⅠ酶切位点.转化感受态细胞扩增，小量质粒快速抽提纯化得到pMx-IRES-GFP-CreN.1.2.2 鉴定pMx-IRES-GFP-Cre重组质粒根据质粒图谱，选用4种酶以4种方式切开pMx-IRES-GFP-Cre重组质粒，NotⅠ，BamHⅠ，NotⅠ和BglⅡ双酶切;ClaⅠ和BglⅡ双酶切.1.2.3 转染逆转录病毒包装细胞系包装细胞PLAT-E培养于DMEM培养液（添加有100mL L-1 胎牛血清，2mol L-1 L-谷氨酰胺及青、链霉素）中.用Pharmacia公司的磷酸钙共沉淀法转染试剂盒（cellphect transfection kit）进行细胞转染.转染前，将1×105 细胞接种于6孔培养板中过夜培养，使细胞生长到汇合率为40%～60%.取1μg待转染DNA与试剂盒提供的CaCl2 溶液（缓冲液A）混合，室温孵育10min后，加入试剂盒提供的磷酸缓冲液（缓冲液B），立即混合后放于室温15min使沉淀形成.将形成的DNA-磷酸钙沉淀加入细胞培养液，培养12h后用培养液洗细胞，用150mL L-1 等渗甘油溶液处理细胞3min，再更换成普通培养液.继续培养48h后，收集培养上清-70℃保存.1.2.4 体外用逆转录病毒颗粒感染细胞逆转录载体转染包装细胞系PLAT-E，收集培养上清直接加入到NIH3T3细胞的培养上清中，培养3d，用40mL L-1 多聚甲醛固定，荧光显微镜下观察并照相.2 结果2.1 重组质粒构建及初步鉴定将Cre基因插入到逆转录病毒载体pMx-IRES-GFP中相应的酶切位点（Fig1）.用多种限制性内切酶进行酶切鉴定，凝胶电泳片段大小与预期的结果完全相同（Fig2）.图1 构建表达Cre的逆转录病毒质粒示意图略2.2 重组的逆转录病毒体外感染细胞用磷酸钙转染法将重组的逆转录病毒载体转入包装细胞系，正常条件下培养48h，收集培养上清，得到重组的逆转录病毒.将含有重组逆转录病毒载体的上清加入NIH-3T3细胞系培养液中，在正常条件下孵育3d.荧光显微镜观察.表达绿色荧光的细胞约占50%，病毒滴度约为105 cfu mL-1 .同时将空载体转入作为对照，荧光镜下观察绿色荧光细胞占约51%，与实验组近似.3 讨论Cre-LoxP系统是目前一种普遍应用的条件性剔除基因的方法.这一方法是首先培育在目的基因的两侧插有LoxP位点的小鼠，即条件剔除性小鼠［2］，同时培育Cre转基因小鼠，两种小鼠交配后即可得到被Cre切除了目的基因的小鼠.为了研究Cre重组酶在体外细胞水平对LoxP位点的识别和剪切的能力，以及在体外研究条件性剔除的基因对细胞增殖分化的影响，我们利用逆转录病毒载体表达Cre重组酶，并在体外感染培养的细胞，从而达到携带Cre进入体外培养的条件剔除基因的小鼠的细胞中［3］ .图2 酶切鉴定质粒电泳图略我们首先构建了可表达Cre的逆转录病毒质粒，这一载体含有一个绿色荧光蛋白的基因（GFP），可以和Cre同时独立表达［4，5］ .表达了GFP的细胞在荧光显微镜下呈现为绿色，这样的细胞也同时能够表达Cre.因此，能够对Cre表达的情况进行观察.结果表明我们建立的这一系统能够在体外有效地感染小鼠细胞系NIH3T3，病毒滴度约为105 cfu mL-1 .与其他类型的外源基因转导的方法相比，反转录病毒系统具有转导效率高优点［6，7］ .这种逆转录病毒载体系统建立成功后，可以通过这种方法便捷地观察剔除了目的基因的细胞的生物学变化.总之，利用逆转录病毒载体将外源基因导入细胞中是目前一种效率高操作简便的方法.我们利用逆转录病毒载体表达重组酶Cre，并初步验证了它的感染效率，为这一系统在体外研究特异基因对细胞生物学行为的影响奠定基础.参考文献［1］Xu X，Li C，Garrett-Beal L，Larson D，Wynshaw-Boris A，Deng CX.Direct removal in the mouse of a floxed neo gene from a three-loxp conditional knockout allele by two novel ap-proaches ［J］.Genesis，2001;30（1）:1-6.［2］Huelsken J，Vogel R，Erdmann B，Cotsarelis G，BirchmeierW.Beta-Catenin controls hair follicle morphogenesis and stem cell differentiation in the skin ［J］.Cell，2001;18，105（4）:533-545.［3］Le Y，Sauer B.Conditional gene knockout using Cre recombi-nase ［J］.Mol Biotechnol，2001;17（3）:269-275.［4］Gagneten S，Le Y，Miller J，Sauer B.Brief expression of a GFP cre fusion gene in embryonic stem cells allows rapid retrieval of site-specific genomic deletions ［J］.Nucleic Acids Res，1997;25（16）:3326-3331.［5］Rossant J，McMahon A.”Cre”-ating mouse mutants A meeting review on conditional mouse genetics ［J］.Genes Dev，1999;13（2）:142-145.［6］Zhukova E，Sinnett-Smith J，Rozengurt E.Protein kinase D po-tentiates DNA synthesis and cell proliferation induced by bombesin，vasopressin or phorbol esters in Swiss3T3cells ［J］.J Biol Chem，2001;276（43）:40298-40305.［7］Lois C，Refaeli Y，Qin X，Van Parijs L.Retroviruses as tools to study the immune system ［J］.Curr Opin Immunol，2001;13（4）:496-504.。