两株副溶血弧菌噬菌体的分离鉴定及裂解性能_彭勇

目前，弧菌 病 的 防 治 方 法 主 要 是 采 用 抗 菌 药 物 防 治 ，同 时 还 有 免 疫 防 治 、生 物 防 治 等［１］。 抗 菌 药 物 的 大 量 使 用 ，不 仅 污 染 了 养 殖 环 境 ，还 导 致 了 致 病 菌 耐药性不断增强及养殖动物抗病能力的下降。免疫 防治的研究 刚 刚 起 步，且 疫 苗 制 备 麻 烦、成 本 高，难 以大规模应用。生物防治可大量减少抗菌素及杀虫 剂 的 使 用 量 ，保 护 生 态 环 境 ，降 低 病 原 微 生 物 抗 药 性 的 产 生 。 作 为 一 种 安 全 、绿 色 的 治 疗 方 法 ，已 经 越 来 越受到人们的关注，具有广泛的推广和应用前景。
染复数均较小，潜伏期均较短，ＶＰｐ２的裂解 量 只 有 １１．１，而 ＶＰｐ３ 的 裂 解 量 可 达 ４５．３，是 符 合 条 件 的
潜 伏 期 短 裂 解 量 大 的 噬 菌 体 ，可 进 一 步 应 用 于 噬 菌 体 治 疗 及 检 测 等 。
关 键 词 ：副 溶 血 弧 菌 噬 菌 体 ；酶 切 ；鉴 定 ；裂 解 性 能
取效价达到１０９ ｐｆｕ／ｍＬ 以 上 的 噬 菌 体 增 殖 液 １ ｍＬ，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 ５９ ｍｉｎ（室 温 ），吸 去 上 清 液，收集噬菌体颗 粒，采 用 ＵＮＩＰ－１０ 柱 式 细 菌 基 因 组提取试 剂 盒 （上 海 生 工）提 取 噬 菌 体 的 核 酸。 所 提取的噬菌体核酸溶液置于 －２０°Ｃ 保存。琼 脂 糖
Ⅲ ３７°Ｃ 酶切１ｈ，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。 按照 Ｈｉｎｄ Ⅲ的使用说明，并稍加改进，反应体
系：噬菌体 ＤＮＡ １６μＬ，１０×Ｍ Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ，限制 性 内 切 酶 ２μＬ。 １．２．８ 噬 菌 体 的 电 镜 观 察
采用 磷 钨 酸 负 染 法［７－８］，取 ２０μＬ 效 价 达 １０１０ ｐｆｕ／ｍＬ 的噬菌体液，滴在铜 网 上，自 然 沉 淀 ２～３ ｍｉｎ，用 滤 纸 从 侧 面 吸 去 多 余 液 体 ，在 铜 网 上 加 一 滴 ２％的磷钨 酸，染 色 １０ ｍｉｎ，用 滤 纸 从 侧 面 吸 取 染 液 ，干 燥 后 进 行 电 镜 观 察 并 拍 照 。
将采集 的 样 品 经 ５０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 １０ ｍｉｎ 后， 取上清液５ｍＬ 加入５ｍＬ 双倍浓缩的 ２２１６Ｅ 液体 培养基中，同时加入１００μＬ 对数期的 ＶＰ１７８０２，３７ °Ｃ 过夜培养。次日，５０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 １０ ｍｉｎ，取 上 清液过０．２２μｍ 的微孔滤膜，得 到 噬 菌 体 原 液，冰 箱４°Ｃ 保存。
采用双层平板法，用 灭 菌 的 ＳＭ 缓 冲 液 对 噬 菌 体 原 液 进 行 适 当 稀 释，将 １００ μＬ 对 数 期 的 ＶＰ １７８０２与 １００μＬ 的 噬 菌 体 稀 释 液 分 别 加 入 ５ ｍＬ 的２２１６Ｅ 半固体 培 养 基 中，混 匀，倒 入 事 先 制 好 的 ２２１６Ｅ 固 体 琼 脂 上，制 成 双 层 平 板。 待 凝 固 后 倒 置，并于３７°Ｃ 恒温箱中培养。 １．２．２ 噬 菌 体 的 纯 化
株不同的噬菌体。其核酸均是线型双链 ＤＮＡ，均具有正二十面体的头部 及 较 长 的 尾 部，且 均 属 肌 尾 科
噬菌体。ＶＰｐ２头部直径约６４ｎｍ，尾长约１１４ｎｍ。ＶＰｐ３ 头 部 直 径 约 ８９ｎｍ，尾 长 约 １０６ｎｍ。 裂 解
性能研究结果表明，ＶＰｐ２、ＶＰｐ３在双层平板 上 均 能 形 成 清 晰 透 亮 的 噬 菌 斑。 其 裂 解 谱 相 同。 最 佳 感
采集青岛市南山水产品交易市场的污水及青 岛 海 边 海 水 ，分 离 得 ２ 株 噬 菌 体 。 １．１．３ 培 养 基
２２１６Ｅ 培养基，购自青岛高科园海博生物技 术 有限公司。
收 稿 日 期 ：２０１２－０２－２４； 修 回 日 期 ：２０１２－０４－１３． 基 金 项 目 ： 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 （３１０７１５４０）；国 家 高 等 学 校 博 士 学 科 点 专 项 科 研 基 金 资 助 项 目 （２０１００１３２１１００１３）． 作者简介：彭勇（１９８７－ ），男，硕 士 研 究 生；研 究 方 向：食 品 质 量 与 安 全．Ｅ－ｍａｉｌ：ｐｅｎｇｙｏｎｇｐｙ５２０＠１６３．ｃｏｍ．通 讯 作 者：王 静 雪
按照感染复数分 别 为 １０、１、０．１、０．０１、０．００１、 ０．０００ １、０．０００ ０１、０．０００ ００１的比例，分 别 将 噬 菌 体１００μＬ ＶＰｐ２、ＶＰｐ３与１００μＬ ＶＰ １７８０２ （３× １０７ｃｆｕ／ｍＬ ）加入１０ｍＬ ２２１６Ｅ 液 体 培 养 基 中，３７ °Ｃ 振荡培养１０ｈ，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ去除 菌 体，去掉沉淀，上清液用０．２２μｍ 的膜过滤，用双 层 平 板 法 测 定 噬 菌 体 的 效 价 ，效 价 最 高 的 感 染 复 数 为最佳感染复数。
中 图 分 类 号 ：Ｑ９３
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１００３－１１１１（２０１２）１１－０６４５－０６
弧 菌 病 是 由 弧 菌 属 （Ｖｉｂｒｉｏ）细 菌 引 起 的 一 类 细 菌性疾病，已 成 为 海 水 养 殖 业 的 主 要 病 症 之 一，该 病发病迅速、流行范围广、致 病 性 强，给 国 家 和 企 业 造成了巨 大 的 经 济 损 失。 目 前，国 内 外 已 经 报 道 的弧菌病 病 原 主 要 有 副 溶 血 弧 菌 （Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏ－ ｌｙｔｉｃｕｓ）、鳗弧菌（Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ））、溶 藻 弧 菌 （Ｖ． ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、哈 维 氏 弧 菌 （Ｖ ．ｈａｒｖｅｙｉ）、创 伤 弧 菌 （Ｖ．ｖｕｌｎｉｆ ｉｃｕｓ）和河流弧菌（Ｖ．ｆ ｌｕｖｉａｌｉｓ）等 。 ［１］ 副溶血性弧 菌 的 主 要 感 染 对 象 是 对 虾、海 水 鱼 类、 文 蛤 （Ｍｅｒｅｔｒｉｘ ｍｅｒｅｔｒｉｘ）、牡 蛎 （Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ）等 ，感 染蟹类、贝类会引起 大 量 死 亡 。 ［２］ 人 体 食 用 被 感 染 的海产品会 引 起 腹 痛、呕 吐、腹 泻、肠 痉 挛、恶 心 和 发烧等典型胃肠炎反应 。 ［３］
用接种针从上述出现噬菌斑单斑的双层平板 上挑取一个单斑到１ｍＬ 的 ＳＭ 缓冲液中，混匀，冰 箱４ ℃过夜。次日，用灭菌的 ＳＭ 缓冲 液 将 上 述 噬 菌体液进行 适 当 稀 释，取 １００μＬ 的 噬 菌 体 稀 释 液 与１００μＬ 对 数 期 的 ＶＰ １７８０２ 混 合，３７°Ｃ 恒 温 放 置３０ｍｉｎ，再与５ｍＬ 半 固 体 培 养 基 混 匀 倒 入 事 先 制好的固 体 琼 脂 平 板 上 制 成 双 层 平 板，待 凝 固 后 倒置，并于３７°Ｃ 恒温箱中培养。 重复双层平板纯 化操作５次得到生物学纯的噬菌体株系 。 ［６］ １．２．３ 噬 菌 斑 的 形 态 观 察
噬菌体是感染细菌和放 线 菌 的 病 毒，是 生 物 防 治的主要 手 段 。 ［４］ 噬 菌 体 分 为 烈 性 噬 菌 体 和 温 和 噬菌体两类，烈性噬菌体可以 通 过 酶 的 作 用 破 坏 细
菌的细胞壁，专一性裂解 宿 主 菌。 笔 者 自 水 产 品 交 易市场的污水及青岛岸边海水中分离出两株副溶 血 弧 菌 噬 菌 体 ，在 双 层 平 板 上 培 养１２ｈ 均 出 现 了 清 晰的噬菌斑，均属烈性噬 菌 体。 并 对 其 进 行 了 初 步 的分类鉴定及裂解性能的 研 究，有 望 在 治 疗 副 溶 血 弧菌引起的弧菌病方面做进一步应用。
１ 材 料 与 方 法
１．１ 材 料 １．１．１ 菌 种
分离噬 菌 体 使 用 的 菌 种 为 副 溶 血 弧 菌 １７８０２ （简称 ＶＰ １７８０２），最初由 Ｆｕｊｉｎｏ等［５］于１９５３年从 日本一个食物中毒患者体内初次分离得到。购自 美国典型微生物菌种保藏中心。
测定 噬 菌 体 裂 解 谱 使 用 的 菌 种 ＶＰ ＶＩＢ３０４、 ＶＰ ＶＩＢ４６１、ＶＰ ＶＩＢ８００来自中国海洋大学应用 微 生物 实 验 室，ＶＰ １７８０２（ｓｊ）、Ｆ３－３、１．１、１．２、２．１、 ３．２、４．１ 是 从 青 岛 岸 边 海 水 中 分 离 得 到，Ｍ１、Ｍ２ 是从青岛南．９ 噬 菌 体 裂 解 谱 的 测 定 采用双层 平 板 法，取 １００μＬ 的 噬 菌 体 稀 释 液
与１００μＬ 对 数 期 的 ＶＰ １７８０２ 混 合，３７°Ｃ 恒 温 放 置３０ｍｉｎ，再与５ｍＬ 半 固 体 培 养 基 混 匀 倒 入 事 先 制 好 的 固 体 琼 脂 平 板 上 制 成 双 层 平 板 ，待 凝 固 后 倒 置，并于３７°Ｃ 恒 温 箱 中 培 养。 根 据 噬 菌 体 的 效 价，选择形 成 ３０～３００ 个 噬 菌 斑 的 稀 释 度 来 分 析 ＶＰｐ２、ＶＰｐ３ 对 ＶＰ １７８０２（ｓｊ）、Ｆ３－３、ＶＰ ＶＩＢ３０４、 ＶＰ ＶＩＢ４６１、ＶＰ ＶＩＢ８００、１．１、１．２、２．１、３．２、４．１、 Ｍ１、Ｍ２ 这１２株副溶血弧菌的裂解谱。 １．２．１０ 噬 菌 体 最 佳 感 染 复 数 （ＭＯＩ值 ）的 测 定
副溶血弧菌噬菌体 ＶＰｐ２、ＶＰｐ３。借助噬菌斑形 态、电 镜、酶 切 等 技 术 对 其 进 行 了 分 类 鉴 定，测 定 了 其
裂 解 谱 、最 佳 感 染 复 数 、一 步 生 长 曲 线 并 研 究 其 裂 解 性 能 。 分 类 鉴 定 结 果 表 明 ，ＶＰｐ２、ＶＰｐ３ 分 别 属 于 ２
第 ３１ 卷 第 １１ 期 ２０１２ 年 １１ 月
水产科学
ＦＩＳＨＥＲＩＥＳ ＳＣＩＥＮＣＥ
Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．１１ Ｎｏｖ．２０１２
两株副溶血弧菌噬菌体的分离鉴定及裂解性能
彭 勇，王静雪，丁云娟，林 洪
（中国海洋大学 食品安全实验室，山东 青岛 ２６６００３）
摘 要：为探究副溶血弧菌的生物防治方法，自水产品市场污水 排 放 处 及 青 岛 岸 边 海 水 中 分 离 出 两 株