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cDNA-AFLP技术分离蓖麻矮化相关基因的开题报告

cDNA-AFLP技术分离蓖麻矮化相关基因的开题报告
一、研究背景
蓖麻是重要的工业油料作物，具有高产、高油、强抗旱、适应性强
等优点，因此在全球范围内得到广泛的种植。

但是，蓖麻的高度却限制
了其种植面积和产量的进一步提高。

因此，探究蓖麻矮化的相关基因，
对于提高蓖麻的产量和种植面积具有重要的意义。

二、研究目的
本研究旨在通过cDNA-AFLP技术筛选出与蓖麻矮化相关的候选基因，并进一步验证其功能，为蓖麻的育种和种植提供理论依据。

三、研究方法
1. 样品处理
从蓖麻幼苗中分离总RNA，并进行纯化和定量。

使用反转录酶转录
一链cDNA，并用扩增引物扩增cDNA。

2. cDNA-AFLP技术
使用EcoRI和MseI限制酶对cDNA进行限制性酶切，再使用EMR
和MSE扩增引物扩增AFLP片段，得到AFLP产品。

将AFLP片段分离并
进行纯化，然后进行克隆测序和比对分析，找出与蓖麻矮化相关的候选
基因。

3. 基因功能验证
将候选基因克隆到表达载体中，转化到大肠杆菌中表达检测基因功能，并利用基因敲除和基因表达调控等方法，进一步验证其功能。

四、研究意义
本研究通过cDNA-AFLP技术及其辅助方法，可以筛选出与蓖麻矮化相关的基因，为蓖麻种植和育种提供理论基础。

同时，研究方法也可以为其他作物的功能基因研究提供借鉴和参考。

cDNA-AFLP实验流程v2.0

不同发育期油菜种子cDNA-AFLP实验流程Ver 2.0一、总RNA提取1. 采集花后不同日期的油菜种子2. 用具RNase灭活处理（玻璃器皿：160℃烘烤2h；塑料制品：DEPC水浸泡过夜，高压灭菌）3. 液氮下研磨样品，分装100mg/管，-80℃保存4. 每100mg样品加入1ml Trizol，混匀，室温温育5min5. 加入200μl氯仿，剧烈震荡6. 4℃，12000rpm离心15min，上层水相转移至新管7. 加入0.5倍体积异丙醇，室温静置10min8. 4℃，12000rpm离心15min，弃上清，加入200μl 75%乙醇，重悬洗涤沉淀2次9. 4℃，12000rpm离心15min，弃上清，吸尽乙醇，超净台内吹干（不要干透）10. 加入50μl水溶解，-80℃保存。

1%琼脂糖凝胶电泳检测提取结果注：若Trizol对种子RNA提取效果不佳，考虑改用CTAB提取二、RNA结合磁珠1.取20ul总RNA（约2ug），65℃温育10min2.加入1ul 生物素化oligo(dT)引物（700ug/ul），1.1ul 20×SSC，轻轻混匀至完全冷却至室温3.重悬磁珠，磁力架收集，弃上清。

4.用300ul 0.5×SSC重悬磁珠，磁力架收集，弃上清。

洗三次5.将清洗后的磁珠重悬于100ul 0.5×SSC中6.取10ul磁珠，置于管中，加入结合oligo(dT)引物的RNA，室温温育10min，保持磁珠悬浮7.磁力架收集磁珠，100ul 0.1×SSC清洗四次三、cDNA合成1. cDNA第一链合成：按下表加样，42℃温育2h磁珠--- biotinylated oligo(dT) primer (700μg/μl)1μl H2O 24μl 5× First Strand Buffer 8μl0.1M DTT 4μleach 10mM dNTP mix 2μl 2.5mM Superscript II (200U/μl) 1μl M-MLV RTase, RNase H-Final V olume 40μl 或20ulT10E0.1重悬磁珠，H2O 4ul5× First Strand Buffer:(-20℃)250mM Tris-HCl (pH 8.3)15mM MgCl2375mM KCl2. 磁力架收集磁珠，仔细吸弃上清，用5×第二链buffer平衡磁珠，磁力架收集，弃上清3. cDNA第二链合成：按下表加样，12℃温育1h，22℃温育1h磁珠--- 5× Second Strand Buffer 20μl 10×buffer：10μl10mM dNTP mix 2μl0.1M DTT 4μlE.Coli DNA ligase (10U/μl) 1μl 10UDNA Polymerase I (10U/μl) 3μl 30U RNase H (5U/μl) 1μl 5U H2O 69μl Final V olume 100μl或20ulT10E0.1重悬磁珠，H2O 49ul5× Second Strand Buffer: (-20℃)7.0)(pH100mMTris-HCl20mM MgCl2450mMKCl750μM NAD+50mM (NH4)2SO44. 磁力架收集磁珠，仔细吸弃上清，用1×RL-Buffer清洗磁珠，磁力架收集（或20ulT10E0.1清洗）四、Bst YI 酶切1. 向磁珠加入10U BstYI (1μl，10U/μl)，4μl 10×RL-Buffer，35μl H2O，共40μl，混匀。

应用cDNA_AFLP技术分离应答BABA诱导的番茄抗病相关基因

第33卷第1期湖南农业大学学报(自然科学版) Vol.33 No.1 2007年2月Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) Feb．2007文章编号：1007-1032(2007)01-0032-05应用cDNA-AFLP技术分离应答BABA诱导的番茄抗病相关基因李大志1，2，陈霄2，邓子牛1，杨宇红2，熊兴耀1，谢丙炎2*(1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南长沙 410128；2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081)摘要：应用cDNA-AFLP技术研究番茄根部组织应答BABA(β-Aminobutyric Acid，β-氨基丁酸)诱导后基因转录谱，得到与植物获得性抗性相关的差异表达片段29条，克隆测序后获得10个上调基因片断．经过生物信息学分析和功能预测，其同源基因都是植物体在抗病、抗逆反应中的表达序列标签．根据功能可将其分为5类：第1类是防御反应基因，为病程相关蛋白基因P69家族成员，具有蛋白水解酶功能；第2类是转运蛋白基因，负责细胞内外离子、水和小分子物质的跨膜运输；第3类是信号传导蛋白，是Ca2+信号传导途径上重要的功能蛋白；第4类是分子伴侣蛋白BIF1，协助蛋白质的复性；第5类属功能未知基因．研究表明：BABA诱导植物根部抗病机制涉及植物多方面生理生化反应，由多个功能不同基因共同参与控制．差异表达片段的获得将有助于下一步全长抗病基因的克隆和BABA诱导植物抗性机制的研究．关键词：cDNA-AFLP技术；β-氨基丁酸；抗病基因；获得性抗性；差异表达片段中图分类号：S436.41 文献标识码：AIsolation of genes induced by β-aminobutyric acid from Lycopersicon esculentumLI Da-zhi1，2，CHEN Xiao1，Deng Zi-niu2，YANG Yu-hong1，XIONG Xing-yao2，XIE Bing-yan1*(1.College of Horticulture and Landscape，HNAU，Changsha 410128，China；2.Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China)Abstract：cDNA amplified fragment length polymorphism analysis(cDNA-AFLP) was used to display transcripts whose expression is rapidly altered during the treatment of soil drench of BABA to tomato(Lycopersicon esculentum) roots．Among 5 000 transcript-derived fragments，23 showed increased abundance and 6 showed decreased abundance．By cloning and sequencing，10 gene fragments were obtained．BLAST search results showed that these TDFs could be divided into 5 groups．The first group are such as pathogenesis-related proteins(PR)，BIF13，BIF 14 are members of a PR protein family P69．Second group are transporters，BIF 2，BIF 3，6，17，BIF 4 have homologies to genes all responsible for transduction across membrane system of little molecular materials such as H2O，Ca2+ and anti-fungal agents．The third group is signal transduction proteins，BIF5 was found to have a high homology to Ca2+-binding protein which is an important element in Ca2+ signaling pass way．The forth group is molecular chaperone protein，BIF1 help keep activity of certain proteins under stress condition．The fifth groups which include BIF10，BIF 11，BIF 12，are those that have no homology to known genes．Key words：cDNA-AFLP；β-Aminobutyric acid；resistance gene；SAR；differentially expressed cDNA fragments近20年来，随着中国农业的飞速发展，作物病害的发生也日趋严重，造成的损失无法估量．生产上主要采用的高毒、高残留农药对产品和环境造成的严重污染，已成为制约中国无公害农产品生产可持续发展的突出问题．BABA(β-Aminobutyric Acid，β-氨基丁酸)是从经暴晒的番茄根系中分离得到的一种次生代谢非蛋白氨基酸，1960年首先在番茄上发现其能诱导对晚疫病(Phytophthora infestans)的抗性[1]．多年研究表明，BABA具有高效、广谱的诱抗活性，可诱导茄科、葫芦科、菊科、豆科、十字花科、禾本科、锦葵科、蔷薇科等一年生或多年生、单子叶或双子叶植物抵抗由卵菌、真菌、细菌、病收稿日期：2006-08-07基金项目：农业部蔬菜遗传与生理重点开放实验室项目(2006-8)作者简介：李大志(1972-)，男，湖南长沙人，博士研究生，湖南农业大学讲师．*通讯作者E-mail：xieby@mail.caas. ．第33卷第1期李大志等应用cDNA-AFLP技术分离应答BABA诱导的番茄抗病相关基因33毒和线虫引起的病害，保护植物的叶部、根部和果实免受病害为害[2-4]．目前，对BABA诱导抗病的分子机理还不清楚，因此，需要明确植物应答诱抗时体内转录发生改变的基因，进一步准确、全面地认知植物诱导抗病行为机制．关于真核生物发育过程中基因表达与调控的研究是近年来研究的热点之一．分析细胞或组织在不同发育时期或不同发育状态下基因表达的差异，进一步克隆分析差异表达的基因是研究基因表达调控的重要策略．近几年，涌现了许多基于PCR的寻找差别表达基因的新方法．C.W.Bachem等[5]发明的cDNA-AFLP技术近年已经成为一种重要的转录基因组学研究工具．由于其具有多态性高、信息量大，可重复性高、假阳性率低，灵敏度高，在一次试验中可以鉴定多组细胞群基因转录谱，所需RNA量较小等优点，所以，在植物抗病、抗逆、植物生长发育研究及转录图谱构建等领域被广泛用于对基因差异表达的研究[6-10]．1 材料与方法1.1 材料番茄品种丽春(Lycopersicon esculentum) cv. Li Chun，由中国农业科学院蔬菜花卉所提供．BABA 购自Sigma 公司；TRI ZOL 购自Invitrogen公司；cDNA 合成试剂盒SMART TM PCR cDNA Synthesis Kit，Agarose Gel DNA Purification Kit，pMD18-T (Code No.:D504A)载体购自北京宝日医生物技术有限公司．AFLP分析所用接头和引物由上海Sangon 公司合成，其序列如下：Mse adaptorⅠ：5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′，3′-TACTCAGGACTCAT-5′．MseⅠ预扩增引物：5′-GATGAGTCCTGAGTA A-3′．MseⅠ选择性扩增引物：5′-GA TGAGTCCTGAG TAAC(A/C/G)N-3′，N为A，T，G，C的任一碱基，(N)为选择其中碱基之一．Eco R adaptoⅠr：5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′，3′-CATCTGACGCATGGTTAA-5′．Eco RⅠ预扩增引物：5′-GACTGCGTACCAA TT CA-3′．Eco RⅠ选择性扩增引物：5′-GACTGCGTACC AATTCA(A/T)N-3′，N为A，T，G，C的任一碱基，(N)为选择其中碱基之一．1.2 方法1.2.1 取样丽春种子播种于高压灭菌的混合培养基(蛭石∶草炭∶沙土)中，2叶期后定植于经高压灭菌的无土基质(m石英沙∶m蛭石＝73)∶，至4叶期用2.5 mmol/L 的BABA溶液灌根处理，以清水作对照，在6，12，24 h后各取处理植株和对照植株8株，混合同一处理植株的4株直根根尖生长点(即每样本进行一次重复)，洗净，液氮冷冻后－70 ℃保存备用．经BABA处理的表示为B，清水表示为C，3个时间点分别以1，2，3表示，这样共获得12份样本，分别标记为B11，B12，C11，C12，B21，B22，C21，C22，B31，B32，C31，C32．1.2.2 总RNA的提取与cDNA的合成总RNA提取方法参照TRI ZOL Reagent试剂使用说明书，cDNA第一链和第二链的合成参照SMART TM PCR cDNA Synthesis Kit User Manual 方法进行．1.2.3 cDNA-AFLP转录AFLP分析参照P. V os等[11]报道的方法并略有改动，整个试验分为模板制备(酶切连接)、扩增反应、电泳和转录图谱获得3步．AFLP转录指纹图谱参照B.J. Bassam等[12]所述方法进行，并通过银染方法获得．电泳采用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，75 W恒定功率下泳动1～2 h，直到二甲苯氰染料到达胶长的2/3处．1.2.4 差别表达片断的回收、克隆与测序用刀片切取差异条带，去离子水浸泡后取上清进行重扩增．从琼脂糖凝胶上回收二次扩增差异片段，方法参照DNA回收试剂盒操作说明书．将回收产物连接于pMD18-T载体上，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，复苏后37 ℃培养过夜，挑取阳性(白斑)克隆进行菌落PCR．阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序．1.2.5 差异片段的序列同源性搜索与相似性比对对所得EST序列采用美国国家生物技术信息34 湖南农业大学学报(自然科学版) 2007年2月中心NCBI()的blastn 和blastx 两种BLAST 程序进行cDNA 差异片段的序列同源性搜索与相似性比对．2 结果分析2.1 RNA 的提取结果分离的总RNA 的纯度和完整性对于反转录合成cDNA 及后续试验都非常重要，低丰度差异表达基因的分离和RNA 的质量是试验成败的关键．本试验利用Invitrogen 公司的TRI ZOL 试剂提取总RNA ，紫外分光光度计测得D 260 nm 与D 280 nm 的比值约为1.9，表明RNA 纯度较高，1.0%琼脂糖检测rRNA 的28S 和18S 条带清晰(图1)，说明RNA 完整性较好，无降解，蛋白质和酚类物质的污染少，完全可以满足反转录cDNA ．1 21.BABA 处理；2.清水图1 番茄根组织的总RNAFig.1 RNA of tomato root2.2 cDNA -AFLP 转录图谱选取80对引物进行转录谱AFLP 分析，共检测到约5 000个清晰可见的转录基因片断．在转录谱分析中，只有同一处理的两个独立样品在AFLP 图谱中都表现出来的差异才被确定为差异并用于下一步分析，这样在图谱分析的同时完成一次重复验证，大大降低了假阳性的几率．图2显示了一个典型cDNA-AFLP 的分析图谱．在检测到的5 000个片断中，共发现23个基因片断转录水平升高，同时还发现转录水平下调的6个差异基因片断(图2)，差异带在所有显示片断中的比率为0.58%．通过转录谱分析，这些基因片断的转录形式在时间和强度上各有不同．从诱导强度A.转录图谱；B.局部放大图谱图2 E23/M47引物对12个模板扩增后银染显示的图谱Fig.2 cDNA-AFLP differential display profile created by primercombination E23/M47(A) and enlarged section of profile (B)看，转录水平差异分两类，第一类是质的差异(有或无)；第二类是量的差异(条带的深或浅)．从时效性看，某些基因的转录水平在各时间段表现出稳定的增强或抑制，而有的基因的表达在6，12 h 两个时间段发生明显变化，到第24小时时，两种处理的表达强度又恢复一致．由于cDNA-AFLP 技术显示的是在植物转录水平上的差异，因此从分析结果看，BABA 诱导的植物抗病反应是植物体一系列功能基因转录水平上发生变化的综合反应．2.3 受BABA 诱导转录上调基因片段BIFs 的分析 2.3.1 BIF 的序列测定对所有呈现转录上调的基因片断进行回收测序，最终获得了12个片断的测序结果，其他序列片断重扩增产物是几个基因片段的混合体，无法测通．这是由于电泳时分子量相近的片断在同一位置重叠，无法用电泳的方法分离，以致不能得到纯化的用于测序的片断．2.3.2 BIF 的序列同源性分析将测得的12个BIF 序列与GeneBank 数据库中的所有序列进行blastx ，blastn 比对，所得结果列于表1．C11 C12 B11 B12 C21 C22 B21 B22 C31 C32 B31 B32AB第33卷第1期李大志等应用cDNA-AFLP技术分离应答BABA诱导的番茄抗病相关基因35表1 差异片段的序列同源性比较Table 1 Sequence homology of specific DNA fragments序列名称序列长度/bp 同源序列登录号同源序列描述期望值BIF 1 118 BAC53943.1 DnaJ homolog [Nicotiana tabacum] 6e-15 BIF 2 121 DAA00879.1 PDR11 ABC transporter [Arabidopsis thaliana] 1e-12BIF 3 252 BAB03036.1 Ca2+-transporting ATPase protein [Arabidopsis thaliana] 2e-32BIF 4 200 CAA69353.1 aquaporin 1 [Nicotiana tabacum] 1e-24 BIF 5 159 Q09011 Calcium-binding protein CAST[Solanum tuberosum] 5e-21BIF 13 114 CAA71234.1 subtilisin-like protease [Lycopersicon esculentum] 1e-13BIF 14 127 AJ005172.1 L.esculentum p69e gene serine protease；subtilisin-like protease 5e-21BIF6，17 252 与BIF3相同与BIF3相同BIF 10 141 无同源性BIF 11 123 无同源性IF 12 88 无同源性对同源片断进行功能分析，发现这些同源序列大都来源于植物在抗病、抗逆活动或刺激应答时的表达标签序列．序列BIF3与拟南芥Ca2+转运ATP 酶(calcium-transporting ATPase，plasma membrane- type)的部分序列有82%的相似性，序列BIF5与马铃薯Ca2＋绑定蛋白编码序列有94%的相似性．钙离子是植物抗逆、抗病反应中重要的信号分子(messenger)．这两个基因片断可能参与了BABA诱抗反应中的信号感应或传导．序列BIF1与马铃薯热激蛋白DnaJ 的编码序具有96%的相似性，而热休克蛋白常常在植物体抗逆或抗胁迫时发挥作用．序列BIF2与拟南芥ABC运转物PDR家族成员有82%的相似性，PDR基因与植物对抗外源刺激紧密相关．序列BIF13，14与番茄枯草杆菌蛋白酶(PR－P69)基因家族两个成员P69b，P69c分别具有100%和85%的相似性，而枯草杆菌蛋白酶是病程相关蛋白的一种．序列BIF4 与烟草中的水通道蛋白具有90%的相似性，水通道蛋白负责水分的跨模运输，协调胞内离子浓度和细胞渗透压，在受到外界胁迫时其表达量会发生明显变化．上述分析证明试验中获得的TDF序列与前人得到的植物抗病、抗逆反应中表达的基因有很大的相关性．综合序列的功能分析，这10个功能独立的基因片断可以分为5种类型：(1) 防卫反应基因：BIF 13，BIF 14为预测的病程相关蛋白基因P69家族成员，它们具有蛋白水解酶功能．(2) 转运蛋白基因：BIF 2，BIF 3，6，17，BIF 4，负责细胞内外离子、水和小分子物质的跨膜运输．(3) 信号传导蛋白：BIF 5，Ca2+绑定蛋白，结合游离Ca2+，参与Ca2+信号传导．(4) 大分子蛋白相关基因：BIF 1，协助蛋白复性的分子伴侣蛋白编码基因．(5) 功能未知基因：BIF10，11，12．3 讨论3.1 cDNA-AFLP技术的利用cDNA-AFLP技术是研究基因表达的一种新方法．由于使用严格的PCR条件和加接头的方法，具有较高的重复性．它不仅可以快速简单地观察某一特定时期的基因表达，而且可以同时观察不同时期的基因表达，有利于系统研究基因表达和基因间的相互作用．另外，成本低廉也使得cDNA-AFLP技术应用范围更广泛．但是，cDNA-AFLP技术仍然存在一定的局限性．第一，获得的有意义的TDFs尽管很多，但不全面，因为不可能所有的转录片段都同时具有2个限制性内切酶的识别位点．这是由技术本身决定的．第二，试验程序繁琐，操作步步相关．第三，银染显影技术操作步骤复杂，耗时长，而荧光引物标记显示技术的成本过高．3.2 对BABA诱导植物根部抗病分子机理的探讨由于技术局限，以往关于BABA诱导抗病转录调控的分析集中在若干常见病程相关蛋白和SA信36 湖南农业大学学报(自然科学版) 2007年2月号传导路径中的几个基因上[13-14]．人们已经比较清楚地掌握了各种植物体在BABA的诱导下，几丁质酶，1，3-β-葡聚糖酶等PR蛋白基因的时空表达规律．在本研究中发现，除了过去人们所知的几个PR 基因之外，还有其他基因参与了BABA诱导的植物抗病反应．基于同源性比对的结果，大部分序列的同源基因普遍参与了植物抗病、抗胁迫应答反应．这进一步说明植物诱导抗病机制与植物抗病、抗逆机制存在相同或相似的反应途径．这些序列的大部分在植物抗病、抗胁迫的反应中普遍被诱导表达，说明了BABA介导的植物抗病反应是一个复杂生理过程，包括一系列功能不同的基因在特定时空条件下的参与，如BABA处理后负责快速应答的基因，免疫信号传导路径上的基因，以及随后参与寄主－病原物互作的功能基因，进一步证明BABA诱导植物根部抗病机制涉及植物多方面生理生化反应，由多个功能不同基因共同参与控制．4 展望笔者下一步将对这些TDFs利用Northern杂交进行基因的表达验证并获得这些基因在根、茎、叶等不同组织中时间和空间的表达规律；进一步研究在诱抗过程中，究竟是哪些转录因子调控了这些基因的大量表达，研究这些基因的上游或下游互作物质，并对一些有希望的TDFs获得基因的全长．对于这些问题的探索，有助于将这些基因的功能与时间、空间顺序性结合起来分析诱抗机制，加深对植物获得性抗性的理解，同时促进利用植物自身抗病机制来研发新的病害控制技术．参考文献：[1] Oort A J P，Van Andel O M．Aspects in chemotherapy[J]．Mededel Opz Gent，1960，25：961-992．[2] Jakab G，Cottier V，Toquin V，et al．β-Aminobutyricacid-induced resistance in plants[J]．Eur J Plant Pathol，2001，107：29-37．[3] 谢丙炎，李惠霞，冯兰香．β-氨基丁酸诱导辣椒抗疫病作用研究[J]．园艺学报，2002，29(2)：65-68．[4] 梁俊峰，谢丙炎，张宝玺．β-氨基丁酸、茉莉酸及其甲酯诱导辣椒抗TMV作用的研究[J]．中国蔬菜，2003(3)：4-7．[5] Bachem C W，van der Hoeven R S，de Bruijn S M，et al．Visualization of differential gene expression using a novelmethod of RNA fingerprinting based on AFLP：Analysisof gene expression during potato tuber development [J]．Plant J，1996(9)：745-753．[6] Bachem C W，Horvath B，Trindade L，et al．A potatotuber-expressed mRNA with homology to steroid dehydrogenases affects gibberellin levels and plant development[J]．Plant J，2001，25(6)：595-604．[7] 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蓖麻种子cDNA_AFLP反应体系的优化

华北农学报·2014，29(3):74-80收稿日期：2014－03－12基金项目：国家自然科学基金项目（30760123；31160290；31060194）；内蒙古自然科学基金项目（2010BS0511）；内蒙古人才基金项目；内蒙古民族大学市校合作项目（SXZD2012018）；内蒙古民族大学教育教学研究项目（No．2009053）作者简介：陈晓凤（1990－），女，内蒙古赤峰人，在读硕士，主要从事蓖麻分子育种研究。

通讯作者：黄凤兰（1973－），女，山东菏泽人，教授，博士，主要从事蓖麻分子育种研究。

蓖麻种子cDNA-AFLP 反应体系的优化陈晓凤1，2，黄凤兰1，2，李国瑞1，2，王文跃1，2，张智勇3，4，包春光3，4，吴春桃1，张现世1（1．内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽028000；2．内蒙古高校蓖麻产业工程技术研究中心，内蒙古通辽028000；3．内蒙古民族大学农学院，内蒙古通辽028000；4．内蒙古通辽市农业科学研究院，内蒙古通辽028015）摘要：以蓖麻种子为研究对象，优化其cDNA-AFLP 反应体系，为研究不同蓖麻材料或不同发育阶段的蓖麻种子内脂肪酸基因表达差异奠定理论基础。

试验结果表明：提取蓖麻种子总ＲNA ；将ＲNA 逆转录为cDNA ，用高频限制性内切酶Eco ＲⅠ和Mse Ⅰ进行酶切，并与Eco ＲⅠ、Mse Ⅰ接头连接，得到连接产物；连接产物稀释40倍作为预扩增模板，进行预扩增；优化选择性扩增反应体系，得到最佳反应体系为：10ˑPCＲBuffer 2．0μL 、dNTPs （10mmol /L ）1．4μL 、Mg 2+（25mmol /L ）1．4μL 、模板稀释80倍1．0μL 、E x 扩增引物（50pmol /μL ）1．2μL 、M y 扩增引物（50pmol /μL ）1．2μL 、LA Taq （5U /μL ）0．2μL 、ddH 2O 11．6μL 。

cDNA-AFLP技术在植物耐盐基因鉴定上的应用

通讯作者，ｃｈｚｈａｎｇ０７１４＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃａ
摘要
ｃＤＮＡ．ＡＦＬＰ技术是近年来广泛应用于植物基因分离与表达研究的ｍＲＮＡ指纹图谱技术，在分离植
物特异性基因等生物技术研究中发挥了巨大作用。在植物耐盐基因鉴定方面，该技术的应用处于新兴初始阶段，但己取得了诸多成效。本文在概述植物耐盐响应机制的基础上，着重对利用ｃＤＮＡ— ＡＦＬＰ技术鉴定的植物耐盐相关基因及其相应作用机制进行了阐述，并对其在植物耐盐分子生物学研究上的应用前景进行了展望。
ＨｕＳｈｕｙｉｎｇＺｈａｎｇＣｈｕｎｈｏｎｇＷａｎｇＸｉａｏｍｉｎＨｕａｎｇＴａｏＷｕＷｅｎｌｏｎｇＬｉＷｅｉｌｉｎ
ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｏｔａｎｙ，ＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅｎｄａｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ，２１００１４Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｃｈｚｈｎｇａ０７１４＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃａ
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｇａｂ．０３ｃＤＮＡ— ＡＦＬＰｔｅｃｈｎｉｑｕｅｗａｓａｋｉｎｄｏｆｍＲＮＡｉｆｎｇｅｒｐｒｉｎｔｔｅｃｎｏｈｌｏｇｙｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｉｎｐｌａｎｔｇｅｎｅｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ．Ｂｙｕｓｉｎｇｔｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｍａｎｙａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓｈａｖｅｂｅｅｎａｃｈｉｅｖｅｄｉｎｖａｒｉｏｕｓｉｆｅｌｄｓｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｉｎｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｓｐｅｃｉｉｆｃｇｅｎｅｓ．Ｉｎｐｌａｎｔｓａｌｔ．ｔｏｌｅｒａｎｃｅｓｔｕｄｙｔｈｉｓｎｅｗｌｙａｒｉｓｅｎｔｅｃｎｉｈｑｕｅｗａｓｉｎｔｈｅｉｎｉｔｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｔａｇｅａｎｄｈａｖｅｇａｉｎｅｄｓｏｍｅｂｅｔｔｅｒｅａｒｌｙｅｆｆｅｃｔｓ．Ｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆａｂｒｉｅｆｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｐｌａｎｔｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｓａｌｔｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＤＮＡ— ＡＦＬＰｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｎｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｓａｌｔ．ｔｏｌｅｒａｎｃｅｇｅｎｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｌａｔｅｄａｃｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｗｅｒｅｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ．

cDNA-AFLP

第四章抗病玉米自交系1145受肿囊腐霉菌诱导表达基因的分离与克隆植物的抗病反应涉及到入侵病原物的识别，及随后的防卫反应激活。

基因表达的变化对防卫机制的激活起重要作用。

在一些寄主—病原物互作系统中已有有关基因在转录水平变化的报导（Rushton and Somssich, 1998）。

本研究根据前面电镜观察结果，确定接种后6，12，24，48 hr为取样时间，对1145接病后在不同时间基因表达的差异进行了cDNA-AFLP分析。

1.材料和方法1.1 1145的根部接病：接病及取材方法见第三章方法。

1.2 总RNA的分离和cDNA的合成：1.2.1 热酚法提取总RNA1）管、枪头用DEPC-H2O浸泡37 ℃过夜，灭菌。

研钵、药匙150 ℃烘烤3 hr。

2）5-10g材料液氮研磨10-15 min，直至呈粉末状。

待液氮刚刚挥发马上加入已预热65 ℃的尖底离心管中，内装已混好RNA抽提buffer13 ml和苯酚7 ml。

(50ml RNA抽提buffer中含：1M Tris-HCl(pH9.0) 2.5 ml4M NaCl 1.25 ml10%SDS 5 mlDEPC-H2O 41.25 ml)3）剧烈振荡10 min。

4）加入氯仿8 ml抽提10 min，用力振荡。

5）4000 rpm，离心20 min，取上清约15 ml。

6）加等体积氯仿，混匀，4000 rpm离心15 min。

7）取上清，加1/3体积的8 M LiCl，4 ℃过夜沉淀。

8）4 ℃，10000 rpm离心20 min，留取沉淀。

9）70%乙醇洗一次，无水乙醇洗一次。

10）用DEPC-H2O 500 μl溶解RNA沉淀。

11）用Dnase处理，在500 μl RNA溶液中加入以下混合物:Rnase Inhibiter 3 μlDnase 5 μl10×Rnase-free Dnase buffer 70 μlDEPC- H2O 122 μl)37 ℃,20-30 min.12）抽提蛋白，苯酚一次，氯仿一次。

cDNA-AFLP技术在番茄及其黄化曲叶病毒互作中的应用

基因表达是遗传信息表现为生物性状的过程，是按时间和空间顺序进行的，这种表达的方式称为
基因的差异表达。研究基因差异表达的方法很
子标记技术的快速发展，研究者已经鉴定了５种不同抗ＴＹＬＣＶ的基因，分别为一１，Ｔｙ一２，一３，
出来，通过野生番茄与栽培番茄杂交可以将抗病基
一
４和一５ ” ，其中一２抗病基因被广泛应用
多，如抑制消减杂交，电子克隆技术，基因芯片和ｃＤＮＡ — ＡＦＬＰ技术等。其中ｃＤＮＡ．ＡＦＬＰ技术由于
其重复性高，假阳性低，操作方便快捷，可反映基因间表达量的差异等优势被广泛应用在植物生物胁迫和非生物胁迫等多个领域。目前许多研究者将该技术用于基因的差异表达分析，尤其在抗病相关基因方ｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍＭｉｌ１．）属于茄科
于育种实践之中。为了揭示番茄抗ＴＹＬＣＶ的机理，本文初步分析ｃＤＮＡ— ＡＦＬＰ技术在番茄（含有一２
ｅＤＮＡ — ＡＦＬＰ技术在番茄及其黄化曲叶病毒互作中的应用
袁伟，万红建，刘云飞，俞
锞，杨悦俭
２１００９５）（１．浙江省农业科学院蔬菜研究所，浙江杭州３１００２１；２．南京农业大学园艺学院，江苏南京

cdna-aflp原理

cdna-aflp原理
cDNA-AFLP（cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism）是一种用于研究基因表达的分子生物学技术。

它结合了cDNA（互补DNA）合成和AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）
技术，用于研究不同组织或条件下基因表达的差异。

cDNA-AFLP的原理涉及以下几个步骤：
1. cDNA合成，首先，从不同组织或条件下的RNA中合成cDNA。

这通常涉及使用逆转录酶（reverse transcriptase）将RNA转录成cDNA。

这样可以获取基因表达的信息，因为cDNA是由RNA转录而来的，反映了细胞中的基因表达情况。

2. cDNA片段的选择性扩增，接下来，利用AFLP技术中的限制
性内切酶对cDNA进行限制性酶切。

然后使用适配器引物（adapter primers）对酶切后的cDNA片段进行扩增。

这一步能够产生大量的cDNA片段，这些片段的长度和序列会反映出基因表达的差异。

3. 片段分析，扩增后的cDNA片段通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进
行分离和检测。

这样可以得到cDNA片段的长度和数量信息。

通过对不同样本中cDNA片段的长度和数量进行比较分析，可以发现在不同条件下基因的表达差异。

这种技术可以用于寻找与特定生物学过程或环境条件相关的基因表达差异，从而揭示基因调控的机制和生物学功能。

总的来说，cDNA-AFLP技术结合了cDNA合成和AFLP技术，能够全面地分析基因表达的差异，对于研究基因调控和生物学功能具有重要意义。

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中国农业科学2003,36(5):557-560利用ｃＤＮＡＡＦＬＰ技术分析白菜核雄性不育两用系的表达差异王永勤, 曹家树,符庆功ＲＮＡ指纹技术可以揭示基因调控在RNA水平的表现,并进一步阐明其调控方式。

Ｌｉａｎｇ等根据高等生物成熟ｍＲＮＡ带有ｐｏｌｙＡ尾巴的特性,用特异的锚定引物反转录后,进行ＰＣＲ扩增,建立了ｍＲＮＡ差异显示技术(ｍＲＮＡｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙ,ｍＲＮＡＤＤ)[1]。

但该技术存在假阳性高、重复性差、3′端引物倒数第二个碱基的简并性使得某些差异条带不能被扩增等缺点。

1996年Bachem等发展了一种新的方法,将ＡＦＬＰ用于ｍＲＮＡ表达差异分析,即ｃＤＮＡ-ＡＦＬＰ。

ｃＤＮＡ-ＡＦＬＰ指纹技术重复性高、假阳性低,可准确地反映基因间表达量的差异,可广泛用于植物分子生理过程的基因表达特性的研究[2]。

白菜(ＢｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＬ.ｓｓｐ.ｃｈｉｎｅｎｓｉｓＭａｋｉｎｏ)为典型的异花授粉作物,具有明显的杂种优势。

虽然可用自交不亲和系生产Ｆ1代种子,但由于亲本繁殖困难、自交系多代生活力下降及易受环境影响等原因,很难保证100%的杂交率,自交不亲和系的应用受到一定的制约。

雄性不育系是白菜等十字花科植物生产一代杂种的理想系统。

因此,雄性不育的选育及其应用研究倍受重视。

白菜核不育两用系自20世纪70年代培育成功以来,已在生产一代杂种中发挥了重要作用[3]。

但是,对其遗传规律的认识还停留在形态学和细胞学水平,产生雄性不育的分子机理还不清楚,获得不育系还需要通过转育、选择配合力测定等一系列工作,费时、费工,限制了雄性不育系在生产上的进一步应用[4]。

因此,从分子水平研究白菜雄性不育机理具有重要的实践和理论意义。

本研究采用ｃＤＮＡＡＦＬＰ对白菜核雄性不育两用系可育株群与不育株群的不同时期、不同部位的ｍＲＮＡ的表达差异进行比较分析,为揭示芸薹属等植物雄性不育的分子机理提供证据。

1材料与方法1.1材料以浙江大学蔬菜研究所细胞与分子生物学实验室经多代测交保存的白菜核隐性雄性不育两用系(982Ａ/Ｂ)的可育株群和不育株群为材料。

2001年9月25日播于苗床,10月25日移栽于试验田,田间管理同常规。

莲座期,取莲座叶备用,并对调查的植株编号挂牌,直到开花期调查其育性情况。

抽薹开花期,分别取叶片,小花蕾、中花蕾和大花蕾(分级标准:0.5ｍｍ以下为小花蕾,0.8～1.2ｍｍ为中花蕾,1.8ｍｍ以上到开花前为大花蕾)。

在开花期对试验材料进行育性调查,可育株与不育株分别为62株和70株,经χ2检验,符合1∶1的分离比例。

ＴＲＩｚｏｌ购自ＬＩＦＥＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ公司。

ＴａｑＤＮＡ聚合酶购自上海Ｐｒｏｍｅｇａ公司。

ｃＤＮＡ合成试剂盒ＳＭＡＲＴＴＭＰＣＲｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司。

Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ、ＢｉｓａｄｒｙｌａｍｉｄｅＴ和ＴＥＭＥＤ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。

ＡｍｍｏｎｉｕｍＰｅｒｓｕｌｆａｔｅ购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

32ＰｄＣＴＰ购自北京亚辉生物医学工程公司。

ｃＤＮＡＡＦＬＰ所用接头和引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,其序列如下:ＴａｑＩ接头:5′ ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣ3′;5′ ＣＧＧＴＣＡＣＧＧＡＣＴＣＡＴ3′ＴａｑＩ预扩增引物:5′ ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡ;ＴａｑＩ选择性扩增引物:5′ ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＮＮ(Ｎ代表ＡＴＣＧ中任意一种,Ｔ4～Ｔ19共16条引物)ＡｓｅＩ接头:5′ ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣ3′;5′ ＴＡＧＧＴＡＣＧＣＡＧＴＣ3′;ＡｓｅＩ预扩增引物:5′ ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＴＡＡＴ3′;ＡｓｅＩ选择性扩增引物:5′ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＴＡＡＴＮＮ(Ａ4～Ａ19共16条引物)。

1.2总ＲＮＡ的提取与ｃＤＮＡ的合成分别取不育株群和可育株群莲座期的叶片;开花期的叶片、茎、小蕾、中蕾和大蕾为材料,用ＴＲＩｚｏｌ抽提总ＲＮＡ,具体操作方法参照ＴＲＩｚｏｌ产品手册。

ｃＤＮＡ第一链和第二链的合成参照ＳＭＡＲＴＴＭＰＣＲｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔＵｓｅｒＭａｎｕａｌ方法进行。

1.3ｃＤＮＡＡＦＬＰ方法参照ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｄｐｗ.ｗａｕ.ｎｌ/ｐｖ/ｉｎｄｅｘ.ｈｔｍ上的ｃＤＮＡ-ＡＦＬＰＰｒｏｃｏｔｏｌ进行。

电泳采用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,1×ＴＢＥ电泳缓冲液,1700Ｖ电压电泳至二甲苯青距下部边沿10ｃｍ处停止电泳。

1.4探针标记及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交探针的标记采用宝生物工程(大连)有限公司的ＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔＶｅｒ.2试剂盒,标记方法参照说明书进行。

Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交参照Ｓａｍｂｒｏｏｋ等[5]的方法进行。

预杂交和杂交温度为60℃。

2结果与分析提取的总ＲＮＡ的电泳结果表明ＲＮＡ质量较好,符合合成ｃＤＮＡ要求。

以上述12份总ＲＮＡ为材料,合成ｃＤＮＡ,并取其中4份ｃＤＮＡ进行电泳。

结果表明,ｃＤＮＡ大小在500～5000ｂｐ之间,说明ｃＤＮＡ合成质量较好(图1 Ａ)。

2.1ｃＤＮＡ--ＡＦＬＰ技术分析白菜两用系不同部位基因的表达差异首先,进行了125对引物对白菜雄性核不育两用系小蕾的ｃＤＮＡＡＦＬＰ分析,11对引物产生11条差异条带,其中可育小蕾中特有的有8条,不育小蕾中特有的为3条。

随后,采用ｃＤＮＡＡＦＬＰ分析了莲座期叶片、开花期叶片、花茎和花蕾不同部位基因的表达差异。

结果表明,花蕾之间存在差异;莲座期叶片之间、开花期叶片之间和花茎之间无差异;叶片、花茎和花蕾之间存在差异。

图1 Ｂ为Ａ8Ｔ10引物组合在不同部位电泳结果。

2.2可育株群与不育株群不同时期花蕾表达差异的ｃＤＮＡＡＦＬＰ分析用10对引物对可育株群和不育株群的小蕾、中蕾、大蕾进行ｃＤＮＡＡＦＬＰ分析,发现有2对引物在开花期产生差异条带;其中Ａ15Ｔ17引物组合在可育株群中蕾和大蕾中产生表达特异条带;Ａ8Ｔ10引物组合在可育株群中蕾中表达丰度高于不育株群(图 2 Ａ,图 2 Ｂ);其余8对引物未发现差异条带。

2.3表达特异条带的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析为了进一步验证利用ｃＤＮＡＡＦＬＰ分析方法研究基因表达的可靠性,对Ａ8Ｔ10引物组合中,可育中蕾表达丰度有差异的条带进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ验证。

取可育株群和不育株群中蕾各20μｇ总ＲＮＡ做Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交(图2 Ｃ),其结果与ｃＤＮＡＡＦＬＰ的结果一致,表明ｃＤＮＡＡＦＬＰ技术研究植物雄性不育基因表达差异是可行的。

3讨论植物雄性不育是一个复杂的发育过程,涉及多个组织的分化和大量基因的协同表达,且多数花药发育所需的基因一旦发生突变,就会使花粉不能正常发育而导致雄性不育。

本研究中白菜不育株群和可育株群只存在1对性状的差异,即育性的差异;生长前期育性基因未表达,生长性状整齐一致;开花期育性基因表达,导致育性差异。

本试验的ｃＤＮＡＡＦＬＰ分析结果充分证明了这一点。

可直接利用ｃＤＮＡＡＦＬＰ分析技术研究基因表达特性[6]。

Ｂａｃｈｅｍ利用已知表达模式的土豆贮藏蛋白ＳＴＰＡＴＢ2基因验证ｃＤＮＡＡＦＬＰ技因表达的可行性,通过ｃＤＮＡＡＦＬＰ获得1个570ｂｐ的ＴＤＦ,测序分析证实ＴＤＦ序列与ＳＴＰＡＴＢ2基因几乎完全同源(500ｂｐ中99%以上),Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析表明两者有极为相似的表达模式。

进一步利用ｃＤＮＡＡＦＬＰ分析2个ｌｏｘＴＤＦｓ在块茎形成过程中表达方式,ＴＤＦ531先产生,其余的ＴＤＦ在块茎形成启动以后再表达,在表达时间上有很大区别。

在表达空间上两者均是块茎特有的,在茎尖上表达微弱,该分析结果同Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析的完全一致[2]。

吴敏生等[7]利用ｃＤＮＡＡＦＬＰ技术对玉米强优势组合和弱优势组合及其双亲的自交系在苗期和雄穗生长锥伸长期的基因表达进行了分析。

结果表明,该技术是研究基因表达的一种新方法,具有较高的重复性,不仅可以观察某一时期的基因表达,而且可以同时观察不同时期的基因表达。

笔者的研究结果也表明,用该方法研究基因表达的差异是可行的。

本研究表明,一些基因在可育株群中表达;一些基因在不育株群中表达。

白菜核雄性不育两用系不育株群中发生突变的基因与小孢子正常发育过程中所必需的某种物质有关,或者其间接影响小孢子发育的某种代谢,发生突变的基因的转录产物也可能正向或负向调控其它一些基因的表达。

该基因的表达一旦发生突变,会造成相关基因的不表达或表达。

本研究结果与江树业等[8]在籼稻光敏核不育、凌杏元等[9]和王学德等[10]在水稻细胞质雄性不育的研究结果相似。

利用cDNA-AFLP分析水稻根伸长过程中水分胁迫诱导基因的表达杨玲郑炳松毛传澡易可可刘非燕吴运荣吴平(浙江人学生命科学学院植物生理与生物化学国家重点实验室，杭州310029) cDNA-AFLP技术的优点在其引物较长，可使用更严谨的退火条件，因此比差别显示技术重复性更好;cDNA-AFLP还可以克服丰度问题，是高敏感的技术;芯片技术只能分析克隆了的基因的表达，而cDNA-AFLP可分析任何带有限制性酶切位点的基因的表达变化，因此也是发现新基因的有效「具。

短期旱作极显著(P<0.01)促进水稻种子根的伸长。

于旱作处理4 h, 16 h, 48 h, 72 h时取样(种子根尖0-l cm)，分别提取RNA、纯化mRNA、合成双链cDNA，用Taq I/Ase I酶切后，加接头进行预扩增和选择性扩增，经6%的聚丙烯酸胺凝胶电泳分离，银染，得到80一1000 bp的条带。

共做了100对引物组合，得到约6000个片段。

106个片段在受旱作处理的72 h过程，卜被诱汁表达，从中随机选择了16个片段，用Northern杂交证实了他们的cDNA-AFLP表达模式，说明cDNA-AFLP的结果可靠。

这106个片段全部被回收、克隆、测序，少仁运用生物信息学进行详细分析。

旱作刺激种子根的伸长生长涉及多个生化途径和生理过程。

在61个已知功能的从因中，有脱落酸合成关键酶- 9-cis一环氧类胡萝卜素双氧酶、调节水分运输的质膜水孔蛋白、细胞壁松弛剂一膨胀索、代谢调控关键点一丙酮酸脱氢酶激酶等起着贡要功能的蛋白。

根据功能把基因分为7类:巧个旅因编码膜蛋自，参与离子和分子的跨膜运输;7个参与信号的感受/传导;6个调控基因的表达;7个参与细胞壁的代谢和细胞的组织;11个与病程和胁迫反应相关;其余12个涉及C, N、核酸、氨从酸、蛋自质等代谢过程;3个是转座因子。

他们直接或间接的与旱作刺激种子根的伸长相关。

106 个基因中，27个编码未知功能蛋白，18个为未知基因，这些占总数42%的基因可能在根伸长过程中同样起若重要的作用。