猪传染性胃肠炎病毒江苏株的分离与鉴定及其S基因序列分析
猪传染性胃肠炎病毒胶体金免疫层析试纸条的研制的开题报告
猪传染性胃肠炎病毒胶体金免疫层析试纸条的研制的开题报告一、研究背景及意义猪传染性胃肠炎（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是一种由猪传染性胃肠炎病毒引起的急性胃肠炎症，导致猪崭泻、呕吐、消瘦，尤其是对幼猪的危害更为严重，经常造成大量的猪只死亡。
2013年至2014年PED在中国迅速传播，给我国畜牧业和经济带来了严重的损失。
因此，如何及早发现PED的感染情况，对于保障养猪业生产、实现养猪业的可持续发展具有重要意义。
目前，PED的诊断主要以病原学检测为基础，包括病毒抗体检测和核酸检测。
PCR、实时荧光PCR、细胞培养和酶联免疫吸附试验等被广泛用于PED的检测，但由于这些方法需要高昂的设备和专业人员，不利于现场快速诊断，因此需要开发一种简便、快速、经济、敏感和特异性较好的PED检测方法。
现有的研究表明，利用胶体金技术和免疫层析技术结合，可以制备出一种简便、快速、经济、敏感和特异性较好的PED检测方法，包括PED胶体金免疫层析试纸条。
这种试纸条不需要显微镜观察，只需要通过肉眼观察检测结果即可，能够满足现场检测的需求。
因此，本研究拟开发PED胶体金免疫层析试纸条，以期提高PED的诊断水平，为养猪业提供更好的保障。
二、研究内容及方法1. PED病毒抗原的克隆和表达：通过PCR扩增PED病毒N基因，并将其克隆到表达载体pET28a(+)中，利用大肠杆菌表达PED病毒N基因。
采用亲和层析和SDS-PAGE等方法提取纯化重组蛋白；2. PED胶体金免疫层析试纸条的研制：将制备的PED病毒N蛋白标记在胶体金颗粒表面，制备PED胶体金。
将制备的PED胶体金涂覆在膜的测试线位，根据PED病毒N蛋白的特异性，将抗PED病毒的单克隆抗体固定在纸条的测试线位上。
同时，将抗鸡IgG的单克隆抗体固定在控制线位上。
制备PED胶体金免疫层析试纸条。
3. PED胶体金免疫层析试纸条的性能评价：测量PED胶体金免疫层析试纸条的检测限、特异性和灵敏度；通过实验比较PED胶体金免疫层析试纸条和PCR、实时荧光PCR等方法的检测结果并进行统计学分析，评价PED胶体金免疫层析试纸条的准确度、去假阳性率和去假阴性率等。
猪传染性胃肠炎病因分析及治疗
哺乳仔猪在养殖管理期间，养殖环境的好坏直接影 响猪的抵抗能力，是造成像传染性肠胃炎这类病毒性疾 病传播流行的主要原因之一。尤其是寒冷季节圈舍的防 寒保暖性，一定程度上对腹泻类疾病有直接的影响。很 多养殖户在冬春季节采用封闭化、密闭化的养殖管理模 式，保证了猪舍温度适宜，但是在高密度养殖模式下， 圈舍中的空气质量很容易恶化，使空气当中蓄积大量有 毒有害气体，再加上圈舍当中的湿度相对较大，会使得 病原微生物大量滋生，从而造成传染性肠胃炎的传播。 部分养殖场在规划建造过程中，由于受到资金的限制， 圈舍规模相对较小，冬春季节没有能力做好圈舍的防寒 保暖工作，圈舍通风透光不良，仔猪很容易受到寒冷空 气的刺激，引发感冒降低身体抵抗力，抗病毒病能力也 逐渐下降。还有不少的养殖场，卫生清洁不合理，消毒 不恰当，导致整个养殖环境恶劣。对生猪养殖业来说， 猪舍是否干燥整洁，通风是否良好，空气是否顺畅，这 些都会对猪的健康生长存在直接的影响。
抗猪传染性胃肠炎病毒益生菌的分离、筛选及鉴定
魏萍， 邓玲玲， 高长春。 等． 抗猪传染性 胃肠炎病毒益生菌 的分离 、筛选及鉴定［ Ｊ 】 ． 东北农业大学学报 ， ２ ０ １ ３ 。 ４ ４ （ ３ ） ： ３ ５ － ３ ８ ．
Ｗｅ ｉ Ｐｉ ｎｇ， Ｄｅｎ ｇ Ｌｉ ｎｇ ｌ ｉ ｎｇ， Ｇａ ｏ Ｃｈ ａｎ ｇ ｃ ｈｕ ｎ， ｅ ｔ ａ１ ．Ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏｎ， ｓ ｃｒ ｅｅ ｎｉ ｎ ｇ ａｎ ｄ ｉ ｄ ｅ ｎｔ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｉ ｏｎ ｏ ｆ ａｎ ｔ ｉ － ｐ ｏｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｔ ｒ ａ ｎ ｓｍｉ ｓ ｓ ｉ ｂ ｌ ｅ ｇａ ｓ ￣ｏ ｅｎ －
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抗 猪传 染性 胃肠炎病 毒益生菌 的分离 、筛选及鉴定
魏 萍 ，邓玲玲 ，高长春 ，尹 鑫 ，陈洪振
（ 东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 １ ５ ０ ０ ３ ０）
摘
要 ：试 验从 健康 仔猪 肠道 内容物 内分 离筛选具 有抗 猪传 染性 胃肠 炎病毒 （ Ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｍｉ ｓ ｓ ｉ ｂ ｌ ｅ ｇ ａ ｓ ｔ ｒ ｏ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｉ ｔ ｉ ｓ
猪传染性胃肠炎的鉴别诊断
相 似之 处 ， 仅 仅根 据 临 床 不 能确 诊 ， 必
须 与流 行 性 腹 泻 、 猪痢 疾 、 猪 轮 状 病 毒
猪 流行 性 腹 泻 与猪 传 染 性 胃肠 炎 的流行特点 、 临床症状 、 病 理 变 化 及 病
毒 粒 子形 态都 十分 相 近 ， 很 难 区分 。 只 有 通 过 血 清 学 方 法 才 能 将 两 者 区 分 开， 如采用直接免疫荧光 、 中 和 试 验 和 间 接 酶联 免疫 吸 附试 验 等 检 测 ．方 能 鉴别。
肠绒 无萎缩或 有局部 萎缩性病 变 ．
能 分 离 出 致病 性 大肠 杆 菌 。 如及 时 治 疗 有 较好 疗 效 。
２ ＿ ５ 仔 猪 红 痢
中 图分 类 号 ： ￥ ８ ５ ８ ． ２ ８ 文 献 标 识码 ： Ｂ
文章 编 号 ： １ ０ ０ ８ — ０ ４ １ ４ （ ２ ０ １ ３ ） ０ １ － ０ ０ ７ ０ － － ０ １
成年 猪 、 后备 猪较 易感 ， 常 发 生 于 ６ ～ ２ ０ 周 龄 的 生 长育 成猪 ， ２ 月 龄 以 内 的
猪 一 般 不 易 发 病 ．有 时 也 发 生 于 成 年 公 母 猪 。 急性 型病 猪 表 现 为 排 血 色 水 样粪便 ； 病 程 稍长 时 ， 排 黑 色煤 焦 油样 稀粪 ， 并 可 发 生 突 然 死 亡 。 慢 性 型 病
久 的仔 猪 最 易 感 ，成 年 猪 及 哺 乳 仔 猪
很 少发 病 ， 无 明 显季 节性 ， 呈 散 发 性 和
感 ，但 是 哺 乳 仔 猪 和 断 奶 仔 猪 发 病 率
和 死亡 率 都 很 高 ， 育肥猪 、 后 备母猪 、
基 础 母 猪 及 公 猪 临 床 症 状 轻 微 ，死 亡
猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)研究进展
猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）研究进展猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病。
TGE首次由Doyle和Hutchingsl946年在美国报道，日本（1956年）和英国（1957年）先后报道该病，这之后欧洲、北美、亚洲等多个国家相继报道发生了TGE，现已成为一种世界性猪的疾病。
我国从60年代起就有TGE的报道，近些年来有进一步流行的趋势，尤其是冬季和早春寒冷季节常呈地方性暴发流行，给养猪业造成极大危害。
在1984年和1986年间，欧洲北美等地又报道了一种特别的TGEV自然缺失变异株-猪呼吸道冠状病毒（porcinerespiratorycoronavirus，PRCV），我国目前仍未见有该病毒的报道。
TGEV仍是现今引起仔猪发病和死亡的主要原因之一。
1992年美国猪场TGE血清阳性率为36％，大多欧洲国家猪场阳性率几乎为100％（这其中有很大部分是由PRCV引起），我国台湾地区1993年仔猪TGE的阳性率高达65％。
本文就TGEV研究进展作一综述。
1形态学特征TGEV属于冠状病毒属，是一种多形性有囊膜的病毒。
病毒粒子呈圆形或椭圆形，直径约为90-160nm，外膜上覆有花瓣状纤突，纤突长（约18～24nm）而稀疏，末端呈球状，直径10nm左右。
某些病毒粒子在以磷钨酸负染后，可见到一个电子透明中心或没有特征的核心，其内部具有一个呈串珠样的丝状物。
2理化学特性TGEV在冻存状态下很稳定，肠组织内病毒在-20℃下保存6～18个月滴度无明显下降，但病毒不耐热，加热65℃10min或56C45min即全部灭活。
粪尿中病毒粒子在5℃下存放8周、20℃下2周和35℃下24h仍具有感染性。
病毒在光、紫外线照射下迅速灭活，对乙醚、氯仿和去氧胆酸钠敏感，而在胆汁中相当稳定。
用0.05％甲醛溶液37℃处理20min即能使病毒灭活。
TGEV在pH4～8时稳定，对胰酶有抵抗力，能耐0.5％胰蛋白酶1h，但强、弱毒株对胰酶和蛋白分解酶的敏感性不同，毒株的毒力越弱，其对胰酶的敏感性越高。
抗猪传染性胃肠炎病毒重组S蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
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杂 交 瘤 细 胞 上 清 与 猪 流行 性 腹 泻 病 毒 （ Ｅ Ｖ）猪 轮 状 病 毒 （ Ｒ 、 伪 狂 犬 病 病 毒 （ ｒ 均 无 交 叉 反 应 ， Ｔ Ｖ 感 染 细 胞 ＰＤ 、 Ｐ Ｖ） 猪 Ｐ Ｖ） 与 ＧＥ 经 间 接 免 疫荧 光 检 测 均 呈 黄 绿 色荧 光 。 关 键 词 ： 传 染 性 胃肠 炎 病 毒 ；单克 隆抗 体 ； 交 瘤 ；重 组 ｓ蛋 白 猪 杂
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猪传染性胃肠炎病毒S基因转基因玉米植株的构建及鉴定
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猪传 染性 胃肠 炎病毒 Ｓ基 因转 基 因玉米植株 的构 建及鉴 定
王 龙 涛 ，葛晨 霞 ，高 雯 雯 ，付 永 平 ｚ ，徐 凤 宇 ，王 丕 武 ， 胡桂 学 －
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猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的二级结构和B细胞抗原表位的预测
猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的二级结构和B细胞抗原表位的预测高传庆;王可;黄庆华;韩虹【摘要】以TGEV(猪传染性胃肠炎病毒)基因组序列为基础,运用Gamier-Robson、Chou-Fasman和Karplus-Schulz方法预测其S蛋白的二级结构,运用Kyte-Doolittle方法对S蛋白的亲水性进行分析,并分别运用Jameson-wolf方法和Kmlrd方法预测了其抗原指数和表面可及性,最后结合吴玉章的方法综合分析预测了其B细胞抗原表位.结果显示,а螺旋数量少且分散,p折叠占据面积较大,柔性区域主要集中在N端第22～30、45～76、100～172、239～301、348～419、451～519、541～633、645～720、746～796、822～887、921～986、1052～1201、1239～1384、1434～1445区段.S蛋白可能的B细胞抗原位点是N端第20～32、44～54、69～78、97～106、635～655、781～803、949～994、1307～1 328、1 346～1 362、1 432～1 448区段,这些区段内部或附近都有柔性区域存在,可作为S蛋白的抗原优势表位.【期刊名称】《山东农业科学》【年(卷),期】2010(000)012【总页数】5页(P6-10)【关键词】猪传染性胃肠炎病毒;S蛋白;二级结构;B细胞抗原表位【作者】高传庆;王可;黄庆华;韩虹【作者单位】滨州市畜牧兽医局,山东,滨州,256600;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东,济南,250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东,济南,250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东,济南,250100【正文语种】中文【中图分类】Q518.1猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)属于冠状病毒科冠状病毒属,是引起猪传染性胃肠炎的主要病原[1],可导致 7～10日龄以内仔猪呕吐、严重腹泻和高死亡率(通常 100%),给养猪业带来巨大经济损失。
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郭容 利 ， 倪 艳秀 ， 温立斌 ， 李 彬 ， 王小敏 ， 俞 正玉 ， 何 孔 旺
（ 江 苏 省 农 业 科 学 院 兽 医研 究 所 ， 农 业部 兽 用 生 物 制 品 工 程技 术 重 点 实 验 室 ， 江苏 南 京 ２ １ ０ ０ １ ４ ）
摘要： 应用 ｓ Ｔ细 胞 ， 从 临 床 上 表 现 为 腹 泻 症 状 的 病 死 仔 猪 肠 内容 物 中 分 离 得 到 一 株 病 毒 ， 并 对 该病毒 进行 Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ， 直接免疫荧光 与动物回归等试验 ， 证 实 该 病 毒 为 猪 传 染 性 胃肠 炎 病 毒 （ Ｔ Ｇ Ｅ Ｖ） ， 命 名为 Ｊ Ｓ ２ ０ １ ２株 。 应 用 Ｐ Ｃ Ｒ 方 法 克隆出其初代（ Ｐ １ Ｔ ｓ ） 与５ Ｏ代 （ Ｐ ５ Ｏ Ｔ Ｓ ） 的 ｓ基 因 片 段 ， 进行序 列测定 ， 并 将 该 基 因 序 列 与 已发 表 的 １ ８个 不 同 来 源 的
Ｔ Ｇ Ｅ Ｖ 毒 株 进 行 同源 性 和 亲 缘 关 系 的 比 较 分 析 。 结 果 表 明 ， 各 毒 株 间 核 苷 酸 同源 性 为 ９ ６ ． ０ ％ ～ ９ ９ ． ９ ％， 氨 基 酸 的 同 源
性为９ ６ ． ５ ％～ ９ ９ ． ９ ％ 。Ｔ Ｇ Ｅ Ｖ Ｊ Ｓ ２ ０ １ Ｐ Ｉ Ｔ Ｓ株 与 中 国江 苏 省 Ｈ Ｎ ２ ０ ０ ２株 和 美 国 Ｍｉ ｌ ｌ ｅ ｒ Ｍ ６亲缘 较 近 ， 表 明不 同地 区 分 离 毒
ＹＵ Ｚｈ ｅ ｎ ｇ — ｙ ｕ， ＨＥ Ｋｏ ｎ ｇ — ｗａ ｎ ｇ
（ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ， Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｓ ｕ Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍｙ ｏ ｆ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ， Ｋｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ
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中图分类号 ： ￥ ８ ５ ８ ． ２ ８ ５ ． ３； ￥ ８ ５ ２ ． ６ ５ ９ ． ６ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ０—７ ０ ９ １ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ５—０ ０ ７ ４—０ ６
Ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ Ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ Ｔｒ ａ ｎ ｓ ｍｉ ｓ ｓ ｉ ｂ ｌ ｅ Ｇａ ｓ ｔ ｒ ｏ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｉ ｔ ｉ ｓ Ｖｉ ｒ ｕ ｓ Ｊ Ｓ ２ ０ １ ２
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株 的 ｓ基 因 差 异 不 大 ， 而与 Ｐ １ Ｔ ｓ相 比 ， Ｐ ５ Ｏ Ｔ Ｓ的 ｓ基 因 在 ｌ １ ２ ４～１ １ ２ ９位 置 有 ６个 碱 基 的 缺 失 ， 对 比发 现 ， 这 种 变 异
接 近于弱毒株 Ｐ ｕ ｒ ｄ ｕ ｅ Ｐ １ １ ５株 所 发 生 的 变 异 ， 提 示 所 发 生 的缺 失 可 能 与病 毒 毒 力 的 减 弱 相 关 。 关键词 ： Ｔ Ｇ Ｅ Ｖ； 分离鉴定 ； Ｓ 基因； 序列分析 ； 缺 失
且 Ｃ Ｔ ＾
Ｉ Ｉ Ｂ Ｒ Ｉ Ｃ ＵＬ Ｔ Ｕ Ｒ Ａ Ｅ 华 北 农 学 报 ・ ２ ０１ ３， ２ ８（ ５）： ７ ４ ． ７ ９ ＿ ● ＿ 鞠Ｌ Ｉ － ｜ Ｍｉ Ｃ ａ
猪 传 染 性 胃肠 炎 病 毒 江 苏 株 的分 离 与 鉴 定 及 其 Ｓ基 因 序 列 分 析