血清白蛋白和球蛋白的分析测定-盐析法
血清球蛋白的提纯实验报告
1. 了解血清球蛋白的组成及特性。
2. 掌握血清球蛋白的提纯方法，包括盐析法、凝胶层析法和醋酸纤维素薄膜电泳法。
3. 熟悉实验操作步骤，提高实验技能。
二、实验原理血清中的蛋白质按电泳法可分为五类：清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白和-球蛋白。
其中，-球蛋白含量约占16%，100 mL血清中约含1.2 g左右。
不同种类的蛋白质具有不同的分子量、溶解度和带电荷情况，因此可以根据这些性质的差异进行分离和提纯。
盐析法：利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中溶解度的差异进行沉淀分离。
半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离，沉淀部分即为含有-球蛋白的粗制品。
凝胶层析法：利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异进行分离。
当溶液通过Sephadex G-25凝胶柱时，分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中。
在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而达到去盐的目的。
醋酸纤维素薄膜电泳法：利用蛋白质在电场中的迁移速度差异进行分离。
纯化后的-球蛋白可利用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定其纯度。
三、实验材料1. 血清样品2. 硫酸铵3. Sephadex G-25凝胶4. 醋酸纤维素薄膜5. 电泳仪6. 显色剂7. 实验器材：离心机、移液器、烧杯、玻璃棒等1. 盐析法提纯（1）将血清样品与硫酸铵溶液混合，使硫酸铵浓度达到半饱和状态。
（2）室温下静置一段时间，待球蛋白沉淀析出。
（3）用离心机分离沉淀和上清液，收集沉淀。
（4）将沉淀用蒸馏水洗涤，去除中性盐。
2. 凝胶层析法提纯（1）将Sephadex G-25凝胶柱连接到层析柱上，用蒸馏水平衡凝胶柱。
（2）将提纯后的沉淀溶解于适量蒸馏水中，制成蛋白质溶液。
（3）将蛋白质溶液加入凝胶柱，用蒸馏水进行洗脱。
（4）收集洗脱液，检测蛋白质含量。
3. 醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定纯度（1）将收集到的蛋白质溶液制成醋酸纤维素薄膜电泳样品。
盐析法纯化免疫球蛋白
★★★★★盐析法纯化免疫球蛋白撰稿欧阳笑梅原理主要材料盐析的操作步骤影响盐析的因素(一) 原理蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。
当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。
同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
(二) 主要材料1. 试剂:(1) 正常人混合血清；灭菌生理盐水。
(2) 饱和硫酸铵溶液的配制:称(NH4)2SO4(AR)400～425克，以50～80℃之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。
冷却后以浓氨水(15N NH4OH)调PH至7.4。
配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。
(3) 萘氏试剂配制：称HgI11.5克，KI8克，加蒸馏水至50ml，搅拌溶解后，再加入20％NaOH 50ml。
(4) 0.02M, PH7.4磷酸盐缓冲盐液(Phosphate Buffered Saline PBS)配制:贮存液:A液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸馏水至1000ml；B液: 0.2M NaH2P4：NaH2P4·2H２O 3.12克，加蒸馏水至1000ml；应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。
(5) 0.1M, PH7.4磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer PB)配制:将上述A液取81ml与B液19ml混合，再以蒸馏水对倍稀释即成。
(6) 20％磺基水杨酸。
2. 器材:普通冰箱、离心机、电磁搅拌器，751桮型紫外分光光度计、扭力天平，粗天平。
透析袋、尼龙绳、细竹棒、精密PH试纸(PH5.5～9.0)、眼科镊子、小剪刀。
烧杯、量筒、吸管、滴管、灭菌小瓶、试管等。
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
第24页
DEAE－纤维素离子交换层析纯化γ－球蛋白
血清α、β、γ－球蛋白、清蛋白等电点为：
清蛋白pI=4.64，
α2球蛋白 pI=5.06， β球蛋白pI=5.12，
γ球蛋白pI=7.3
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
第28页
五、γ－球蛋白判定
用醋酸纤维素薄膜电泳方法，以血 清电泳图谱为对照，判定所分离蛋白质 种类和纯度（参见血清蛋白质醋酸纤维 素薄膜电泳）。
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
第29页
蛋白质电离示意图
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
第30页
基本原理
1、以醋酸纤维薄膜作为支持体一个电泳方法。 2、在pH8.6巴比妥缓冲液中，血清蛋白质在电场中
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
第35页
操作步骤：
1、装置电泳箱。区分电泳箱正负极 。
2、点样：浸于巴比妥溶液中薄膜，滤纸轻轻吸
干 — 半干燥态。
快
铅笔标识；点样器沾适量新鲜血清，垂直点样。
3、放入电泳槽，使膜保持水平。
4、通电：110伏，1小时。断电后，取膜。
5、染色：氨基黑10B染色5min。
6、漂洗：漂洗液浸洗3次，每次5-10min。
沉淀即为初步纯 化γ－球蛋白
倾弃上清液（主要含 α、β球蛋白）
加入0.0175mol/L磷酸缓冲液 （pH=6.3)1ml溶解
γ－球蛋白 粗提液
第9页
二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐
欲去除盐析法分离得到球蛋白粗提液中大量盐， 通常有两种方法：
凝胶层析法、透析
本试验采取葡聚糖凝胶——Sephadex G 25层析方法 除去球蛋白粗提液中盐硫酸铵，方便下一步用离子交 换层析方法深入提纯球蛋白。
血清球蛋白的分离鉴定
实训二血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定目的要求1．了解蛋白质分离提纯的总体思路。
2．掌握盐析法、分子筛层析法、离子交换层析等实验原理及操作技术。
实验原理血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量约占16％，100ml血清中约含1.2g左右。
首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。
半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。
用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。
常用的方法有透析法、凝胶层析法等。
本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。
当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。
脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。
α－球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0；γ－球蛋白的PI为7.2左右。
因此在PH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。
经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的α－球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的γ－球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。
因此随洗脱液流出的只有γ－球蛋白，从而使γ－球蛋白粗制品被纯化。
其反应式如下：用上述方法分离得到γ－球蛋白是否纯净，单一？可将纯化前后的γ－球蛋白进行电泳比较而鉴定之。
试剂和器材1．试剂（1）饱和硫酸铵溶液：称固体硫酸铵(分析纯)850g，置于1000ml蒸馏水中，在70一80℃水温中搅拌溶解。
将酸度调节至pH7.2，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。
07 生物化学实验--血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定
血清γ- 球蛋白的分离、纯化与鉴定【目的】1 ．掌握盐析 - 层析法提纯血清γ- 球蛋白的原理和技术。
2 ．熟悉电泳比较法定性γ- 球蛋白的方法。
3 ．了解扫描定量γ- 球蛋白的方法。
【原理】蛋白质的分离、纯化是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段。
根据不同蛋白质的分子量、溶解度以及在一定条件下带电荷性状的差异来分离、纯化各种蛋白质。
1 ．γ- 球蛋白的分离、纯化（ 1 ）盐析：清蛋白与球蛋白的稳定性不同，故可用盐析法对血清蛋白质初步分离。
在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心所得的沉淀即是球蛋白混合物。
（ 2 ）脱盐：球蛋白混合物中的硫酸铵会妨碍进一步分离纯化，应除去。
脱盐的方法有多种，本试验采用凝胶过滤。
在凝胶过滤中，柱中的填充料是高度水化的惰性多聚物，最常用的有葡聚糖凝胶（ Sephadex Gel ）和琼脂糖凝胶 (Agarose Gel) 等颗粒。
葡聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物，它的“ 网眼” 大小可以通过交联剂与葡聚糖的配比来达到。
不同型号的葡聚糖凝胶可用来分离和纯化不同分子大小的物质。
把葡聚糖凝胶装在层析柱中，不同分子大小的蛋白质混合液借助重力通过层析柱时，比“ 网眼” 大的蛋白质分子不能进入网格中，而被排阻在凝胶颗粒之外，随着洗脱剂在凝胶颗粒的外围而流出。
比‘ 网眼 ' 小的分子则进入凝胶颗粒内部。
这样，由于不同大小的分子所经路程距离不同而得到分离。
大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。
所以含硫酸铵的蛋白值溶液通过层析柱时，先被洗脱出层析柱的是球蛋白，小分子硫酸铵由此法分离除去（参见第 2 篇第 2 章图 2-3 ）。
（ 3 ）纯化：γ- 球蛋白与α 、β- 球蛋白（以及微量的清蛋白），等电点不同，所以采用离子交换层析，从球蛋白混合物中分离、提纯出γ- 球蛋白。
用于蛋白质分离的层析材料多是离子交换纤维素，它们的优点是对蛋白质的交换容量较一般的离子交换树脂大，而且品种较多，可以适用于各种分离目的。
血清γ-球蛋白的盐析分离
实验名称：血清γ-球蛋白的盐析分离实验目的（1）了解蛋白质分离纯化的一般方法。
（2）掌握硫酸铵盐析法从动物血清中分离γ-球蛋白。
原理中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面的双电层和水膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。
但沉淀不同的蛋白质所需盐类的浓度不同。
例如，50％饱和的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而33％饱和的硫酸铵则使γ-球蛋白沉淀。
因此，可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析。
操作方法1．取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液(0.01mol／L pH7.0)5ml，混匀，滴加(边加边搅拌)饱和硫酸铵4ml(此时溶液硫酸铵饱和度约为20％)。
静置20min以3 000r／min离心15min，沉淀为纤维蛋白(弃去)；上清液中含清蛋白、球蛋白。
2．取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml(方法同前)，此时溶液硫酸饱和度为50％，静置20min，以3 000r ／min离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。
3．倾去上清液，将沉淀溶于5ml磷酸缓冲液(0．01mol/L，pH7．0)，再加饱和硫酸铵3．2ml，此时溶液硫酸铵的饱和度约为33％，静置20min，以3 000r／min离心15rain除去上清液，沉淀即为γ-球蛋白。
4．将所得γ-球蛋白沉淀溶解于1ml磷酸盐缓冲液（0.0175mol/l，pH6.7）中备用。
试剂和器材一、试剂(1)饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取(NH4)2SO4 760g，加蒸馏水至1000ml，加热至50℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。
(2)磷酸盐缓冲溶液(0.01mol/L pH7.0，内含0.15mol／L NaCl，简称PBS)：取 0.2mol／L Na2HP04溶液30.5ml，0.2mol／L NaH2P04溶液19.4ml，加NaCl 8.58，加蒸馏水至1000ml。
(3)磷酸盐缓冲液(0.0175mol／L，pH6.7，不含NaCl，简称PB)：取0.2mol／L Na2HP04溶液43.5ml，取0，2mol/L NaH2P04溶液56.6ml混合。
蛋白盐析实验步骤及注意事项
蛋白盐析实验步骤及注意事项蛋白盐析是一种用于分离和纯化蛋白质的实验方法。
下面是蛋白盐析实验的步骤及注意事项：步骤一：样品制备1.首先，准备蛋白样品。
可以从细胞裂解物、组织提取物或培养物中获取蛋白样品。
2.制备适量的样品溶液，添加必要的缓冲剂，以调节溶液pH值，并使其适应盐析条件。
步骤二：筛选适宜的沉淀剂1.准备一系列不同盐浓度的盐溶液。
常用的盐包括氯化铵、硫酸铵等。
2.在实验过程中，可以通过比较不同盐溶液对蛋白沉淀效果的差异来确定最适宜的沉淀剂。
步骤三：盐析实验1.向样品溶液中加入适量的盐溶液，使盐浓度逐渐增加。
2.搅拌样品溶液，促进蛋白质和盐的相互作用。
3.观察样品的混浊度变化。
盐的加入会引起蛋白质沉淀，形成白色沉淀物。
4.根据样品中蛋白质的特性调整盐浓度，以达到最佳分离效果。
步骤四：沉淀物的收集1.当混浊度降低到一定程度时，停止盐的加入。
2.用离心机将样品离心，使蛋白质沉淀于离心管底部。
3.倒掉上清液，保留沉淀物。
步骤五：沉淀物的洗涤1.向沉淀物中加入适量的洗涤缓冲液，搅拌，让沉淀物重新悬浮。
2.离心样品，倒掉液体，保留沉淀物。
3.重复上述洗涤步骤，以去除残留的盐和杂质。
步骤六：沉淀物的溶解1.向沉淀物中加入适量的溶解缓冲液，用于溶解蛋白质。
2.搅拌样品溶液，在适当的温度和时间下，使蛋白质完全溶解。
步骤七：纯化蛋白质1.将溶解的蛋白质样品进行进一步的纯化方法，如色谱法、电泳法等。
注意事项：1.在整个实验过程中，应注意实验室的清洁卫生，防止外源性污染对结果的影响。
2.操作过程中应严格遵守无菌技术，以防细菌污染。
3.在制备样品溶液时，要正确配制缓冲液，以保持所需的pH值。
4.盐析实验过程中，应密切观察样品的混浊度变化，并根据需要调整盐浓度。
5.沉淀物的收集和洗涤过程应注意操作的轻柔，以避免蛋白质丢失。
6.在沉淀物的溶解过程中，可以适当调整溶解缓冲液的温度和时间，以获得最佳的溶解效果。
7.在进行蛋白质纯化时，可以根据需要选择合适的纯化方法，以去除杂质并提高纯度。
盐析法实验报告
一、实验目的1. 了解蛋白质的盐析原理及其在蛋白质分离纯化中的应用。
2. 掌握盐析法沉淀蛋白质的操作步骤和注意事项。
3. 学习通过改变盐浓度来控制蛋白质的沉淀和溶解。
二、实验原理蛋白质在溶液中处于溶解状态时，其表面带有电荷，使得蛋白质分子相互排斥，保持分散状态。
当向蛋白质溶液中加入一定浓度的盐时，盐离子会与蛋白质表面的电荷发生中和作用，减少蛋白质分子间的静电斥力，从而使蛋白质分子聚集形成沉淀。
这种现象称为盐析。
盐析法是一种常用的蛋白质沉淀方法，具有操作简单、成本低廉、条件温和等优点。
通过调节盐浓度，可以控制蛋白质的沉淀和溶解，实现蛋白质的分离纯化。
三、实验材料与仪器材料：- 牛血清白蛋白（BSA）- 氯化钠（NaCl）- 0.1mol/L盐酸- 0.1mol/L氢氧化钠- 蛋白质浓度测定试剂盒- 移液器- 离心机- 756紫外-可见分光光度计四、实验步骤1. 配制蛋白质溶液：将BSA溶解于0.1mol/L盐酸溶液中，配制成浓度为1mg/mL的蛋白质溶液。
2. 配制不同浓度的盐溶液：将氯化钠溶于蒸馏水中，配制成0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L和2.0mol/L的盐溶液。
3. 加入盐溶液：分别取1mL蛋白质溶液，加入不同浓度的盐溶液，充分混合。
4. 观察沉淀现象：观察蛋白质溶液在加入不同浓度盐溶液后的沉淀情况，记录沉淀出现的盐浓度。
5. 离心分离：将混合后的溶液以3000r/min离心10分钟，取上清液进行蛋白质浓度测定。
6. 蛋白质浓度测定：使用蛋白质浓度测定试剂盒，按照说明书进行操作，测定沉淀前后的蛋白质浓度。
五、实验结果与分析1. 沉淀现象：随着盐浓度的增加，蛋白质溶液的沉淀现象逐渐明显。
当盐浓度为0.5mol/L时，蛋白质开始出现沉淀；当盐浓度为1.5mol/L时，沉淀现象最为明显。
2. 蛋白质浓度：通过离心分离和蛋白质浓度测定，可以发现，沉淀前后蛋白质浓度基本保持不变，说明盐析过程中蛋白质未发生变性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
血清白蛋白和球蛋白的分析测定－盐析法
[目的与原理]
掌握血清白蛋白和球蛋白测定的原理和方法，并用盐析法测定水产动物血清中白蛋白和球蛋白
的含量。
血清中含有多种不同成分的蛋白质，主要为白蛋白和球蛋白。
用盐析法沉淀血清中球蛋白，用
双缩脲法测定上清液中白蛋白，同时测定血清总蛋白。
血清球蛋白的量从两者的差值求得。
[试剂与器材]
试剂：
1、球蛋白沉淀剂：称取硫酸钠（Na2SO4）208g，及亚硫酸钠（Na2SO3）70g，加入蒸馏水约900ml，并加入浓硫酸2ml，使蒸馏水酸化。
不停搅拌，待完全溶解后将溶液移入1L容量瓶内，用蒸馏水稀释至1L刻度。
保存于25℃以上的温度中。
2、双缩脲试剂：溶解1.50g硫酸铜(CuSO4.5H2O)和 6.0g酒石酸钾钠(NaKC4H4O6.4H2O)于500ml蒸馏水中，在搅拌下加入300ml 10%氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml，贮存在内壁涂以石蜡的瓶中，此试剂可长期保存。
3、标准血清：将待测样品用0.05mol/L氢氧化钠配制成适当浓度的溶液(使测定值在标准曲线范围内)，学生实验中可用酪蛋白配制或用血清样品稀释10 倍，冰箱存放待用。
4、乙醚
器材：
可见分光光度计，离心机，试管若干及试管架，旋涡混合器，塑料试剂瓶，1L容量瓶，烧杯2个，吸管若干支，滤纸，擦镜纸。
[实验步骤]
1、准确吸取血清样本0.2ml，置于10×100mm试管内。
以5ml刻度吸管加入球蛋白沉淀剂 3.8ml，塞住管口，反复倒转混和10次（不宜过多）。
以1ml 刻度吸管吸取悬液1ml （相当于血清0.05ml），置于另一试管内，作为“总蛋白测定管”。
剩余的混悬液另加乙醚约2ml，揿住管口，在约20 秒钟内颠倒混和40 次，然后经每分钟2500 转的速度离心沉淀 5 分钟。
此时试管内分成三层：上层为乙醚，中层为球蛋白，下层为澄清的白蛋白溶液。
将试管斜置在桌面片刻或轻击试管，待蛋白块自管壁分离后，将1ml吸管插入白蛋白溶液中并吸取此溶液1ml（小心，准确，且不可触及球蛋白块片）。
取出吸管，用滤纸拭去管尖可能附着的球蛋白沉淀，将白蛋白溶液加入另一试管内，作为“白蛋白
测定管”。
在另一试管内加入标准血清0.2ml及球蛋白沉淀剂 3.8ml，混和后准确吸取混悬液1ml，加入一试管中作为“标准管”。
再取一试管加球蛋白沉淀1ml，作为“空白管”
2、每管中各加入双缩脲试剂4毫升，充分混和后置室温暗处30分钟，用540nm或绿色滤光片进行比色，以空白管校正光密度到0点，读取各管光密度读数。
3、计算
将所测得的光密度读数按下列公式计算出白、球蛋白含量及其比值：
（1）总蛋白测定管光密度/ 标准管光密度×标准血清蛋白浓度（g/100ml）＝血清总蛋白g/100ml
（2）白蛋白测定管光密度/标准管光密度×标准血清蛋白浓度（g/100ml）＝血清白蛋白g/100ml
（3）血清总蛋白—血清白蛋白＝血清球蛋白g/100ml
（4）血清白蛋白÷血清球蛋白＝血清白蛋白、球蛋白比值（A/G）
4、标准曲线绘制：同血清（浆）总蛋白测定双缩脲法见《血清（浆）总蛋白测定》。
但用球蛋白沉淀剂代替生理盐水作为标准血清的稀释剂。
[方法评估]
本方法采用盐析法定量测定白蛋白和球蛋白的，用硫酸钠和亚硫酸钠分离血清白、球蛋白，所得结果与电泳法相符合。
但由于盐类浓度较高，操作需在较高的温度下进行，否则将有结晶析出。
在25°C操作时，无结晶析出。
用亚硫酸钠作为沉淀剂除可在较低的温度操作外，还有另一个优点，即它具有缓冲作用。
亚硫酸钠溶液呈碱性，其pH值高于所有血清蛋白的等电点，使各蛋白质均带有相同的电荷，这将有利于它们的分离。
血清经盐析分离后,蛋白质的测定一般均用比色法.
[应用意义]
白蛋白和球蛋白的量是按鱼种不同而有所变化，一些鱼白蛋白＞球蛋白，另一些鱼白蛋白＜球蛋白，白蛋白与球蛋白的成分按性别、年龄、成长、季节的变化，营养不良、饥饿、应激刺激等所发生变化。
[注意事项]
1、某些用乙醚及离心沉淀不易得到白蛋白澄清液的标本，在加入球蛋白沉淀剂后，可不加乙醚而用优质小张中速滤纸在370C水浴箱中反复过滤多次，最后可获得澄清液作白蛋白测定，必要时按1﹕20比例扩大血清及球蛋白沉淀剂用量。
2、本法测定结果与电泳法相符合，但操作须在250C以上的室温中进行。
如受实验室条件限制只能在较低的温度下进行测定时，可改用盐浓度较低的球蛋白沉淀剂（其它试剂及操作方法均与法相同），但测定结果白蛋白值较本法略高。
常用的低浓度球蛋白沉淀剂为23％硫酸钠溶液（无硫酸钠230g，加蒸馏水至1L）或21％亚硫酸钠溶液（无水亚硫酸钠210g,加蒸馏水到1L）。