高效液相色谱的色谱柱的类型和流动相的选择方法_徐红
高效液相色谱的色谱柱选择与优化
高效液相色谱的色谱柱选择与优化高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和分析技术，广泛应用于化学、生物、药物等多个领域。
在HPLC中，色谱柱的选择和优化是至关重要的一步，它直接影响到分析结果的准确性和分离效果的好坏。
本文将探讨HPLC色谱柱选择与优化的相关问题。
一、色谱柱选择的基本原则在选择HPLC色谱柱时，需要考虑以下几个基本原则：1. 样品特性：首先要考虑待分离的样品特性，包括其化学性质、分子量、溶解度等。
不同的样品可能需要不同类型的色谱柱，如反相色谱柱、离子交换色谱柱、手性色谱柱等。
2. 分离效果：色谱柱的分离效果是选择的关键因素之一。
分离效果好的色谱柱能够提供较高的分离度和较好的峰形，从而使得分析结果更加准确可靠。
3. 色谱柱品牌和质量：选择知名品牌和质量可靠的色谱柱是保证分析结果准确性的重要保障。
品牌和质量好的色谱柱通常具有较好的稳定性和耐用性，能够提供稳定的分离效果。
二、色谱柱优化的方法和技巧除了选择合适的色谱柱，还可以通过优化色谱条件来改善分离效果。
以下是一些常用的色谱柱优化方法和技巧：1. 流动相的优化：流动相的选择和组成对于分离效果有着重要影响。
可以通过调整流动相的pH值、浓度、添加剂等来改善峰形和分离度。
此外，还可以尝试使用梯度洗脱法，即在分离过程中逐渐改变流动相的组成，以提高分离效果。
2. 温度的优化：温度对于色谱柱的分离效果也有一定影响。
在某些情况下，调整温度可以改善分离度和峰形。
一般来说，提高温度可以加快分离速度，但也可能导致峰形变宽。
因此，在优化温度时需要综合考虑分离效果和分析时间的平衡。
3. 流速的优化：流速是影响分离效果的重要因素之一。
过高的流速可能导致峰形变宽、分离度下降，而过低的流速则会延长分析时间。
因此，需要根据样品特性和分析要求选择合适的流速。
4. 注射量的优化：注射量的大小也会对分离效果产生影响。
高性能液相色谱法中柱选型与优化方法
高性能液相色谱法中柱选型与优化方法高性能液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和分析技术，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
柱选型和优化方法对于HPLC分析的成功与否至关重要，本文将介绍HPLC柱的选型原则和优化方法。
一、柱选型原则HPLC柱的选型是决定色谱系统分离效果的关键。
柱的选取应根据样品性质、分离要求以及仪器性能等方面进行综合考虑。
以下是柱选型的几个重要原则：1. 良好的分离能力：柱的分离能力决定了样品中各组分是否能够得到有效分离。
一般来说，分离度越高，分析结果越准确。
选择具有良好分离能力的柱可保证分析结果的可靠性。
2. 合适的保留特性：柱的保留特性应与待测物质的性质相匹配。
根据待测物分子量、极性、酸碱性等特征选择相应的柱，以使待测物在柱上有适度的保留和分离。
3. 良好的耐受性和稳定性：柱在长时间高温或酸碱环境下应有良好的耐受性和稳定性，以保证柱的寿命和分离效果。
选择具有耐受性和稳定性的柱，能够减少维护和更换柱的次数，提高实验效率。
4. 较短的保留时间：保留时间较长可能会影响分析的速度和效率。
选择保留时间相对较短的柱，不仅可以提高分析速度，还可以减少流动相的消耗。
二、柱的优化方法在进行HPLC分析时，柱的优化是提高实验效果和分析速度的关键。
以下是几种常用的柱优化方法：1. 选择合适的流动相：合理选取流动相可以改善分离效果。
由于柱的分离效果受到流动相极性的影响，因此根据待测物的极性特征，选择适当的溶剂比例和流动相成分。
2. 调整柱温：调整柱温可以改变柱的保留特性和分离效果。
较高的柱温通常能够提高样品的溶解度，加快保留时间，但会降低分离能力。
合适的柱温应根据待测物的性质和分离需求进行调整。
3. 优化流速：流速对分离效果和分析时间均有影响。
较低的流速可以提高分离度，但会延长分析时间。
适当调整流速可以在保证分离效果的前提下减少分析时间，提高效率。
hplc色谱柱的选择
hplc色谱柱的选择
高效液相色谱（ HPLC）是一种广泛应用于分析化学领域的分离技术。
在（HPLC（分析中，色谱柱的选择是至关重要的，因为它直接影响分离效果和分析结果的准确性。
下面是一些选择（HPLC（色谱柱的要点：
1.（色谱柱类型：HPLC（色谱柱主要分为反相柱、正相柱和离子交换柱等类型。
根据待分析物的性质选择合适的色谱柱类型，例如，对于非极性化合物，通常选择反相柱；对于极性化合物，正相柱可能更合适。
2.（填料粒度：填料粒度越小，分离效率越高，但柱压也会相应增加。
一般来说，分析小分子化合物时选择细粒度填料，分析大分子化合物时选择粗粒度填料。
3.（柱子长度：柱子长度越长，分离效果越好，但分析时间也会延长。
根据分离要求和分析时间的限制选择合适的柱子长度。
4.（柱子内径：柱子内径越小，柱效越高，但柱压也会相应增加。
一般来说，分析小分子化合物时选择细内径柱子，分析大分子化合物时选择粗内径柱子。
5.（固定相：选择合适的固定相可以提高分离效果。
根据待分析物的性质选择合适的固定相，例如，对于非极性化合物，可以选择（C18（固
定相；对于极性化合物，可以选择硅胶固定相。
6.（品牌和价格：不同品牌的色谱柱质量和价格可能存在差异。
在选择色谱柱时，可以参考其他用户的评价和经验，选择性价比较高的产品。
在选择（HPLC（色谱柱时，需要综合考虑待分析物的性质、分离要求、分析时间和成本等因素。
如果对色谱柱的选择有疑问，可以咨询专业的色谱柱供应商或实验室技术人员。
关于高效液相色谱仪流动相的选择如何呢
关于高效液相色谱仪流动相的选择如何呢高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）是一种常用的分离和分析技术，广泛应用于生命科学、化学、医药、环境等多个领域。
其中，流动相的选择对于色谱分离性能和分析结果的准确性有着重要的影响。
一、流动相的组成流动相是指用于在高效液相色谱仪中运载样品溶液，推动样品通过固定相柱的溶剂体系。
一般情况下，流动相由溶剂和缓冲剂组成。
溶剂用于将样品带入色谱柱，而缓冲剂则用于调整流动相的pH值。
在选择流动相的溶剂时，主要要考虑以下因素：1.溶剂极性：色谱柱的固定相特性和待分析的样品特性决定了所需的溶剂极性。
一般来说，溶剂可以选择非极性溶剂、极性溶剂或者两者的混合物，以适应不同的分析要求。
2.溶剂选择：常用的溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、乙腈等有机溶剂，以及水。
甲醇和乙腈是最常用的有机溶剂，由于它们的极性较低，因此溶解性广泛。
水是最常用的极性溶剂，可以提供更好的分离效果。
3.透过性：一些样品需要在其中一种溶剂中分离，因此选择适当的溶剂对于分析结果的准确性至关重要。
在选择缓冲剂时，需要考虑以下因素：1.pH值的调整：一些分析需要在特定的pH值下进行，需选择合适的缓冲剂，以维持所需的pH值。
2.缓冲能力：缓冲剂应具有良好的缓冲能力，以维持流动相的pH值的稳定性，避免pH值对分离效果的干扰。
3.溶解度：缓冲剂应具有较高的溶解度，以便在高浓度下使用，从而提供稳定的pH值。
二、常用的流动相系统1.等相流动相系统（Isocratic elution）：等相流动相系统是指流动相组成在整个分析过程中保持不变。
这种系统适用于分离度较差的样品，具有简单、稳定、易操作的特点。
2. 梯度流动相系统（Gradient elution）：梯度流动相系统是指在分析过程中，通过改变流动相组成来实现样品的分离。
这种系统适用于需要分离程度较高的样品，提供了更好的分离效果。
液相层析法中色谱柱选择与操作技巧
液相层析法中色谱柱选择与操作技巧液相层析法（Liquid Chromatography，LC）是一种常用的分离和分析技术，广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。
在液相层析实验中，选择合适的色谱柱和掌握操作技巧是非常重要的，本文将探讨液相层析法中色谱柱选择与操作技巧的相关内容。
一、色谱柱的选择1. 相性选择在选择色谱柱时，相性是首要考虑因素之一。
色谱柱的相性应与待分离的化合物相匹配，以保证分离效果。
对于极性化合物，可以选择正相色谱柱，如C18柱；对于非极性化合物，可以选择反相色谱柱，如C8柱。
此外，还有其他特殊相性的色谱柱，如糖酒石酸柱、氨基酸柱等，可以根据需要进行选择。
2. 尺寸选择色谱柱的尺寸也是需要考虑的因素之一。
常见的色谱柱直径有2.1 mm、4.6mm等，长度一般为150-250 mm。
选择合适的柱尺寸可以提高分离效果和样品通量，同时也会影响分离时间和分辨率。
对于复杂的样品，可以选择细柱，如2.1mm×50 mm，以提高峰形和分辨率；对于样品量较大的情况，可以选择大柱径，如4.6 mm×250 mm，以增加样品通量。
3. 粒径选择色谱柱的粒径也是一个重要的选择因素。
粒径是指填充在柱中的固定相颗粒的直径，常见的有3 μm、5 μm、10 μm等。
粒径越小，表面积越大，分离效果越好，但也会带来较高的压力和较长的分离时间。
一般而言，对于常见的分析要求，5μm的粒径已足够满足分离要求；对于更高的分离要求，可以选择更小的粒径。
需要注意的是，选择不同粒径的柱时，需调整相应的操作参数，以保证分离效果。
二、色谱柱的操作技巧1. 前处理样品在液相层析实验中，样品前处理是一个非常关键的步骤。
样品中的杂质和干扰物会对分离效果产生不利影响，因此需要进行适当的前处理。
常见的前处理方法包括：固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）、液液萃取等。
前处理的目的是提取和富集分析物或去除干扰物，以提高检测灵敏度和分离效果。
液相色谱柱的选择和方法开发
液相色谱柱的选择和方法开发液相色谱（HPLC）是一种高效、准确和灵敏的分离和分析技术，在许多领域中具有广泛的应用。
液相色谱柱的选择和方法开发是HPLC分析中的关键步骤之一，它们直接影响到分离效果和分析结果的准确性和可靠性。
本文将详细介绍液相色谱柱的选择和方法开发的相关内容，并提供一些建议和注意事项。
一、液相色谱柱的选择1.分子排阻柱（SEC）：适用于分离和分析高分子物质，如蛋白质、多肽、聚合物等。
根据目标物分子量的大小选择不同的分子排阻柱。
2.反相柱（RP）：适用于分离和分析非极性、低极性化合物。
常用的反相柱有C18、C8、C4等，根据目标物的亲疏水性选择不同的柱材和碳链长度。
3.离子交换柱（IEC）：适用于分离和分析离子化合物，如酸、碱、金属离子等。
根据目标物的离子性质选择阴离子交换柱或阳离子交换柱。
4.亲合性柱：适用于分离和分析具有特定亲和性的目标物，如抗体、酶、细胞等。
常用的亲合性柱有亲和色谱柱、亲和半制备色谱柱等。
二、方法开发方法开发是指在具体的分析目标下，通过调整柱材、流动相、柱温、检测器等参数，寻找出最佳的分离条件和分析方法。
方法开发的过程中，需要进行实验设计、参数调整和结果评估等步骤。
1.实验设计：按照试验的目的和要求，设计合理的实验方案。
包括选择柱材、柱尺寸、流动相、梯度条件、柱温等参数，并确定荧光标准品的浓度和检测波长。
2.参数调整：根据实验设计，逐步调整各种参数，寻找出最佳的分离效果。
需要注意的是，在参数调整的过程中，要逐步变化，避免一次性调整多个参数。
3.结果评估：通过比较不同条件下的分离效果和结果，评估方法的可行性和可靠性。
主要评估指标包括分离度、保留时间、峰形等。
注意事项：1.根据样品的性质和分析目标选择合适的柱材和柱尺寸。
不同的柱材和柱尺寸对分离效果和分析结果有直接影响。
2.合理选择流动相和梯度条件。
流动相的选择应考虑样品的亲疏水性质，梯度条件应选择合理的温度和时间。
高效液相色谱柱的选择
高效液相色谱柱的选择液相色谱柱的选择、使用、维护和常见故障的排除液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。
正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。
另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。
本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用：一、反相色谱柱的选择1．柱子的PH值使用范围反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。
但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。
一般的C18柱PH值范围都在2~8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。
一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。
同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。
如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。
2．填料的端基封尾（或称封口）把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。
如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。
3．戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱戴安公司有28种类型的柱子，Acclaim反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。
PH 2-9范围内兼容，低流失，高柱效。
尤其是2003年推出的Acclaim极性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨-O 链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。
对酸性和碱性化合物有极为尖锐的好的色谱峰形，与现有的一流色谱柱相比有更好的立体选择性。
（下图是Acclaim极性封尾C16柱和市售极性封尾一流色谱柱分离酸性化合物谱图的比较）二、液相色谱柱的使用色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。
如何挑选液相色谱柱
分离模式
色谱柱
备注
量
பைடு நூலகம்
小于 2000
溶于正己 烷
正相吸附色 谱
Silica
填料孔径通 常为 100Å
脂溶性
溶于四氢 呋喃
溶于甲醇/
GPC
正相键合色 谱
氰基柱、氨基柱
水
C18、C8、PH 或 PLRP(反
反相色谱
相聚合物色谱柱)
水溶性 非离子型 反相色谱
C18、C8、PH 或 PLRP
离子抑制色 谱
C18、C8、PH 或 PLRP
首先，如果之前开发方法时色谱柱已经做过别的样品，那么之前的样品或使用的流动相 对这个样品分析可能有干扰，只能重新找条件。建议：开发方法时使用新的色谱柱。
其次，如果是更换了品牌发生这样的情况，可能是由于不同品牌的键合技术不同，造成 了选择性的细微差异 ，需要调整条件，并再次确定出峰顺序（有些样品的洗脱顺序会改变）。
快、峰形异常的情况。 ·色谱峰形异常，基线不稳。 ………… 当发生以上情况，请仔细检查，是否有某个操作疏忽了？
1）测试柱性能 通常情况下，我们建议用户在拿到色谱柱后，第一件事情就是在一台性能完好的仪器系
统上，按照厂家说明书对色谱柱进行柱效测试。其实，对于一个合格的色谱分析工作者来说， 拿到一根新色谱柱，要开始一个课题之前，都会这样做，目的有二：一、了解色谱柱之前的
(1) 内径
在理想情况下，当填料、柱长和流动相优化线速度确定时，色谱柱内径的变化将只影响 上样量和灵敏度，柱效、分离度、分析时间等均不发生变化。与内径为 4.6 mm 的色谱柱相 比，内径为 2.1 mm 的色谱柱的截面积仅相当于前者的 1/5，所以为取得相同的线速度，后 者所需的体积流速仅为前者的 1/5，因而使用细径柱能显著减少溶剂用量；同样由于截面积 小，样品组分在细径柱中的稀释也较小，可以得到较高的灵敏度；细径柱的最大载样量也相 应减小。
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高效液相色谱的色谱柱的类型和流动相的选择方法The Choicing W ays of Chromatographic Colum n and Mobil Phase about HPLC
徐 红 侯 健
(新疆昌吉州产品质量检验所,新疆昌吉831100)
摘 要:高效液相色谱仪的核心是色谱柱。
另外,流动相对改善分离效果也有重要的辅助效应。
色谱柱的关键内容是制备出高效的填料。
现代高效液相色谱填料多使用键合固定相。
色谱柱的填充技术直接影响柱效的发挥。
在研究制定一个高效液相色谱方法时,选择适宜的流动相也很重要。
关键词:高效液相色谱;色谱柱;填料;流动相;溶剂
色谱柱的关键内容是制备出高效的填料。
这些填料装成的色谱柱既要有好的选择性,又要有高的柱效。
要提高柱效是现代高效液相色谱的又一重要问题。
所以填料和装柱技术是关键问题。
现代高效液相色谱填料多使用键合固定相,其固定相膜很薄,因而大大提高了柱效。
高效液相色谱填料的基质有以下几种:(1)全多孔硅胶。
现代高效液相色谱填料绝大多数用键合的方法把活性基团接枝到基质上,全多孔硅胶是使用最为普遍的基质。
全多孔硅胶的孔径有三种类型:①微孔全多孔硅胶,孔径<2nm;(2)中孔全多孔硅胶,孔径<50nm,>2nm;(3)大孔全多孔硅胶,孔径>50nm。
高效液相色谱填料使用中孔和大孔全多孔硅胶,在分离低分子量的混合物时,选择(6～15)nm孔径的全多孔硅胶,其比表面相当于(500～200)m2/g。
在分离合成聚合物或生物大分子时,要使用(15～100)nm的全多孔硅胶。
如果使用<2nm的全多孔硅胶,色谱峰就会拖尾。
(2)其他金属氧化物基质。
由于硅胶有一些缺点:在碱性介质中(pH>8)不稳定;在孔隙中大分子扩散困难,降低柱效;硅胶表面上的剩余硅羟基有离子交换作用。
为此近年来用氧化铝、氧化锆、氧化钍和氧化钛作为高效液相色谱填料的基质有很大的H PLC应用前景。
高效液相色谱固定相有以下几种:(1)硅胶表面键合或涂渍各种聚合物。
(2)其他氧化物表面上涂渍聚合物。
(3)无孔单分散填料。
(4)有机高聚填料。
(5)灌注色谱填料。
(6)手性固定相填料。
色谱柱的填充技术直接影响柱效的发挥。
如果色谱柱填充不好,如填料颗粒之间不均匀、不密实,就会使涡流扩散项增加,导致柱效下降。
高效液相色谱柱的性能主要决定于固定相填料,但是色谱柱的填充好坏也有很大的影响。
填充色谱柱的方法有干法和湿法两种,一般大颗粒的(如外径>20nm)可以用干法填充;一般小粒径的填料宜用湿法填充。
湿法填充也称作匀浆法,即用密度和填料相近的液体或混合液作分散介质,用超声波处理此浆液,然后用高压泵快速压入色谱柱管中,这样就可以制备出高效的色谱柱。
在研究制定一个高效液相色谱方法时,选择适宜的流动相也很重要。
在选择流动相溶剂时,首先要考虑的是溶剂的物理性质,其次要考虑溶剂对所要分离样品的容量因子,最后是所使用的溶剂要有分离能力。
用作高效液相色谱流动相溶剂,首先要满足以下几点要求:(1)容易得到;(2)适合于所用的检测器;(3)纯净、有一定的惰性;(4)无毒、使用安全;(5)对所分离的样品有一定的溶解性能。
下面介绍选择流动相的要点:
(1)首先要考虑溶剂对检测器的适应性。
高效液相色谱在多数情况下要使用紫外检测器,所以必须考虑所用溶剂在紫外波段的吸收。
如使用示差折光检测器,要考虑溶剂的折光率。
(2)溶剂的活性
有许多溶剂可能与样品发生反应,或在某些固定相的存在下产生聚合,他们就不能作为流动相使用。
(3)溶剂的沸点和粘度
溶剂的沸点和粘度密切相关,低沸点的溶剂通常其粘度也低。
通常选用沸点高于柱温(20～50)℃、粘度不大于5×10-4Pa.S的流动相。
(4)高效液相色谱流动相溶剂的极性
在分配色谱和吸附色谱中,溶剂的极性是用混合溶剂的比例来调节的,一个极性强的溶剂和一个极性弱的溶剂经过适当的混合可以得到一定极性的混合溶剂。
(5)溶剂的选择性和溶剂的分类
选择流动相的极性能使被分离样品的分配容量在1～5之间,这时如果有两个或几个色谱峰重叠,可以通过调节溶剂的选择性来解决。
选择合适的色谱柱和流动相是高效液相色谱的关键。
参考文献
[1]富玉,陈能武.高温液相色谱的原理及研究进展.中国测试技术, 2006(3)36.
作者简介:徐红,女,副高级工程师,所长。
工作单位:新疆昌吉州产品质量检验所。
通讯地址:831100新疆昌吉市健康西路17号。
侯健,新疆昌吉州产品质量检验所(昌吉831100)。
收稿时间:2009-10-16
10
《计量与测试技术》2010年第37卷第2期。