酸性磷酸酶活性测定方法
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
• 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • (目的：选取合适的反应时间)
管号
1
磷酸苯二钠 0.5
酶液
0.5
精确反应时间 3
碳酸钠溶液 2
酶液
－
Folin－酚溶液 0.5
加液程序表
2
3
4
5
6
0
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
5
10 15
20
根据双倒数法计算出Km及Vmax
Vmax [S]
V=
Km + [S]
三、实验步骤：
• 1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取 • 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • 3、制作酚标准曲线 • 4、[S]与V0关系实验 • 5、双倒数作图法计算Vmax和Km
blank
buffer substrate enzyme
25
2
2
2
2
22
－
－
－
－
－
0.5
0.5 0.5
0.5 0.5 0.5 0.5
35℃保温10分钟 Folin－酚溶液已稀释好！
注： 进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始
• 3、制作酚标准曲线
• (目的：可从酚标准曲线上查出A680nm所相 当的酚含量,并计算出反应速度(用每分钟 产物生成量来表示)
1.5
2.5
1/[S]
A 680
phenol content (酚含量) V0 (μmole phenol per min) 1/ V
0
1、酚含量从酚标准曲线上查得 2、V0 反应初速率( μmol/min)为酚含量除以酶反应时间(15分钟)。 3、双倒数作图法计算Vmax和Km
土壤酶活性测定方法
土壤酸性磷酸酶活性的测定1．试剂配制(1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6HO,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至2250ml.4摄氏度冰箱保存。
(2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀）原液由以下成分组成:三羟甲基氨基甲烷12.1g顺丁烯二酸11.6g柠檬酸14g硼酸6.3g溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。
取原液200 ml，再加入0.1N HCL 或浓HCL来调pH为4.5。
最后稀释至1L，即得。
(3)甲苯(4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液：36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml)(5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L.2．测定步骤置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。
培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过致密滤纸过滤到50ml容量瓶，用蒸馏水定容后在410nm处比色.3．计算方法土壤酸性磷酸酶的活性用单位时间内每克土中的对硝基苯酚的毫克数表示，W（mg·g-1·h-1）=M1/（m×t）式中：M1—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的质量（mg）；t —反应时间（h）；=1hm—样品土壤的重量（g）无土壤CK: 用1ml蒸馏水代替1g土壤；每批土样做2个；无基质CK: 用1ml蒸馏水代替1ml PNPP。
每个处理做1个。
标准曲线的制作：1）对硝基苯酚标液：1g对硝基苯酚定容1L，低温保存。
2）取标液0、1、2、3、4、5ml于0-6号硬质试管中，分别加pH6.5通用缓冲液4ml，Cacl2.2H2O 溶液1ml，NaOH溶液4ml，②混匀后，定量滤纸过滤到50ml容量瓶，定容后，再取各浓度标液1ml定容至50ml，以0号试管作为对照，在A410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。
组织及血液酸性磷酸酶(ACP)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法
组织及血液酸性磷酸酶（ACP）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC2130规格：50T/24S产品内容：提取液：液体30mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体30mL×1瓶，4℃避光保存，变成蓝绿色不能使用。
标准品：液体1mL×1支，2μmol/mL酚标准液，4℃保存。
临用前蒸馏水稀释至0.5μmol/mL备用。
产品说明：ACP在酸性条件下催化磷酸单酯水解称无机磷酸，常见于巨噬细胞的溶酶体内。
ACP常用于前列腺癌的辅助诊断。
在酸性环境中，ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚，苯酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应生成红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510nm吸光度增加速率，来计算ACP活性。
试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、粗酶液提取：称取约0.1g组织，加提取液1mL充分研磨，4℃、10000rpm离心10min，取上清液待测。
血液可直接用于测定，如果浓度高的话，用提取液稀释。
二、测定步骤：1.分光光度计预热30min以上，调节波长到510nm，蒸馏水调零。
2.试剂一置于37℃水浴中预热30min以上。
试剂名称（μL）测定管对照管空白管标准管蒸馏水--100-0.5μmol/mL标准品---100上清液100---试剂一200200200200试剂二200200200200混匀后置于37℃水浴中保温15min试剂三600600600600上清液-100--混匀后于510nm测定吸光度，分别记为A测定管、A对照管、A空白管、A标准管。
三、ACP活性计算：1.按蛋白浓度计算活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。
土壤磷酸酶(酸性、中性和碱性磷酸酶
土壤磷酸酶测定（酸性、中性和碱性磷酸酶）1. 分析意义土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在pH4-9的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。
2. 试验原理Kroll等（1955）最早提出用苯基磷酸盐作基质，以酚的释放量表示磷酸酶活性。
测定磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。
前一种通称为有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。
后一种称为无机磷含量法。
研究证明，磷酸酶有三种最适pH：4-5，6-7和8-10。
所以，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。
测定磷酸酶常采用的pH缓冲体系有醋酸盐缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0-8.5），硼酸缓冲液（pH9-10）。
测定磷酸酶时，用各种磷酸一酯作为基质。
常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α或β萘酚磷酸钠、ρ-硝基苯磷酸钠等。
3. 试剂配制a. 0.5％磷酸苯二钠（用缓冲液配制）；b. pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液；c. 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；d. 酚的标准溶液：酚原液－取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；酚工作液－取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；e. 甲苯；f. 0.3％硫酸铝溶液。
4. 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和0.0026mg ·g -1浓度的酚标准溶液梯度。
实验十五：酸性磷酸酶的显
如钼酸铵-硫酸溶液，用 于与水解产物反应生成
有色络合物。
用于提取植物组织中的 酸性磷酸酶。
用于调节实验溶液的pH 值。
03
实验操作过程
实验步骤一：样本制备
准备不同浓度的酸性磷酸酶溶液，以 便后续实验对比。
准备适量的底物溶液，以备后续使用。
将样本分别置于离心管中，标记好浓 度和编号。
实验步骤二：显色反应
中孵育15分钟。
02
03
4. 加入4-氨基安替比林和铁 氰化钾，混匀。
04
05
5. 用分光光度计测量各试管 在550nm处的吸光度。
02
材料与试剂
实验材料
新鲜植物组织样品
如菠菜叶片、豌豆叶片等。
缓冲液
用于保持实验环境的pH稳定。
实验试剂
酸性磷酸酶溶液
显色剂
无水乙醇
醋酸
用于催化磷酸酯的水解 反应。
混合液以及准确测量吸光度值等细节，以确保实验结果的准确性和可靠性。
04
结果分析
数据分析
01
02
03
实验数据整理
将实验过程中记录的数据 进行整理，包括不同时间 点的吸光度值、温度、pH 值等。
数据清洗
去除异常值和缺失值，确 保数据分析的准确性。
数据转换
对数据进行适当的转换， 如求平均值、中位数等， 以便更好地反映实验结果。
通过实验数据，可以得出酸性磷酸酶的浓度与显色深浅呈正相关，可以通过观察颜 色变化来间接判断酶的浓度变化。
结果应用与意义
酸性磷酸酶在生物学、医学和农业等 领域具有广泛的应用价值，例如在骨 代谢、癌症诊断和治疗以及植物抗病 研究中都发挥着重要作用。
本实验结果可以为这些领域的研究提 供参考，帮助人们更好地了解酸性磷 酸酶的性质和作用机制，从而为相关 研究和应用提供有益的启示。
酶活性测定方法
酶活性测定1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer0.2mol/L NaOH测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu)2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase)试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer0.2mol/L NaOH测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu)3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase)试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷）0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6)测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化60 min；(3) 沸水加热3min 终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
实验四 酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
• 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • （目的：选取合适的反应时间）
管号
1
磷酸苯二钠
0.5
酶液
0.5
精确反应时间 3
碳酸钠溶液 2
酶液
－
Folin－酚溶液 0.5
加液程序表
2
3
4
5
6
0
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Certain Time
Stop the reaction
Color developed
• 生化实验课老师：于晓虹 • 实验报告请交到讲台上来 • 酶液稀释 取上清液３００微升，稀释
３０倍，用大试管装
• 科代表 李博恒
1、磷酸酶原液的制备：
称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6的 HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤， 取1.8ml滤液,以6000rpm，离心20min，取上清。
Folin-phenol reagent
加液程序表
01 2 3 4 5 6 7 8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 22 2 2 2 2 2 2 2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
实验四 酸性磷酸酶Km及 Vmax值测定
一、概述
酸性磷酸酶：
催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。
是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测 指标。
二、实验原理
磷酸苯二钠
酶液
苯酚 ＋ 磷酸氢二钠
酸性磷酸酶的
4000rpm，10min离心
（溶解ACP，
沉淀杂蛋白） 上清液 IV
EDTA9ml，饱和硫酸铵 10ml /100ml上清液 IV，
4000rpm，10min离心
2倍体积预冷甲醇
（ 沉淀ACP）
缓慢搅拌
沉 淀（酶纯化物）
蒸馏水溶解，洗涤 4000rpm，10min离心
上清液 V （酶液）
二、 ACP的比活性分析 1.各上清液中蛋白质含量测定
原理：染料结合比色法——CBBG-250， max=595nm；
步骤：标准曲线制作
各上清液中总蛋白测定（做平行管，进 行重复实验，减少随机误差。
2.各上清液中ACP活性测定
酚-4-AAP显色法:以磷酸苯二钠为底物，由 ACP催化生成苯酚，在碱性条件下苯酚与4AAP缩合最终生成红色醌类化合物，max = 510 nm；
上清液I 中ACP的比活性
各上清液中ACP的活性 总体积 酶的回收率= 上清液I中ACP的活性总体积
还可以计算蛋白回收率，反映纯化效果，代表方法的特异性。
三、 ACP的动力学分析 1. 时间进程（t-A ）曲线
酚生 A 成量
时间（t）
ACP的 t-A 曲线
2. 酶浓度-速度（[E]-A）曲线
反应 速度
实验安排
1. 实验分组 2. 实验时间安排 3. 实验内容选择与分工 4. 实验报告书写
活性测定的原理、方法和影响因素； 4. 熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。
试剂与器材
一、ACP的分离纯化试剂：见实验 教材P31； 二、ACP动力学分析试剂：见实验 教材P35；
三、器材：普通离心机，721分光光 度计，恒温水浴箱，研钵等。
实验内容
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验九酸性磷酸（酯）酶活性测定1．目的要求
掌握酸性磷酸（酯）酶活性测定的原理和方法。
2．方法原理
酸性磷酸（酯）酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。
以对硝基酚磷酸钠作为底物，在酸性磷酸酯酶的作用下，在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚，可用分光光度计进行比色测定。
它们在各类种子中普遍存在，且含量较多，在萌发前期，随着种子的萌发进程活性增加，通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。
3．主要实验仪器及材料
干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研钵、塑料管、剪刀。
4．掌握要点
掌握常用的测定酸性磷酸（酯）酶活性的方法——对硝基酚磷酸钠法。
5．实验内容
（1）酶液提取。
称取1g样品，用5mL研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆，再用5mL 研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中，在20000rpm下离心10min。
吸出上清液，即为酶粗提液。
可放在冰箱中储存备用。
（2）活力测定。
取酶液0.1—1mL（视酶含量多少而定），加水至1mL，然后加入缓冲液1mL和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL。
空白对照用1mL研磨缓冲液代替酶制剂。
充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min，时而摇动。
10min后，加入1m0.5mol/LNaOH溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。
在400nm波长下测吸光度A。
（3）计算酶活性，以每毫克种子每分钟水解底物的nmol数表示。
酶活性nmol/min.mg=
）
（
）
（
试样的
g
W
V
V
A
⨯
⨯
⨯
min
10
1
1.3
019
.0
式中0.019为pH=14时，对硝基酚的µmol吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L时，其A=0.019；
3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将µmol化为nmol乘上1000；
V为酶制剂总体积；
V1为每次用酶体积。
在实验中要保持酶制剂处于低温下以免酶活性下降，可在冰箱中提取和保存。