药理实验

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2010/12/5华西药学院08级四班钱明春

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糖尿病新药研究计划书

糖尿病（diabetes）是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状。糖尿病(Diabetes)分1型糖尿病和2型糖尿病。在糖尿病患者中，2型糖尿病所占其中的比例约为95%。1型糖尿病多发生于青少年，因胰岛素分泌缺乏，依赖外源性胰岛素补充以维持生命。2型糖尿病多见于中、老年人，其胰岛素的分泌量并不低，甚至还偏高，临床表现为机体对胰岛素不够敏感，即胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)。

一、靶点选择

乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA Car-boxylase,ACC)是近年来在肥胖及糖尿病（DM）发病机制研究中被逐渐重视的一种促进脂肪酸合成的酶，其处于脂肪和糖代谢的一个交汇点，在碳水化合物和脂肪代谢中有重要作用，ACC有可成为将来DM治疗的新靶点。

一、ACC的生物学特性

ACC是脂肪酸合成限速酶，它催化脂肪酸合成的第一步反应，即ACC合成丙二酰CoA（MA），然后MA在脂肪酸碳链延长酶系作用下进一步合成长链脂肪酸。产物MA还能够抑制肉碱脂酰转移酶1（CPT1），阻止长链脂肪酸转移至线粒体内膜，减少脂肪酸的氧化。ACC通过这两种途径促进长链脂肪酸的合成并减少其氧化[1]。ACC存在于胞液中，有单体和多聚体两种形式，单体无活性，多聚体催化活性比单体高10～20倍，受固醇调节元件结合蛋白1 (sREBPlc)的调节[2]。ACC有2种亚型，ACC1主要分布在脂肪合成、储存的器官和组织，如肝脏、脂肪、胰岛和下丘脑；而ACC2主要分布在脂肪分解的组织即骨骼肌和心肌。

二、ACC在体内的调节

最近研究表明，ACC受磷酸化、去磷酸化的调节，AMP激活的蛋白激酶（AMPK）是调节ACC 活性的主要物质，可以使ACC磷酸化，抑制ACC的作用[3] 。而蛋白磷酸化酶2则使ACC去磷酸化，激活ACC。当细胞接受刺激或能量消耗增加时，细胞内AMPK含量增加，使ACC磷酸化增加而活性降低，进而减少脂肪酸合成并提高脂肪酸的氧化量，以适应能量增加的需求。当机体内能量储存增加或能量需求减少时，体内胰岛素含量升高，增加脂肪酸的合成从而促进脂肪在体内的堆积。胰岛素能通过蛋白磷酸酶的作用使磷酸化的ACC去磷酸化而使ACC

恢复活性，而胰高血糖素能激活AMPK使ACC磷酸化而降低其活性。NogalskaA等[4]发现，在大鼠白色脂肪组织中，随着瘦素浓度的升高，ACCmRNA表达逐渐降低，瘦素对ACCmRNA表达的抑制作用，与抑制ACC上游调控因子sREBPlcmRNA表达有关。另外，三碘甲状腺氨酸、柠檬酸、异柠檬酸、辅基生物素以及芳香烃类及其衍生物均有一定调节ACC活性的作用。

三、ACC的作用与能量代谢

1、在进食以碳水化合物为主的餐后状态下：

在胰岛β细胞，ACC1催化合成的MA，是葡萄糖代谢生成ATP、关闭ATP敏感的钾离子通道、改变膜电位、增加钙离子而刺激胰岛素分泌的重要协同因子，可以增加胰岛素分泌。在肝脏，进食碳水化合物和胰岛素刺激肝ACC1的活性，合成MA，促进糖向脂肪转化。在脂肪氧化的组织-骨骼肌，ACC2催化合成的MA，通过负反馈作用抑制CPT-1的作用，从而抑制线粒体的脂肪酸氧化。在脂肪组织，胰岛素促进脂肪储存、抑制脂肪水解，激活ACC1的活性，促进脂肪合成作用。在下丘脑，ACC1可能参与了饱感的过程，高的胰岛素和血糖水平（餐后状态），激活ACC1，可以抑制动物的摄食行为。机体不同组织ACC活性的变化，使机体利用糖类和储存脂肪，使得进餐后的血糖恢复到基础水平。

2、在空腹和以脂肪为主要能量来源状态下：

在空腹状态下，血糖较低，胰岛素水平降低和胰高血糖素水平升高有利于脂肪水解。血FFA 升高，抑制肌肉ACC2表达，使MA减少，从而解除对CPT-1的抑制，增加脂肪的氧化，使得人体适应以脂肪酸为能量的来源。

总之，在进食后和高胰岛素水平的情况下，ACC1是激活状态，协助机体以脂肪形式储存能量或减少摄食；而在空腹状态下，ACC2是被抑制的，有利于脂肪的水解和氧化。这使得我们有可能选择不同ACC亚型，来达到治疗DM的目的。

三、改变ACC的活性与DM治疗

（一）抑制ACC2活性治疗DM/改善胰岛素敏感性

1、长链脂肪酸是生理性的ACC2抑制剂。长链脂肪酸衍生物5-(tetradecyloxy)-2-furoic acid(TOFA) 可以在细胞内转化为其辅酶A的衍生物, 抑制ACC2的活性, 减少实验动物和培养肝细胞的脂肪酸合成[5]。

2、选择性敲除基因ACC2。Wakil等[6]报道了选择性敲除基因ACC2，并维持ACC1功能的小鼠，表现为骨骼肌ACC2浓度降低, 肌肉脂肪酸氧化增加，肝脏的脂肪含量减少，在进食增多时全身总的脂肪含量减少、血糖和FFA水平降低。这些观察进一步支持应用抑制ACC2治疗DM 的观念，但啮齿类与人类的巨大差异使得我们得慎重看待这些结果。

3、非选择性的ACC抑制剂。近年来CP-610431和CP-641086相继被发现，引起人们的关注。Harwood HJ Jr等[7]发现它们能同时抑制ACC1和ACC2的活性，减少实验动物肝脏和脂肪组织的脂肪酸合成，增加肌肉组织脂肪氧化，而且发现CP-640186在减少肌肉脂肪含量及全身脂肪量，改善胰岛素敏感性方面优于CP-610431，这有可能用于DM的治疗。

尽管如此，增加组织脂肪氧化可能会带来一系列问题。我们知道，在减肥治疗的最早阶段，甲状腺素增加氧化代谢可以减轻体重，但产生了包括影响心脏的各种并发症，从而被禁用于

减肥治疗。近年研究表明，氧化应激是DM慢性并发症发生及发展的中心环节，因而通过抑制ACC2或其他方法增加氧化代谢的远期影响不容乐观。

（二）激活ACC1活性治疗DM

抑制ACC2，可以增加脂肪的分解代谢，从而治疗DM。相反，激活ACC2可能导致脂肪氧化下降，是不利于DM治疗的。但是，如果激活的是ACC1而不是ACC2，可能从另一方面增加机体的储存功能或抑制食欲来治疗DM。

1、ACC1与胰岛素分泌作用：血葡萄糖升高时，其代谢的产物-ACC合成MA，与胰岛素分泌中关闭钾通道-改变膜电位-启动电位依赖的钙离子通道，激发胰岛素分泌过程相协同，增加胰岛素分泌[8]。在胰岛β细胞表达ACC1的反义mRNA，可以降低ACC1的活性，减少MA的水平，降低葡萄糖刺激的胰岛素分泌[9]。

2、ACC1与脂肪合成作用：刺激ACC1，肝脏和脂肪的生脂作用的增加，可以充分利用糖，协助糖向脂肪转化。Thampy GK等[10]研究发现，胰岛素增敏剂治疗动物18天，使得肝脏ACC1活性增加200%，可促进肝脏的脂肪合成。胰岛素增敏剂改善了胰岛素抵抗，尽管脂肪组织总量增加，但是内脏脂肪、肝脏、肌肉的脂肪减少，综合作用是纠正了血糖和其它代谢紊乱。

3、ACC1与抑制食欲作用：Xue B等[11]研究发现，下丘脑的AMPK活性可被代谢和激素信号改变并介导摄食反应，AMPK在低的能量供给的状态下激活，刺激食欲，AMPK活性对食欲的影响是通过影响ACC1而发挥作用的。Namkoong C等[12]发现：链脲佐菌素所致DM的大鼠，有明显的多食和消瘦，下丘脑AMPK活性增加，ACC1活性降低；长期胰岛素治疗或抑制AMPK 活性能完全预防这种改变。以上研究均提示刺激下丘脑ACC1可能抑制食欲。

总之，如果一种ACC1兴奋剂能够刺激胰岛素分泌，增加脂肪的合成，同时刺激下丘脑ACC1，抑制食欲，这样即增加了能量储存，又减少了摄食，可能用来治疗DM。如果选择性ACC1激活，又不会影响脂肪酸在肌肉等处的氧化分解，这将有可能成为理想的治疗DM的药物。

四、甜菊苷甙（stevioside，SV）作为ACC激动剂治疗DM的发现

SV是从南美植物甜菊中提取的一种分子量为800左右的二萜类化合物，有3个葡萄糖残基。目前证实SV及其衍生物能通过增加ACC活性发挥降糖、改善胰岛素敏感性、降压等作用，SV很有可能成为崭新的治疗DM的药物[13-14]。

1、SV增加胰岛素分泌及改善胰岛素敏感性的作用：

Jeppesen PB等[15]研究发现，SV在体内、体外均能刺激胰岛素分泌，而且这种刺激作用是依赖葡萄糖浓度的；SV还可增加胰岛素基因的表达，增加胰岛的胰岛素含量。Chen J等[16]还发现SV与格列本脲不同，其不增加基础胰岛素分泌，长期使用SV并导致胰岛β细胞失去对其敏感性。最近Chang JC等[17]报道，SV能够改善果糖诱发的胰岛素抵抗，降低DM动物

的甘油三酯、胆固醇和FFA。提示SV可以用于DM的治疗，而不会因为增加ACC的活性导致肥胖。

2、SV对胰高血糖素的作用：

DM患者餐后胰高血糖素不被抑制，也是血糖升高的原因之一，抑制胰高血糖素分泌也能降低血糖。Hong J等[18]研究发现：SV对长期软脂酸诱导的α细胞胰高血糖素分泌有抑制作用，这提示SV对DM的治疗是有益的。

3、SV的降压作用

Jeppesen PB等[19]发现SV有降低动物血压的作用，同样SV在人类也有累似的报道。在一项多中心对照研究中，发现SV能显著降低轻度高血压患者的血压[20]。另外，Gregersen S等[21]对伴有50-60%高血压的T2DM患者研究发现，SV有降糖和降压双重作用，同时不增加患者的体重。

五、ACC1激动剂治疗DM的前景和需要解决的关键问题

1、ACC1激动剂治疗DM应用前景

ACC1激动剂-SV或类似物作为治疗DM最少有以下优点：ACC1是一个新的靶点，临床还没有任一药物是通过活化ACC而发挥降糖作用的；SV刺激胰岛素分泌是依赖于葡萄糖的，不易引起低血糖；SV增加胰岛素基因的表达，可能不引起β细胞功能衰竭；SV能降低血压和胰高血糖素，显示其具有独特应用前景。

2、ACC1激动剂治疗DM需要解决的问题

SV作为ACC1激动剂刺激胰岛素分泌，是否引起体重增加；在以往的体外实验中，SV能够抑制脂肪酸跨细胞膜转运，有轻度的抑制脂肪氧化作用，但有关报道很少。在影响脂肪氧化的同时，对糖代谢影响也不十分清楚；SV是否影响摄食行为；SV可以改善果糖诱发的胰岛素抵抗，但是否影响DM动物胰岛素敏感性还不清楚。

总之，ACC可通过调节脂肪酸的合成与分解过程来影响脂肪的代谢过程。激活ACC1或抑制ACC2均能显示出改善胰岛素敏感性及治疗DM的作用，对ACC1激动剂-SV深入研究，有可能发现崭新的治疗DM的药物。

二、药物筛选

从一个10万化合物的样品库，我们首先通过计算机虚拟筛选后挑出了1万个化合物，然后通过高通量筛选筛选出100个有活性的化合物。其后用糖尿病小鼠模型进行初步整体动物研究，最后找到一个活性化合物A进行正式实验。

三、临床前研究

药物临床前研究应当执行有关管理规定，其中安全性评价研究必须执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）。

药物研究机构应当具有与试验研究项目相适应的人员、场地、设备、仪器和管理制度，并保证所有试验数据和资料的真实性；所用实验动物、试剂和原材料应当符合国家有关规定和要求。

药物临床前研究包括药物的合成工艺、提取方法、理化性质及纯度、剂型选择、处方筛选、制备工艺、检验方法、质量指标、稳定性、药理、毒理、动物药代动力学研究等。

根据药品注册申报资料要求，临床前研究可概括为3方面：

1、文献研究：包括药品名称和命名依据，立题目的与依据。

2、药学研究：原料药工艺研究，制剂处方及工艺研究，确证化学结构或组分的试验，药品质量试验，药品标准及说明，样品检验，辅料，稳定性试验、包装材料和容器的有关试验等。

3、药理毒理研究：主要一般有药理试验、药效学试验、急性毒性试验、长期毒性试验，过敏性、溶血性和局部刺激性试验、致突变试验、生殖毒性试验、致癌毒性试验，依赖性试验，动物药代动力学试验等。

四、临床试验

药物的临床试验（包括生物等效性试验），必须经过国家食品药品监督管理局批准，且必须执行《药物临床试验质量管理规范》（GCP）。

临床试验分为I、II、III、IV期。

I期临床试验：最低受试者（病例数）为20～30例，是初步的临床药理学及人体安全性评价试验。观察人体对于新药的耐受程度和药代动力学，为制定给药方案提供依据。

II期临床试验：最低受试者（病例数）为100例，是治疗作用初步评价阶段。其目的是初步评价药物对目标适应症患者的治疗作用和安全性，也包括为III期临床试验研究设计和给药剂量方案的确定提供依据。此阶段的研究设计可以根据具体的研究目的，采用多种形式，包括随机盲法对照临床试验。

III期临床试验：最低受试者（病例数）为300例，是治疗作用确证阶段。其目的是进一步验证药物对目标适应症患者的治疗作用和安全性，评价利益与风险关系，最终为药物注册申请的审查提供充分的依据。试验一般应为具有足够样本量的随机盲法对照试验。

IV期临床试验：最低受试者（病例数）为2000例，是新药上市后应用研究阶段。其目的是考察在广泛使用条件下的药物的疗效和不良反应，评价在普通或者特殊人群中使用的利益与风险关系以及改进给药剂量等。

生物等效性试验，是指用生物利用度研究的方法，以药代动力学参数为指标，比较同一种药物的相同或者不同剂型的制剂，在相同的试验条件下，其活性成份吸收程度和速度有无统计学差异的人体试验。

四、高通量筛选

糖尿病分为胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和非胰岛素依赖型(NIDDM)即2型糖尿病(2diabetes mellitus，2DM)，其中2型糖尿病占总数的9o％～95％。2型糖尿病是一种胰岛素抵抗伴胰岛素不足，或胰岛素分泌缺陷伴有或不伴有胰岛素抵抗而导致的慢性高血糖疾病。目前，2型糖尿病的药物治疗已经取得了一定进步，但疗效有限且很大程度上存在着毒副作用。因此，筛选出见效快且无毒副作用的新药是2型糖尿病治疗的首先任务。高通量药物筛选技术

(1ligh throughputscreening，HTS)是近年发展起来的一项新的药物发现技术，它结合自动化操作系统和微量灵敏的生物反应及检测系统，利用分子或细胞水平的药物筛选模型来评价化合物的生物活性，其筛选速度快、规模大、消耗量小、能实现一药多筛。现代生命科学的

发展使高通量技术在2型糖尿病药物筛选中的应用成为现实。

1、 2型糖尿病药物治疗现状

1．1、 2型糖尿病的西药治疗一葡萄糖苷酶抑制剂能有效抑制小肠上段的一葡萄糖苷酶的活性。从而减慢碳水化合物的消化和对葡萄糖的吸收，降低餐后血糖，对1型和2型糖尿病均适用?。其主要缺点是存在胃肠道的不良反应，目前已经上市的一葡萄糖苷酶抑制剂有：伏格列波糖(vogliboe)，阿卡波糖(acarbose)和米格列醇(migllto1)。促胰岛素分泌类药物能与胰岛B细胞上的特异性受体结合，关闭ATP敏感的钾通道，抑制K 外流，使胰岛B细胞去极化，Ca 通道打开，B细胞的Ca 浓度增加，从而促进胰岛素分泌。其主要不良影响是引起胃肠道反应、头痛和出现低血糖，目前已经上市的此类药物有瑞格列奈(repaglinide)和那格列奈(nateglinide)t2]。胰岛素增敏类药物可通过激活过氧化物酶增殖体活化受体一，增加胰岛素的敏感性，改善胰岛素抵抗和糖代谢，降低血浆游离脂肪酸。其主要副作用为消化道不良反应、低血糖和体重增加。目前已经上市的此类药物有曲格列酮(tro~itazone)、罗格列酮(siglitazone)、吡格列酮(piogli—tazone)、噻格列酮(ciglitazone)、恩格列酮(englitazone)，以及双胍类药物二甲双胍(meformin) 等。

药物筛选是新药发现的重要步骤，通过药物筛选，就可以使一些天然产物、人工合成化合物等被开发成新药，生命科学的不断发展为药物筛选提供了新的方法，高通量药物筛选技术就是在此基础上发展起来的高效快速的药物筛选新技术。它以分子或细胞水平模型为基础，采用计算机控制的自动化操作系统和灵敏快速的检测仪器，对数以万计的样品进行分析。由于采用体外实验方法，其分子机制明确。

用作高通量筛选的体外模型通常有分子水平模型和细胞水平的模型，分子水平模型主要分为受体模型、酶筛选模型和离子通道筛选模型。受体参与机体的各种生理和疾病过程，是药物作用的主要靶标之一，现在人们研究最多最成功的是G一蛋白偶联受体(GPCR) t6]，其次是酶和离子通道_l 。细胞水平药物筛选模型是以细胞功能为基础的筛选模型。除了能用于鉴定分子水平发现的化合物外，还着眼于细胞整体的某些功能和信号转移途径中的其它位点，在对每一个分子通路并不完全了解的情况下，细胞水平筛选是唯一可用的方法。由于2型糖尿病的发生与B细胞产生胰岛素，血液循环系统运送胰岛素以及靶细胞接受胰岛素并发挥生理作用这3个水平有密切联系，因此它们也是寻找2型糖尿病药物的依据。随着蛋白质组学、分子和细胞生物学的发展以及生物芯片技术的出现，越来越多与2型糖尿病相关的药靶基因被人们所发现，并把它克隆出来建立成稳定的分子或细胞水平筛选模型，利用高通量技术进行大规模高效率的药物筛选。

五、动物实验

实验动物：普通级，昆明种小鼠，体重18~22 g，雄性，由本校实验动物中心提供。

药品与仪器：全自动生化分析仪(日本岛津公司，7200型)。糖尿病治疗药物（由本校药物合成中心提供）。四氧嘧啶(Sigma公司，分析试剂)，临用前用生理盐水溶解，配制成1％溶液。盐酸肾上腺素(福州制药厂)。格列本脲(天津太平洋制药有限公司)。苯乙双胍(南通制药总厂)。葡萄糖氧化酶测定试剂盒(英国RanDOX公司)。

方法：

1.四氧嘧啶糖尿病小鼠

小鼠禁食22~-．24h，尾静脉注射新鲜配制的四氧嘧啶90 mg／kg，60 h后禁食12 h，于眼球后静脉丛采血测葡萄糖水平，选择空腹血糖15．4 mmol／L 以上并出现多饮、多食、消瘦者为糖尿病模型小鼠，分组时各组血糖平均值相差不大于0．55 mmol／L。

2.对正常小鼠血糖的影响

对禁食5 h的健康小鼠血糖的影响正常小鼠5O只随机分为5组，正常对照组生理盐水0．5 ml

灌胃，阳性对照组格列本脲50 mg／kg灌胃，其余3组治疗药3．5，7．0和14．0 g／kg分别灌胃，1／d×5。于末次给药前禁食2 h，末次给药后3 h眼眶后静脉丛采血测血糖含量。3.对禁食时间12 h健康小鼠血糖的影响

正常小鼠4O只随机分为4组，正常对照组生理盐水0．5 ml灌胃，阳性对照组格列本脲50 mg／kg灌胃，其余2组治疗药7．0和14．0 g／kg灌胃，1／d×5。于末次给药前禁食9 h，末次给药后3 h眼眶后静脉丛采血测血糖。

4.对肾上腺素性高血糖小鼠血糖的影响

对肾上腺素性高血糖小鼠血糖的影响正常小鼠6O只随机分为6组，正常对照组和肾上腺素模型对照组生理盐水0．5 ml灌胃，阳性对照组格列本脲50 mg／kg灌胃，其余3组分别治疗药3．5，7．0和14．0 g／kg灌胃，1／d×5。于末次给药前禁食10．5 h，末次给药后1 h，正常对照组生理盐水0．5 ml腹腔注射，其余各组肾上腺素0．18 mg／kg腹腔注射，注射后30 min眼眶后静脉丛采血测血糖。

5.对葡萄糖性高血糖小鼠血糖的影响

正常小鼠6O只随机分为6组，正常对照组和葡萄糖模型对照组生理盐水0．5 ml灌胃，阳性对照组格列本脲50 mg／kg灌胃，其余3组治疗药3．5，7．0和14．0 g／kg灌胃，1／d×5。于末次给药前禁食10．5h，末次给药后1 h，除正常对照组生理盐水0．5 ml腹腔注射，其余各组葡萄糖3 g／kg腹腔注射，注射后30 min眼眶后静脉丛采血测血糖。

6.对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影响

正常小鼠8O只，随机取1O只作为正常对照组，其余禁食22～24 h，四氧嘧啶生理盐水90 mg ／kg尾静脉注射，造成糖尿病模型，72 h后(禁食12 h)，取预测血糖>15．4 mmol／L的小鼠66只随机分5组，正常对照组及模型对照组生理盐水0．5 ml灌胃，阳性对照组苯乙双胍100 mg ／kg灌胃，其余3组治疗药3．5，7．0和14．0 g／kg灌胃，1／dX 5。于末次给药前禁食11 h，末次给药后1 h取血测血糖。

7.小鼠急性毒性试验(最大耐受量试验)

经预试得知糖脂平无法测出小鼠口服的LD 。，故改作一日内最大耐受量试验。试验方法：取小鼠2O只，雌雄各半。实验前禁食(不禁水)12 h，用1．375 g／ml糖脂平生药1 ml灌胃，2／dX 7，记录受试小鼠行为、活动、摄食量、体重、粪便、死亡等情况，未死亡小鼠于1周后处死进行尸检。

统计学处理数据以±s表示，组间差异采用t检验方法。